專利名稱：大豆小RNA基因gma-miR169d及其在干旱調(diào)控中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個大豆抗干旱大豆HiiCT0RNA基因gma-miR169d,及其在抗旱調(diào)控中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在生長過程中受到生物和非生物類的逆境脅迫，其中干旱是植物正常生長重要限制性因素之一。干旱會引起植物原生質(zhì)體脫水，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與透性，最終導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量降低。植物在干旱的過程中，通過關(guān)鍵基因的調(diào)控抵御或防衛(wèi)干旱帶來的不利影響。利用抗性基因資源改良植物的抗旱性，是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有效方法。植物對環(huán)境變化作出應(yīng)激反應(yīng)是基因水平調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控的共同結(jié)果。microRNA分子作為一類非編碼小分子，直接參與植物的生長、發(fā)育及對脅迫環(huán)境的耐受性。成熟的miRNA通過與祀mRNA的特定位點結(jié)合,引發(fā)mRNA的降解或抑制翻譯來介導(dǎo)作用革巴基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。microRNA作為細(xì)胞逆境應(yīng)答的激活因子出現(xiàn)，特異的回應(yīng)逆境脅迫。有研究指出玉米在鹽脅迫下，高粱在干旱脅迫下均涉及大量microRNAs表達(dá)水平改變。大豆受干旱脅迫的microRNA基因調(diào)控研究亦是增強(qiáng)或改善大豆抗逆的焦點。MiRNA169是對干旱產(chǎn)生應(yīng)答的一個重要小RNA，在大豆中共有21個家族成員。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在干旱處理條件下不同植物心TfVSP的表達(dá)具有差異。在水稻中，干旱處理下miR169g的表達(dá)下調(diào)，miR169gmiR169n是一個小RNA簇以串聯(lián)形式存在，兩者距離是3707bp。hniR169n(o)基因的上游有ABRE脫落酸響應(yīng)元件說明則TtV你可能受到ABA的調(diào)控。在干旱滲透脅迫下則7 故汝.通過脫水響應(yīng)元件DRE被誘導(dǎo)。NF-Y是一個可以和CCAAT box結(jié)合的一類蛋白復(fù)合體，是進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子。NF-Y核轉(zhuǎn)錄因子包括三個亞基，NF-YA，NF-YB，NF-YC，編碼亞基的基因包含一個進(jìn)化保守區(qū)域，負(fù)責(zé)和DNA結(jié)合。研究表明，番茄在受到干旱脅迫時Sly-miR169表達(dá)上調(diào)，所預(yù)測的三個靶基因(NF-YA1，NF-YA2,NF-YA3)的表達(dá)量明顯下降，超表達(dá)幻你c番茄植株的氣孔開放數(shù)量減少，降低了蒸騰作用葉片的水分損失率，抗干旱能力明顯增強(qiáng)。發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是提供一種大豆干旱調(diào)控相關(guān)的miciORNAs，大豆小RNA基因gma_miR169d。大豆小RNA基Mgma-miR169d,它包括堿基序列如序列表SEQ ID N0.1和/或2所不的基因。大豆小RNA基因例anTtV你￡/，它的堿基序列如序列表SEQ ID N0.3所示；
一種重組載體質(zhì)粒，它是在RNA表達(dá)載體中插入大豆小RNA基因gmaidR169d ；
所述的表達(dá)載體為pBASTA-RD，它是用多克隆位點接頭替換pEGAD載體中的EGFP(Ala)10基因序列構(gòu)建而成 ；
所述的表達(dá)載體為P35S-N0S，它是用化學(xué)合成的MCS序列替換HBT-sGFP (S65T) -NOS載體 PST I (3978)和 Hind 111(3025)酶切位點間的 C4ppdklZm_sGFP(S65T)序列構(gòu)建而成。
大豆小RNA基因gma-miR169d在生產(chǎn)耐旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了大豆小RNA基因gma_miR169d,它是利用Solexa測序技術(shù)獲得了的microRNAs,分析結(jié)果表明，大豆小RNA基因gma-miR169d與大豆干旱調(diào)控相關(guān)，將含有g(shù)ma-miR169d的成熟基因片段連接到載體上，并轉(zhuǎn)入擬南芥，通過抑制擬南芥細(xì)胞內(nèi)的靶基因的表達(dá)來進(jìn)一步提高擬南芥對干旱的耐受能力。解決了轉(zhuǎn)耐干旱基因操作涉及基因序列過長而遭遇轉(zhuǎn)化困難等問題，該類干旱誘導(dǎo)的miRCToNA為小分子表達(dá)調(diào)控基因，且為大豆內(nèi)源性microRNA,不編碼產(chǎn)生蛋白。


圖1 HBT-sGFP (S65T)-NOS 載體圖譜；
圖2 p35S-N0S載體圖譜；
圖3大豆原生質(zhì)共轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)水平分析圖；A組轉(zhuǎn)化p35S-N0S質(zhì)粒；B 組轉(zhuǎn)化 p35S-N0S-169d 質(zhì)粒；C 組轉(zhuǎn)化 HBT-sGFP (S65T)-NOS 質(zhì)粒；D 組轉(zhuǎn)化 HBT-sGFP (S65T)-N0S-NF-YA10 質(zhì)粒；E 組共轉(zhuǎn)化 p35S_N0S 和HBT-sGFP(S65T)-NOS ；F 組共轉(zhuǎn)化 p35S-N0S_169d 和 HBT-sGFP(S65T)-NOS ;G 組共轉(zhuǎn)化 P35S-N0S 和 HBT-sGFP (S65T)-N0S-NF-YA10 ；H 組共轉(zhuǎn)化 p35S-N0S_169d 和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YAIO0圖4 pBASTA-RD 載體圖譜；
圖5野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率對比；
圖6野生型和轉(zhuǎn)基因擬南 芥的葉片及根系生長狀況。
具體實施例方式本發(fā)明的前期研究結(jié)果顯示采用大豆品種吉育72水培幼苗作為實驗材料，在干旱誘導(dǎo)條件下，gma-miR169d表達(dá)水平增高。實施例1:gma_miR169d前體基因的克隆
以吉育72大S.品種(吉林省長春市新城大街2888號，郵編130118,吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)學(xué)院，王振民老師提供)為實驗對象，進(jìn)行水培。大豆種子使用滅菌蒸餾水清洗3次后，IX Hogland營養(yǎng)液水培，每2天更換一次培養(yǎng)液。設(shè)置對照組和處理組。待大豆培養(yǎng)至第2對復(fù)葉萌發(fā)后，處理組大豆使用2% PEG8000脅迫處理24h后，液氮冷凍材料，對照樣組和PEG8000處理組提取總RNA。將大豆葉片使用液氮研磨成粉末后，將100 mg葉片干粉用小藥匙轉(zhuǎn)移至RNase-free的eppendorf離心管中，并加入I ml RNAiso Plus (購買自Takara),搖勻后室溫靜置5 min,4°C、12000rpm離心5min,將清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入200ul氯仿后蓋緊離心管蓋，震蕩30 s，4°C U3000rpm離心5min，取上清，加入400 ul異丙醇，-20° C放置lh，4°C、13000rpm離心15min，沉淀用Iml 70%酒精洗滌2次，沉淀放超凈工作臺上吹干，用20 ul RNase-free水溶解，置于-80°C保存。總RNA反轉(zhuǎn)錄(BioTekesuper RT Kit購買自北京寶泰克生物技術(shù)有限公司)，得到的cDNA作為PCR模板。Gma-miR169d前體基因序列的PCR引物: miR169d Fl AGATTAGTGGATGTGAGCCAAG miR169d Rl TAAGAATAGTAAATAAGAACCPCR反應(yīng)條件和體系:
TaKaRa Ex Taq (5U/ul) 0.25ul ；10X Ex Taq Buffer 5ul ；dNTP Mixture (各2.5mM)4ul ;模板 cDNA 2.5ng ;引物 Fl( 10uM)2ul ;引物 Rl( 10uM)2ul ;滅菌蒸懼水 up to 50ul。95°C 5min ；95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s (30 Cycles) ；72°C 7min。將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物連接克隆載體(pEASY-Tl Simple Cloning Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，得載體pEASY-Tl-169d，酶切鑒定后測序(金唯智生物科技有限公司)。克隆的169d ill體序列如序列表SEQ ID N0.1 ; ill體序列表達(dá)的成熟序列如SEQ IDN0.2所示。實施例2:鑒定gma_miR169d對靶基因NF-YA10的調(diào)控作用 1.構(gòu)建gma-miR169d與靶基因NF-YAlO的相互作用載體
(I) gma-miR169d表達(dá)載體的構(gòu)建
用化學(xué)合成的 MCS 序列替換 HBT-sGFP (S65T) -NOS 載體 PST 1(3978)和 Hind III(3025)酶切位點間的C4ppdklZm-sGFP(S65T)序列，得到的重組載體命名為p35S_N0S (見附圖2)。將含有miR169d基因的序列進(jìn)行化學(xué)合成后插入P35S-N0S載體的BamH I和Xba I酶切位點間(委托金唯智生物科技有限公司完成)。將測序正確的載體命名為p35S-N0S-169d。合成的序列如序列表SEQ ID N0.3所示，其中包括SEQ ID N0.1序列及其在基因組中兩端的部分序列。(2)靶基因NF-YAlO表達(dá)載體的構(gòu)建
將含有與gma-miR169d作用位點的178bp長的部分NF-YAlO基因序列(NCBI:ACCESSION XM_003519062)進(jìn)行化學(xué)合成(委托金唯智生物科技有限公司完成)后，利用 BamH I 和 Nco I 酶切位點連接到 HBT-sGFP (S65T) -NOS 載體(NCBI: ACCESSIONEF090408 ;載體圖譜見附圖1)上，得到 靶基因表達(dá)載體HBT-sGFP(S65T)-N0S-NF-YA10。合成的靶基因NF-YAlO基因序列如序列表SEQ ID N0.4所示。3.大豆原生質(zhì)體細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)染
(I)大豆懸浮細(xì)胞系的建立:選擇粒大、飽滿、無霉病斑的種子，Cl2滅菌8小時后用無菌水浸泡3-4小時，取幼胚接于MS+2，4D (2mg/l)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷，每2周繼代一次。將誘導(dǎo)30天的愈傷懸浮于MS+2，4D (2mg/l)液體培養(yǎng)基中于搖床中暗培養(yǎng)(25°C )，轉(zhuǎn)速為100-110r/min,每周繼代一次。(2)原生質(zhì)體的制備:將培養(yǎng)好的懸浮細(xì)胞進(jìn)行收集后，利用含有2%纖維素酶與
0.4%離析酶的酶解液對大豆懸浮細(xì)胞進(jìn)行室溫酶解4小時，顯微鏡下監(jiān)測細(xì)胞壁裂解情況。用等量的W5溶液稀釋含有原生質(zhì)體的酶液，然后用75um的尼龍膜過濾含有原生質(zhì)體的酶解液。150g，2min離心沉淀原生質(zhì)體，顯微鏡下進(jìn)行血球計數(shù)板計數(shù)，W5溶液重懸，使細(xì)胞最終濃度在IO5個/ml。(3)轉(zhuǎn)染:每EP管體系中加入10 ug DNA, 100 ul原生質(zhì)體，110 ul 20%PEG4000,輕柔混合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物5-15分鐘。室溫下用400-440 ul W5溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，W5溶液懸浮清洗一次，用Iml WI溶液輕柔重懸原生質(zhì)體于多24孔板中。室溫下(20-25°C)誘導(dǎo)原生質(zhì)體18小時以上。本實驗共分8組，每組3個重復(fù)。A組轉(zhuǎn)化p35S-N0S質(zhì)粒；B組轉(zhuǎn)化p35S-N0S_169d質(zhì)粒；C組轉(zhuǎn)化HBT-sGFP (S65T) -NOS 質(zhì)粒；D 組轉(zhuǎn)化 HBT-sGFP (S65T) -NOS-NF-YAIO 質(zhì)粒；E 組共轉(zhuǎn)化P35S-N0S 和 HBT-sGFP (S65T) -NOS ；F 組共轉(zhuǎn)化 p35S-N0S_169d 和 HBT-sGFP (S65T) -NOS ；G 組共轉(zhuǎn)化 p35S-N0S 和 HBT-sGFP(S65T)-N0S-NF-YA10 ；H 組共轉(zhuǎn)化 p35S-N0S_169d 和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YAIO04.real-time PCR 檢測 gma_miR169d 及 NF-YA10 基因表達(dá)水平
分別提取A，B, C，D，E，F(xiàn)，G，H 8組轉(zhuǎn)染后大豆原生質(zhì)體細(xì)胞的total RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后對A，B實驗組中g(shù)ma-miR169d基因、C，D實驗組中NF-YA10基因和E，F(xiàn)，G，H實驗組中的GFP基因進(jìn)行表達(dá)分析。real-time PCR 引物:
gma-miR169d F2 5’ AGTGGATGTGAGCCAAGG 3’
R2 5’ AAGATTTTGCATGTGAGT 3’
NF-YAlOF3 5’ TTGTGACGAATTTTGTTTTG 3’
R3 5， ATGGCAGCCATTAGCATG 3，
GFPF4 5， CAGAAGAACGGCATCAAGGT 3，
R4 5’ CGGACTGGGTGCTCAGGTAG 3’
內(nèi)參 5SF5 5’ GCGTAGAGGAACCACACCAATC 3’ R5 5’ TGGCGCCGAGCTATTTTTC 3’
PCR反應(yīng)條件和體系為:12.5 ul SYBR premix Taq, 0.5 ul濃度為IOum的正向引物，
0.5 ul 濃度為 IOum 的反向引物,0.5 ul ROX reference Dye 11,2.0 ul cDNA 模版,9.0ul dH20。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30s，95°C變性5 s, 60°C延伸退火20 s, 40個循環(huán)。以5s rRNA為內(nèi)參，采用相對定量法計算gma_miR169d、NF-YAlO及GFP基因在大豆原生質(zhì)體中的表達(dá)水平，結(jié)果見附圖3。結(jié)果與分析:A組p35S-N0S空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和B組p35S-N0S_169d超表達(dá)169d質(zhì)粒轉(zhuǎn)化相比，B組gma-miR169d表達(dá)量明顯升高。C組HBT-sGFP (S65T)-NOS空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和D組HBT-sGFP (S65T) -NOS-NF-YAIO超表達(dá)NF-YAlO質(zhì)粒相比，D組NF-YAlO基因表達(dá)水平明顯升高。E組和F組，NF-YAlO基因表達(dá)水平相當(dāng)，分析原由，E組和F組中轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒中不具有miR169d的靶向作用位點，不對GFP基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。G組中NF-YAlO基因表達(dá)水平相對E組和F組有所降低，這是由于HBT-sGFP (S65T) -NOS-NF-YAIO質(zhì)粒中的GFP和NF-YAlO基因偶聯(lián)，內(nèi)源的miR169d對NF-YAlO靶向作用，從而影響了 GFP基因的表達(dá)水平。H組中NF-YAlO基因表達(dá)水平明顯降低，這主要是超表達(dá)的miR169d對NF-YAlO基因的靶向負(fù)調(diào)控作用所至，從而使NF-YAlO基因偶聯(lián)的GFP表達(dá)水平降低。實施例3 gma-miR169d的超表達(dá)載體的構(gòu)建
pBASTA-RD 載體(為 Eduado Blumwacd, Department of Plant Sciences, Universityof California惠贈)它是用多克隆位點接頭替換pEGAD載體中的EGFP (Ala)10基因序列構(gòu)建而成。pBASTA-RD載體圖譜見附圖4。通過常規(guī)分子生物學(xué)操作技術(shù)，利用BamH I和Xba I酶切位點將克隆的169d基因(序列如序列表SEQ ID N0.1)插入pBASTA-RD質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，將測序正確的克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證。構(gòu)建的植物超表達(dá)載體命名為pBASTA-RD-Gma-miR169d。取50 ul農(nóng)桿菌感受態(tài)(EHA105)加入I u g pBASTA-RD-gma_miR169d質(zhì)粒，熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，涂布抗性含有50 mg/L卡那霉素、25 mg/L利福平的YEP固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48 h。挑選平板上長出的單菌落接種到含有50 mg/L卡那霉素、25 mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，于試管28°C培養(yǎng)8-10 h,并利用菌液PCR鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果是否為陽性。實施例4轉(zhuǎn)gma_miR169d擬南芥植株的獲得
將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌接種于50 ml含有50 mg/L卡那霉素、25 mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)后全部轉(zhuǎn)移至I L含有50 mg/L卡那霉素、25 mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中28°C過夜培養(yǎng)20-22 h,培養(yǎng)至0D590到1.0-1.2，菌液用4000 rpm，20度離心 15min。用每L含有 l/2MS+5%蔗糖、1000XB5 維生素 lml，lmg/ml6_BA 10 uL, silwet-77200 uL的培養(yǎng)液調(diào)整菌液0D590到0.8-0.9，將抽薹后剛開花的擬南芥向下浸入菌液侵染7分鐘后，橫置并用保鮮膜密封且避光放置48h后，改在正常生長條件下直立培養(yǎng)。侵染15-20天后，隔天收獲發(fā)黃的成熟莢。收獲的種子利用含有10 mg/L的草銨膦培養(yǎng)皿篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥。根據(jù)孟德爾基因分離定律的3:1分離關(guān)系，重復(fù)篩選，直至T 3代可獲得轉(zhuǎn)gma-miR169d基因擬南芥的純和株系。并利用PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行分子檢測。實施例5:轉(zhuǎn)基因植株耐干旱脅迫能力的鑒定
為了鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥耐干旱脅迫的能力，采用MS+15%蔗糖+PEG8000 (2%、3%、4%、5%)的模擬不同干旱程度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥對比野生型擬南芥的葉片、根系生長狀況及發(fā)芽率變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥在含2%、3%、4%、5%PEG8000的培養(yǎng)基條件下發(fā)芽率分別為96%，95.5%，92%，93%，對應(yīng)野生型擬南芥的發(fā)芽率分別為93%，93 %，91 %，90.5 %，結(jié)果見附圖5?？梢?，擬南芥在超表達(dá)gm a-miR169d基因前后，發(fā)芽率均大于90%，始終保持高發(fā)芽率狀態(tài)。此外，在正常生長條件下，野生型擬南芥和超表達(dá)gma-miR169d基因擬南芥植株并無明顯生長差異，但隨PEG 8000濃度的增加，野生型擬南芥逐漸表現(xiàn)出葉片萎蔫的狀態(tài)。在5%的PEG 8000脅迫環(huán)境中培養(yǎng)7天后，超表達(dá)gma-miR169d基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比葉片生長狀態(tài)稍好，根系數(shù)較多，轉(zhuǎn)基因植株失水率為8.5%。而野生型植株葉片顯得枯黃，根系數(shù)少，失水率為12%，結(jié)果見附圖6。由此推斷，超表達(dá)miR169d基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株相比野生型植株干旱耐受性升高。
權(quán)利要求
1.大 小RNA基因gma-miR169d,它包括喊基序列如序列表SEQID N0.1和/或2所不的基因。
2.大 小RNA基因gtna-1niR169d，它的喊基序列如序列表SEQID N0.3所不。
3.一種重組載體，它是在RNA表達(dá)載體中插入大豆小RNA基因gtm-miR169d。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組載體，其特征在于:所述的表達(dá)載體為pBASTA-RD，它是用多克隆位點接頭替換PEGAD載體中的EGFP (Ala)10基因序列構(gòu)建而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組載體，其特征在于:所述的表達(dá)載體為P35S-N0S，它是用化學(xué)合成的 MCS 序列替換 HBT-sGFP (S65T)-NOS 載體 PST I (3978)和 Hind 111(3025)酶切位點間的C4ppdklZm-sGFP(S65T)序列構(gòu)建而成。
6.大豆小RNA基因g tm-miR169d在生產(chǎn)耐旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了大豆小RNA基因gma-miR169d，它是利用Solexa測序技術(shù)獲得了的microRNAs，分析結(jié)果表明，豆小RNA基因gma-miR169d與大豆干旱調(diào)控相關(guān)，將含有g(shù)ma-miR169d的成熟基因片段連接到載體上，并轉(zhuǎn)入擬南芥，通過抑制擬南芥細(xì)胞內(nèi)的靶基因的表達(dá)來進(jìn)一步提高擬南芥對干旱的耐受能力。解決了轉(zhuǎn)耐干旱基因操作涉及基因序列過長而遭遇轉(zhuǎn)化困難等問題，該類干旱誘導(dǎo)的miRcroNA為小分子表達(dá)調(diào)控基因，且為大豆內(nèi)源性microRNA，不編碼產(chǎn)生蛋白。
文檔編號C12N15/82GK103194449SQ20131010891
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者李海燕, 董園園, 尹海龍, 劉偉燦, 王法微, 陳歡, 王南, 周穎, 周永剛, 趙利旦 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)