一種多功能克隆載體及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多功能克隆載體，其構(gòu)建方法是利用一種抗性基因表達(dá)自救方式直接用常規(guī)抗生素篩選陽性克隆子，包括以下步驟：首先設(shè)計一對具有5’端磷酸化引物序列，接著以PUC19質(zhì)粒為模版，使用高保真酶PCR擴(kuò)增得到多功能載體。使用本方法為得到的載體可以高效克隆各種PCR產(chǎn)物，對平末端PCR產(chǎn)物及普通Taq酶擴(kuò)增產(chǎn)物也有高效克隆效率，可以完全替代平末端克隆載體和TA克隆T載體。使用該方法制備多功能克隆載體，一般陽性率大于90%，有假陽性率低，實驗成本低，實驗操作環(huán)節(jié)少，方便快捷的優(yōu)點。本發(fā)明還公開了此種多功能克隆載體的使用方法。
【專利說明】一種多功能克隆載體及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多功能克隆載體，本發(fā)明還涉及該多功能克隆載體的構(gòu)建方法和使用方法，屬于基因工程中的克隆【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著大規(guī)模測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多物種的基因組序列被測定，為了進(jìn)一步對未知基因的功能進(jìn)行研究，需要對所研究的基因進(jìn)行克隆，為下一步的研究提供可能。因而高效的基因克隆技術(shù)應(yīng)用顯得尤為重要。常規(guī)的基因克隆技術(shù)，應(yīng)用含有限制性內(nèi)切酶識別序列的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并對所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理，并連接到相應(yīng)限制性內(nèi)切酶處理過的載體中，從而獲得保存該基因的載體。但這種方法步驟繁瑣，耗時長，且受基因序列和限制性內(nèi)切酶識別序列的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的第一個目的在于提供一種多功能克隆載體。
[0004]本發(fā)明的第二個目的在于提供一種多功能克隆載體的使用方法。
[0005]本發(fā)明的第一個目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
[0006]一種多功能克隆載體，其構(gòu)建步驟如下:
[0007]( I)設(shè)計一對具有5’端磷酸化引物序列如下:
[0008]F:5’-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA-3’
[0009]R:5’-TACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3’
[0010]所述引物5’端的第一個堿基為A或者G。
[0011](2) PCR 擴(kuò)增
[0012]以PUC19質(zhì)粒為模板，使用高保真酶PCR擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物，然后用DpnI內(nèi)切酶消化掉殘留的模板質(zhì)粒，膠純化得到的產(chǎn)物即為多功能克隆載體。
[0013]所述的PCR反應(yīng)體系及條件如下:
[0014]反應(yīng)體系設(shè)計為50 μ I總體系，具體是5 X PCR BuffeK緩沖液)6 μ 1，濃度為2.5mM的dNTPmix (脫氧核糖核苷三磷酸混合物)2 μ 1，濃度為IOmM的上下游引物各I μ 1，濃度為2U/μ I的Phusion DNA聚合酶0.3 μ I, DNA模板I μ I (約IOng),用滅菌水補足50 μ I體
系O
[0015]反應(yīng)條件為:95°C 3min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)98 °C IOs變性，52°C退火20s，72 °C延伸2min, 35個循環(huán)；PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸5min，然后16°C保存。
[0016]所述DpnI內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系和條件:
[0017]酶切反應(yīng)體系如下 :IOXBuffer4 μ I,DNA1.5 μ g,DpnI內(nèi)切酶1.5 μ I,滅菌去離子水補足到40 μ 10
[0018]反應(yīng)條件37 °C，Ihr。[0019]本發(fā)明的第二個目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
[0020]如前述的一種多功能克隆載體，它的使用方法包括以下步驟:
[0021](I)設(shè)計一對具有5’端磷酸化引物，并保證引物5’端的第一個堿基為A或者G;
[0022](2)在0.2ml的PCR反應(yīng)管中加入:目標(biāo)PCR片段X μ 1，濃度為20ng/μ I的vector I μ I, 2 X Reaction Buffer5 μ I, T4DNALigase (2u/ μ I) 0.5 μ I，無菌去離子水補足至Ij 10 μ I
[0023]輕輕彈動反應(yīng)管以混勻內(nèi)容物，短暫離心3-5秒；
[0024](3)將上述混合反應(yīng)液放置在22°C -30°C中反應(yīng)5分鐘,反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)管置于冰上，進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)；
[0025]當(dāng)插入片段長度大于2kb，可以將反應(yīng)時間延長至30分鐘。
[0026](4)轉(zhuǎn)化
[0027]a取部分連接產(chǎn)物加到50-100 μ I感受態(tài)細(xì)胞中(剛從冰箱里取出的感受態(tài)放于冰浴上約20分鐘解凍，待剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物的加入量不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一)，輕彈混勻，冰浴30分鐘。
[0028]b將離心管置于42°C恒溫45-60秒，取出管后立即置于冰浴中放置2分鐘，其間不
要搖動離心管。
[0029]c吸取全部的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加到含氨芐青霉素(氨芐青霉素終濃度100 μ g/ml)的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開；待平板表面干燥后，倒置平板，37°C培養(yǎng)12-16小時；
[0030](5)陽性克隆檢測
[0031]a快速菌落PCR檢測
[0032]挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測，按照下面反應(yīng)條件進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆子:95°C 3min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)94°C 30s變性，55 °C退火30s，25個循環(huán)，72 °C延伸Xs (IK/min)，PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸5min，然后4°C保存；
[0033]b測序鑒定:快速菌落方法進(jìn)行初步的鑒定后進(jìn)行DNA序列的測定；本載體PCR各鑒定和測序引物序列如下:
[0034]F5，-AGACAGATCGCTGAGATAGG-3，
[0035]R5’-CGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG-3’
[0036]本發(fā)明提出的一種，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果為:
[0037]I)本發(fā)明的使用方法應(yīng)用一種抗性基因表達(dá)自救方式直接用常規(guī)抗生素來篩選陽性克隆子，適用各種PCR產(chǎn)物直接連接，高保真酶和普通Taq酶擴(kuò)增產(chǎn)物直接與本載體連接，一般陽性克隆子大于90%，假陽性率較低，實驗成本低、實驗操作環(huán)節(jié)比傳統(tǒng)克隆方法少，方便、快捷。
[0038]2)本發(fā)明提到的多功能克隆載體的制備的方法為國際上率先提出的一種新型克隆載體的制備方法，利用連入DNA片段后，抗性基因得到恢復(fù)表達(dá)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性基因恢復(fù)表達(dá)的為陽性克隆，沒有DNA片段插入的載體，不能獲得抗生素基因的有效表達(dá)，從而大腸桿菌不能長出正常的單菌落。
[0039]3)本發(fā)明得到的載體可以高效克隆各種PCR產(chǎn)物，對平末端PCR產(chǎn)物(Pfu擴(kuò)增產(chǎn)物)顯示出高效的克隆效率，同時對普通Taq酶擴(kuò)增產(chǎn)物也有高效克隆效率，可以完全替代平末端克隆載體和TA克隆T載體。
[0040]4)使用本載體無需對抗生素基因復(fù)蘇，轉(zhuǎn)化后冰浴2min就可以立即涂板，比傳統(tǒng)使用傳統(tǒng)載體節(jié)約2小時時間。
[0041]5)使用本發(fā)明做成的試劑盒極大節(jié)約了試驗時間和操作環(huán)節(jié)，使科研效率得到大幅度提聞。
【具體實施方式】
[0042]實施例1
[0043]一種多功能克隆載體，其構(gòu)建步驟如下:
[0044]I)設(shè)計一對具有5’端磷酸化引物序列如下:
[0045]F:5’-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA-3’
[0046]R:5’-TACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3’
[0047]所述引物5’端的第一個堿基為A或者G。
[0048]2) PCR 擴(kuò)增
[0049]以PUC19質(zhì)粒為模板，使用高保真酶PCR擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物，然后用DpnI內(nèi)切酶消化掉殘留的模板質(zhì)粒，膠純化得到的產(chǎn)物即為多功能克隆載體。
[0050]其中所述的PCR反應(yīng)體系及條件如下:
[0051]反應(yīng)體系設(shè)計為50 μ I總體系，具體是5 X PCR BuffeK緩沖液)6 μ 1，濃度為2.5mM的dNTPmix (脫氧核糖核苷三磷酸混合物)2 μ 1，濃度為IOmM的上下游引物各I μ 1，濃度為2U/ μ I的Phusion DNA聚合酶0.3 μ I, DNA模板I μ I (約IOng),用滅菌水補足50 μ I體
系O
[0052]反應(yīng)條件為:95°C 3min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)98 °C IOs變性，52°C退火20s，72 °C延伸2min, 35個循環(huán)；PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸5min，然后16°C保存。
[0053]所述DpnI內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系和條件:
[0054]酶切反應(yīng)體系如下:10XBuffer4 μ I, DNA約1.5 μ g, DpnI內(nèi)切酶1.5 μ I,滅菌去離子水補足到40 μ I。
[0055]反應(yīng)條件37 °C，Ihr。
[0056]實施例2
[0057]載體的使用方法:
[0058]I引物設(shè)計要求
[0059]本載體對堿基有偏好性，設(shè)計引物時候一定保證引物5 ‘端的第一個堿基為A或者G；
[0060]2反應(yīng)體系的建立
[0061]按照下表的反應(yīng)體系在0.2ml的PCR管中加入各種成分:
【權(quán)利要求】
1.一種多功能克隆載體，其特征在于:其構(gòu)建方法如下， (1)設(shè)計一對具有5’端磷酸化引物序列如下:
F:5’-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA-3’
R:5’-TACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3’ 所述引物5’端的第一個堿基為A或者G ; (2)PCR擴(kuò)增 以PUC19質(zhì)粒為模板，使用高保真酶PCR擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物，然后用DpnI內(nèi)切酶消化掉殘留的模板質(zhì)粒，膠純化得到的產(chǎn)物即為多功能克隆載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多功能克隆載體，其特征在于:所述的PCR反應(yīng)體系及條件如下: 反應(yīng)體系設(shè)計為50 μ I總體系，具體是5XPCR Buffer6 μ 1，濃度為2.5mM的dNTPmix2y 1，濃度為IOmM的上下游引物各I μ 1，濃度為2U/μ I的Phusion DNA聚合酶0.3 μ 1，DNA模板I μ 1，用滅菌水補足50 μ I體系； 反應(yīng)條件為:95°C 3min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)98°C IOs變性，52°C退火20s，72°C延伸2min，35個循環(huán)；PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸5min，然后16°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種多功能克隆載體，其特征在于:所述DpnI內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系和條件如下: 酶切反應(yīng)體系:1OXBuffer4 μ 1,DNA1.5 μ g,DpnI內(nèi)切酶1.5 μ I,滅菌去離子水補足到40 μ I ； 反應(yīng)條件37 °C，Ihr。
4.一種權(quán)利要求1-3的多功能克隆載體的使用方法，它包括以下步驟: (1)設(shè)計一對具有5’端磷酸化引物，并保證引物5’端的第一個堿基為A或者G; (2)在0.2ml的PCR反應(yīng)管中加入:目標(biāo)PCR片段Χμ 1，濃度為20ng/μ I的vector 1 μ 1, 2 X Reaction Buf f er5 μ I, T4DNA Ligase (2u/ μ I) 0.5 μ I,無菌去離子水補足至1 10 μL 輕輕彈動反應(yīng)管以混勻內(nèi)容物，短暫離心3-5秒； (3)將上述混合反應(yīng)液放置在22°C-30°C中反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于冰上，進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)； 當(dāng)插入片段長度大于2kb，可以將反應(yīng)時間延長至30分鐘； (4)轉(zhuǎn)化 a取部分連接產(chǎn)物加到50-100 μ I感受態(tài)細(xì)胞中(剛從冰箱里取出的感受態(tài)放于冰浴上約20分鐘解凍，待剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物的加入量不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一)，輕彈混勻，冰浴30分鐘； b將離心管置于42°C恒溫45-60秒，取出管后立即置于冰浴中放置2分鐘，其間不要搖動離心管； c吸取全部的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加到含氨芐青霉素(氨芐青霉素終濃度100μ g/ml)的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開；待平板表面干燥后，倒置平板，37°C培養(yǎng)12-16小時； (5)陽性克隆檢測a快速菌落PCR檢測 挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測，按照下面反應(yīng)條件進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆子:95°C 3min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)940C 30s變性，55 °C退火30s，25個循環(huán)，72 °C延伸Xs (ΙΚ/min)，PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸5min，然后4°C保存； b測序鑒定:快速菌落方法進(jìn)行初步的鑒定后進(jìn)行DNA序列的測定；本載體PCR各鑒定和測序引物序列如下:
F5，-AGACAGATCGCTGAGATAGG-3，
R5’-CGTTAAGGGATT TTGGTCATGAG-3’ 。
【文檔編號】C12N15/70GK103757039SQ201310102710
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月27日
【發(fā)明者】張茂雷, 何東海, 郝曉燕, 康濤 申請人:廣州賽哲生物科技有限公司