專利名稱：一種快速檢測小鼠卵母細胞凋亡的方法
—種快速檢測小鼠卵母細胞凋亡的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)、生殖生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種簡單、快速檢測哺乳動物卵母細胞凋亡的方法。
背景技術(shù)：
在許多較低等的動物中，生物體為了保證其基因的延續(xù)，有足夠的后代存活下去，通常采取的一個機制就是排放出大量的精子和卵子，同時也就保證了較大數(shù)量新生幼體的產(chǎn)生，但這些幼體中只有極少部分能在殘酷的生存競爭中存活下來。而越是高等的動物，其保證后代存活率的機制就越是完備，從配子發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育直到幼體的哺育，所有這些進化上的高等之處，都保證了其生殖的成功率能達到最大，這樣也就無需產(chǎn)生大量的受精卵來維持種族延續(xù)。像人類及其它一些哺乳動物，每次只排放一枚或幾枚卵子，而且個體一生中所排卵的總數(shù)也很少。較之低等動物新生幼體在自然環(huán)境下的生存競爭，哺乳動物將這一競爭過程移到了體內(nèi)，最終能成功結(jié)合的精子和卵子都是經(jīng)過了重重篩選才得以脫穎而出。雌性哺乳動物一開始產(chǎn)生數(shù)量巨大的生殖細胞，但又并非所有的卵母細胞都生來平等，絕大多數(shù)生殖細胞的命運都是走向凋亡，凋亡是雌性配子發(fā)生過程中的一個必要機制，發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)原始生殖細胞遷移到未開始分化的胚胎生殖腺組織后，卵子發(fā)生開始啟動。此時被稱為卵原細胞的雌性生殖細胞，持續(xù)進行活躍的有絲分裂，不斷擴大生殖系的規(guī)模，直到進入減數(shù)分裂前期，卵原細胞停止增殖，進入卵母細胞階段。此時生殖細胞的數(shù)目急劇減少，絕大多數(shù)發(fā)生凋亡。存活的卵母細胞進行第一次減數(shù)分裂并在雙線期停滯，分化成初級卵母細胞。初級卵母細胞繼續(xù)發(fā)育，被來自卵巢壁的前顆粒細胞包圍，形成原始卵泡。初級卵母細胞將保持此狀態(tài)，從胚胎時期一直維持到青春期，期間卵母細胞仍在不斷死亡，約2/3會在出生前或剛出生時丟失。青春期開始后，初級卵母細胞分批次、階段性地恢復(fù)減數(shù)分裂，每次會有少量卵母細胞重新啟動發(fā)育程序，完成第一次減數(shù)分裂，成為次級卵母細胞，并停滯于第二次減數(shù)分裂的中期，等待排出受精。在人類，女性妊娠8周時卵原細胞開始增殖，20周左右達到峰值，由1000個左右迅速分裂到約680萬個，之后開始進入減數(shù)分裂。在由有絲分裂向減數(shù)分裂過渡時，細胞數(shù)目會急劇下降，大量丟失。新生兒出生時大約還有100 200萬個卵母細胞，到青春期開始時僅剩30 40萬。青春期開始后每月會有15 20個卵母 細胞啟動發(fā)育程序，但完成第一次減數(shù)分裂的卵母細胞通常只有I枚。在女性的生育年限內(nèi)，總共排卵大約400 500個左右，與峰值時的680萬個相t匕，凋亡比率超過了 99.9%。在其他哺乳動物的卵子發(fā)生中也存在相同的現(xiàn)象。豬的卵原細胞和卵母細胞在胎兒期高達數(shù)百萬個，其中的2/3在出生前退化死亡，仔豬出生時卵母細胞數(shù)量只有100萬個左右，初情期時還有10萬個，最終發(fā)育排出的不足I萬個，大多數(shù)發(fā)生了凋亡。
不論是體內(nèi)培養(yǎng)還是體外培養(yǎng)的胚胎，均可觀察到染色質(zhì)凝集、核膜破裂和核碎片等形態(tài)變化，表明胚胎發(fā)育過程中也存在凋亡。卵母細胞為尚未分裂的單細胞，而胚胎經(jīng)過卵裂后變?yōu)槎嗉毎?，二者凋亡情況有所不同。胚胎發(fā)育有著其特殊性，既存在細胞的不斷增殖，又存在細胞的不斷凋亡。大量的實驗表明，胚胎中凋亡的發(fā)動是受發(fā)育調(diào)控的，并且具有時期專一性，即凋亡一般發(fā)生在8-和16-cell期及以后，在4-cell期之前不會發(fā)生凋亡。這是由于早期胚胎基因轉(zhuǎn)錄活性活性很小，直到4-cell期末期至8-cell期時才開始大部分基因轉(zhuǎn)錄。體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)的胚胎，在桑椹期之前凋亡特征沒有顯著不同，但囊胚期出現(xiàn)差異，體外培養(yǎng)的胚胎內(nèi)細胞團表達更高的凋亡率。在小鼠胚胎發(fā)育中，第4d或第5d從子宮新鮮沖出的囊胚超過80%有一個或多個細胞的凋亡。此時胚胎細胞總數(shù)為50 90，雖然發(fā)生凋亡的胚胎數(shù)多，但每個胚胎凋亡細胞數(shù)很少，滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm, TE)不會超過2個，內(nèi)細胞群(inner cell mass,I CM)不會超過4個。并且一般說來，ICM細胞的凋亡率要高于TE細胞的凋亡率，這也許是ICM細胞數(shù)相對恒定的主要原因。在人的胚胎發(fā)育中，75%左右的囊胚(第6d)有一個到多個細胞發(fā)生凋亡，平均細胞數(shù)為65.6±2.1，凋亡的細胞數(shù)不會超過10個。與小鼠不同的是，人囊胚TE和ICM細胞凋亡率基本相同，都為7% 8%左右。在其他物種中，兔的胚胎比較特殊，其囊胚幾乎觀察不到凋亡，并且ICM細胞數(shù)不是保持相對恒定。F.Devreker和K.Hardy的實驗表明，凋亡率與胚胎總細胞數(shù)成一定的相關(guān)。無論是體內(nèi)培養(yǎng)還是體外培養(yǎng)的胚胎，在任一個特定時間胚胎細胞數(shù)波動范圍很大，例如小鼠1-cell期胚胎培養(yǎng)120h后，細胞數(shù)從28至113不等。細胞數(shù)少的胚胎，其凋亡率變化范圍較大，從很小到20%不等，細胞數(shù)多的胚胎，其凋亡率比較均一且一般不會超過5%。人囊胚中細胞數(shù)少的胚胎凋亡率從0% 30%不等，> 80個細胞的囊胚凋亡率則不會超過10%。胚胎凋亡中還有一個特別的現(xiàn)象，就是大多數(shù)凋亡的細胞同體細胞一樣會被吞噬清除，但有少數(shù)發(fā)育停滯的細胞會一直留存到囊胚期。已經(jīng)在人類和其他靈長類動物的囊胚腔及滋養(yǎng)層與透明帶之間的區(qū)域觀察到。它們形態(tài)變大，線粒體分化不良，缺少胞間連接和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，表明這些細胞源自卵裂的早期。至于為什么能留存到囊胚期而此前一直不被吞曬，Jurisicova等認為可能有兩個原因,一個是卵裂球不具備吞曬能力，另一個是植入前胚胎中的死細胞不表達引起臨近細胞吞噬作用的細胞表面分子，所以囊胚期前不會被吞噬。凋亡會造成細胞的死亡，但并不總是有害的。對多細胞生物體來說，凋亡能清除多余、擋道、突變和受損的細胞，使有機體能夠嚴格控制細胞數(shù)量和組織大小，并保護機體免受雜質(zhì)細胞對動態(tài)平衡的威脅，因而它同細胞分裂和細胞遷移同等重要，是生物有機體正常發(fā)育所必需的。凋亡機制在配子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。生殖細胞的凋亡是繁殖過程中正常發(fā)育的一部分，是繁殖過程保持動態(tài)平衡所必需的，盡管大多數(shù)生殖細胞都被清除，但保證了剩余生殖細胞的品質(zhì)優(yōu)良?？煽醋魇亲裱环N類似于達爾文進化論的機制，即適者生存。在胚胎發(fā)育中，凋亡可以去除卵裂球中發(fā)育停滯的細胞，使剩下的健康細胞繼續(xù)分裂，不至于因為某一個或幾個細胞的死亡而使整個胚胎壞死。囊胚由滋養(yǎng)外胚層(TE)和內(nèi)細胞團(ICM)兩部分構(gòu)成。早期胚胎的ICM細胞具有重新生成TE細胞和形成囊胚樣結(jié)構(gòu)的能力，而從后期的擴張囊胚中分離得到的ICM細胞則失去這一能力。Pierce等的實驗證明，為了減少胚層分化時TE不適當(dāng)?shù)漠愇槐磉_，凋亡清除了多余的具有形成TE潛能的ICM細胞。凋亡不僅對生殖細胞和胚胎發(fā)育起著重要作用，同時也是細胞對應(yīng)激和不適發(fā)育條件的應(yīng)答。
對卵母細胞和胚胎的凋亡開展研究，有助于把握胚胎發(fā)育的規(guī)律，從而有目的地調(diào)控凋亡，使其向著人類需要的方向發(fā)展，尤其是在體外培養(yǎng)過程中，通過對凋亡的抑制，可以獲得大量的優(yōu)良胚胎，加速動物育種進程，同時對臨床上治療不孕、衰老等疾病，提供理論和實驗依據(jù)。細胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征是細胞體積縮小、胞漿凝縮而不外漏，核染色質(zhì)固縮；而細胞壞死則表現(xiàn)為細胞腫脹，體積增大，或細胞破裂，胞漿外漏。但僅從形態(tài)來斷定細胞的凋亡程度是很難得到準確結(jié)果的。目前許多學(xué)者都使用了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的研究方法來研究細胞凋亡。先對細胞樣品進行常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察細胞形態(tài)，判定細胞是否凋亡，由于卵母細胞體積較大，采用形態(tài)法很難判定細胞是否凋亡。
本發(fā)明利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated5_triphosphste(dUTP)nick endlabling，TUNEL)染色方法，檢測小鼠卵母細胞體外培養(yǎng)成熟過程中的凋亡情況，這種方法簡單可靠。為獲得大量的優(yōu)良胚胎，加速動物育種進程提供技術(shù)支撐。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種小鼠卵母細胞凋亡的檢測方法。
本發(fā)明采用了改進的TUNEL法對成熟后小鼠卵母細胞的凋亡進行檢測，其主要步驟是用H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶是放在DNA片段標記之后，既可阻斷內(nèi)源性過氧化物酶與顯色底物DAB-H2O2反應(yīng)致使背底顏色過深，也可避免出現(xiàn)假陽性。
具體實施方式
1、用透明質(zhì)酸酶消化處理22h的小鼠卵母細胞后，將其置于96孔板中，每個孔中加入PBS-PVA洗3次，清洗5min ；
2、洗完后轉(zhuǎn)移到4%的多聚甲醛中，4°C固定過夜；
3、固定完后，清洗3次，將其轉(zhuǎn)入0.1% TritonX-1OO中透化40min ；
4、清洗3次后，在含有1% BSA的封閉液中孵育，4°C過夜；
5、清洗3次后，置于TUNEL工作液中，在38.5°C>5% CO2培養(yǎng)箱中孵育Ih ；
6、在DNA片段標記后，用0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫lOmin。
7、取出后清洗3次，轉(zhuǎn)移至PI中，避光染色lOmin，清洗3次后，在共聚焦顯微鏡下拍照。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提出了一種檢測小鼠卵母細胞凋亡的方法。
2.根據(jù)權(quán)利I要求，本發(fā)明主要采用了改進的TUNEL法對成熟后小鼠卵母細胞的凋亡進行檢測，其主要是用H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶是放在DNA片段標記之后，可阻斷內(nèi)源性過氧化物酶與顯色底物 DAB-H2O2反應(yīng)致使背底顏色過深，也可避免出現(xiàn)假陽性。
全文摘要
對卵母細胞和胚胎的凋亡開展研究，有助于把握胚胎發(fā)育的規(guī)律，從而有目的地調(diào)控凋亡，使其向著人類需要的方向發(fā)展。本發(fā)明提出了一種檢測小鼠卵母細胞凋亡的方法，采用了改進的TUNEL法對成熟后小鼠卵母細胞的凋亡進行檢測，為獲得大量的優(yōu)良胚胎在臨床上治療不孕、衰老等疾病，提供理論和實驗依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK103215353SQ20131010891
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者李向臣, 白春雨, 胡鵬飛, 趙玉華, 啜鵬群, 羅躍新, 關(guān)偉軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 哈爾濱體育學(xué)院