一種鑒別羅漢果性別的scar分子標記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，具體涉及一種用PCR鑒定羅漢果的雌雄的方法，具體提供了羅漢果雄株的特異DNA片段序列，及PCR引物的設計，PCR條件的優(yōu)化等。
【專利說明】—種鑒別羅漢果性別的SCAR分子標記

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，具體涉及一種鑒別羅漢果性別的SCAR分子標記的分離和確定。

【背景技術】
[0002]羅漢果是一種名貴藥材。中醫(yī)藥學認為，羅漢果甘、酸，性涼，有清熱涼血、生津止咳、滑腸排毒、嫩膚益顏、潤肺化痰等功效。
[0003]羅漢果為雌雄異株植物，其雌株與雄株的形態(tài)特征肉眼無法識別，只能等到開花時才能分辨雌雄。目前實際生產(chǎn)上應用的種苗，來源幾乎都是雌株的扦插苗或者組培擴繁苗，很少使用種子繁殖的實生苗。扦插或組織培養(yǎng)優(yōu)點是操作比較簡便、見效快，但田地、人工、培養(yǎng)基等成本還是相對較高。而且由于現(xiàn)在這種大量無性繁殖的應用，使得種苗質(zhì)量下降，多感染病毒及其它病害。種苗生長勢弱、根系不發(fā)達、種植成活率低，成活后也多由于病毒和線蟲等病蟲害的發(fā)作，造成大量死苗、減產(chǎn)。另外過多的無性繁殖，還使得羅漢果作為我國一個稀有藥用植物來說，品種愈來愈單一。相比較來說，用種子繁殖可以克服上述缺點。種子繁殖的實生苗，沒有病毒病害感染，根系更加發(fā)達，植株生長健壯，產(chǎn)量更聞。物育種上，如果能夠在幼苗期間鑒定雌雄，就可使用較多數(shù)量的實生苗作為選擇的對象，其育種選優(yōu)率就可大大提高，而且選擇越早育種效率越高。
[0004]性別的早期識別對于實際生產(chǎn)中性別的調(diào)控更具意義，生產(chǎn)上需要大量種植雌株，但羅漢果種子中70%以上為雄株。所以生產(chǎn)時需要大量種植，等到開花后再把雄株人工拔去。除了占用田地外，還很費人工。對羅漢果得育種和優(yōu)良品種的推廣造成很大困難。如果能在幼苗階段鑒定雌雄，可以大大減少成本。
[0005]應用本發(fā)明所用方法，可以在早期對羅漢果幼苗進行雌雄株鑒定，有針對性的進行實生苗生產(chǎn)，降低種苗生產(chǎn)等成本，提高種苗質(zhì)量。是進行優(yōu)質(zhì)羅漢果種苗生產(chǎn)不可缺少的技術手段。
[0006]目前植物雌雄鑒定的方法有四種；1.通過外部形態(tài)特征鑒別；2.通過生理代謝差異鑒別；3.通過化學物質(zhì)分析鑒別；4.通過RAH)標記鑒別雌雄株。雌雄異株植物在幼苗期難以從外部形態(tài)來預測性別，因此能進行性別的早期鑒定的可靠指標主要依賴于其內(nèi)部遺傳類型或生理生化來鑒別。
[0007]目前隨機擴增多態(tài)性 DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)標記已廣泛用于雌雄異株植物的性別鑒別研究中。秦新民等對羅漢果基因組DNA的RAPD分析結果表明，部分引物PCR擴增時雌雄株間具有多態(tài)性。并已用此種方法，獲得了幾個與雌雄相關的標記片段，表明了羅漢果可能存在性染色體，或者這些標記是與性別決定基因緊密連鎖的。我們創(chuàng)造性地在隨機引物序列中加入簡并堿基，擴增得到了一個雄株特異片段。但由于RAPD標記不夠穩(wěn)定，本發(fā)明設計了一系列實驗擬將RAPD標記轉化為序列特異性擴增區(qū)(Sequence-characterized Amplified Reg1n, SCAR)標記，以便盡快應用于羅漢果早期性別的鑒定研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種能鑒定羅漢果雌雄株的SCAR分子標記。
[0009]本發(fā)明以羅漢果雌雄株葉片為材料，用10個隨機引物進行篩選，擴增反應體系及反應程序參照陳其軍等人(陳其軍，韓玉珍，傅永福，等.大麻性別的RAPD和SCAR分子標記[J] ?植物生理學報，2001，27( 2): 173- 178.)的方法。其中引物P7擴增得到I條雄株特異性片段。將這條差異片段回收、克隆及測序，獲得的序列長度為1216bp，將其命名為Z-1200，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010]提取羅漢果雌株和雄株的基因組DNA，根據(jù)上述Z-1200所述的核苷酸序列，設計系列引物進一步確定精確的SCAR標記。設計第一套引物Z1200-F1和Z1200-R1，所述引物序列如SEQ ID N03、4所示。結果發(fā)現(xiàn)，用第一套SCAR標記引物進行擴增，得到的擴增結果，在羅漢果雌株和雄株間有差異。從瓊脂糖凝膠電泳分析結果可以看到:第一套SCAR標記引物Z1200-F1弓丨物與Z1200-R1，擴增羅漢果基因組DNA時，所有雄株可以擴增得到648bp的目的條帶。但雌雄株都可以擴增得到一背景條帶，此條帶比648bp目的條帶略小。
[0011]為分析背景條帶與目的條帶間的差異，本發(fā)明在PCR擴增后、分別回收了雌雄株所擴增得到的各條帶片段，克隆到T載體進行測序，并對結果進行分析。通過DNAMAN進行序列比對，結果是上述PCR中的目的條帶與背景條帶相比較，大部分序列相同，只是中間部分多出了 93堿基，如SEQ ID N0:5所示。因此，此序列才是雄株特異片段，確定此段序列是用于SCAR標記的目的片段。
[0012]根據(jù)上述實驗結果，設計第二套SCAR標記引物，Z1200-F2和Z1200-R2。所述引物序列如SEQ ID N05、6所示。擴增羅漢果基因組DNA時，所有雄株可以擴增得到811bp的目的條帶，條帶單一、大小正確、沒有背景條帶干擾。
[0013]為了驗證第二套SCAR標記引物，在鑒定羅漢果雌雄株方面的可靠性。我們隨機從田間選取了一些已經(jīng)開花的樣品，編號后帶回實驗室。用此對引物進行雌雄株的PCR鑒定。結果是，用此引物鑒定雌雄株，結果正確帶單一，結果正確、實驗結果穩(wěn)定、可靠。
[0014]上述結果表明，雄株所特有的93bp序列，即SEQ ID NO:2為羅漢果雄株特異的SCAR分子標記。
[0015]本發(fā)明的具體技術路線如圖1所示。
[0016]本發(fā)明所提供的SCAR標記對于羅漢果的批量產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有重大意義。
[0017]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明技術路線圖。
[0019]圖2是用隨機引物P7分別對羅漢果雌雄株進行擴增的結果，圖中從左向右依次為:1-5泳道為雌性二倍體羅漢果，6-9泳道為雄性二倍體羅漢果，10-11泳道為雌性三倍體羅漢果，12泳道為雄性三倍體羅漢果，13泳道為Marker (條帶自大到小依次為:5000bp ；3000bp ；2000bp ；100bp ；750bp ；500bp ；250bp ；100bp),圖中箭頭所指，即為特異條帶擴增目的片段，大小約為1200bp。
[0020]圖3是Z1200-F1引物與Z1200-R1引物擴增羅漢果基因組DNA結果電泳圖，擴增目的片段大小為648bp，圖中從左向右依次為:1- 7泳道為雌性單株；8-11泳道為雄性單株；12泳道為水負對照；13泳道為Marker。
[0021]圖4是Z1200-F2引物與Z1200-R2引物，擴增羅漢果基因組DNA結果瓊脂糖凝膠電泳圖，擴增目的片段大小為811bp，圖中從左向右一次為:1- 7泳道為雌性單株；8-11泳道為雄性單株；12泳道為水負對照；13泳道為Marker。
[0022]圖5為SCAR標記引物Z1200-F2和Z120-R2對田間隨機樣品的雌雄鑒定結果。
[0023]發(fā)明詳細描述
下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0024]本文提到的所有參考文獻都通過引用并入本文。
[0025]除非有相反指明，本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術是本領域普通技術人員公知的標準技術。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。
[0026]本發(fā)明提出了一種鑒別羅漢果雌雄株的SCAR分子標記，其特征在于所述SCAR分子標記的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，所述SCAR標記的5’端基因組核苷酸序列如SEQID NO: 2的第1-249位的核苷酸所示，所述SCAR標記的3’端基因組核苷酸序列如SEQ IDNO: 2的第343-1216位的核苷酸所示，SEQ ID NO: 2的第250-342位核苷酸序列為本發(fā)明所提供的SCAR分子標記。在本發(fā)明中，所述SCAR分子標記也可以稱為羅漢果雄株特異性序列、或雄株特異性序列 、或雄株特異性核苷酸序列。
[0027]本發(fā)明提出了一組用于區(qū)分羅漢果雌雄株的PCR引物，其中，該一組PCR引物包含第一 PCR引物和第二 PCR引物，其中第一 PCR引物包含SEQ ID NO: 2中非SCAR標記部分的任何部分的至少11個或更多個連續(xù)多核苷酸，第二PCR引物來自SEQ ID N0:2中的SCAR標記部分或是SEQ ID NO: 5所示的至少11個或更多個連續(xù)多核苷酸，該一組PCR引物在一起進行PCR擴增時是有效的。或是第一引物來自SEQ ID NO:2中SCAR分子標記的5’端核苷酸序列部分的的至少11個或更多個連續(xù)多核苷酸，第二引物來自SEQ ID NO: 2中SCAR分子標記的3’端核苷酸序列部分的的至少11個或更多個連續(xù)多核苷酸，該一組PCR引物在一起進行PCR擴增時是有效的，并且所述引物組在擴增來自羅漢果雌雄株的基因組DNA時，雄株的基因組DNA所擴出的擴增子片段比雌株基因組DNA所擴出的擴增子片段大93個bp。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的實施例，用于區(qū)分羅漢果雌雄株的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID N0:3或4所示，或如SEQ ID N0:6或7所示。
[0029]本領域技術人員應該知曉，通過基因組測序技術，從而獲得本發(fā)明所保護的SCAR分子標記的5’上游或3’下游更長的基因組核苷酸序列，并根據(jù)該核苷酸序列設計引物進行羅漢果雌雄株鑒定的方法和引物均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。
[0030]在本文中所使用的術語“引物”是分離的多核酸，其通過核酸雜交與互補的目標多核酸鏈退火形成引物和目標多核酸鏈的雜交體，然后通過聚合酶，例如DNA聚合酶沿目標多核酸鏈延伸。本發(fā)明的引物對涉及它們用于擴增目標多核苷酸分子的擴增的用途，例如，通過聚合酶鏈式反應(PCR)或其他常規(guī)的核酸擴增方法。
[0031]本發(fā)明還提出了一種區(qū)分羅漢果雌雄株的PCR方法，其特征在于所述PCR方法所獲得的羅漢果雄株的擴增產(chǎn)物包含部分或全部的如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。更具體的，所述PCR方法包括以下步驟:a)提取羅漢果幼苗的基因組DNA ；
b)設計引物，所述引物可以特異性擴增出羅漢果雄株所特有的部分或全部序列；c)進行PCR擴增反應，獲得PCR擴增產(chǎn)物；d)檢測所述PCR擴增產(chǎn)物；其特征在于，所述PCR方法所用的引物組如上所述。
[0032]在本發(fā)明中，“PCR擴增產(chǎn)物”也可以表述為“擴增子”，術語“擴增子”的使用要特別排除可在DNA熱擴增反應中形成的引物二聚物。所述的“區(qū)分”指把羅漢果雌株和雄株區(qū)分開來，或是鑒定出羅漢果雌株或雄株。
[0033]本發(fā)明還提出了一種用于鑒定羅漢果雌雄株的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包含有上述引物。
[0034]本發(fā)明還提出了一種用于區(qū)分羅漢果雌雄株的核苷酸探針，其特征在于，所述探針選自SEQ ID N0:5或與其互補的部分連續(xù)核苷酸序列，可以在嚴謹雜交條件下特異性檢測出羅漢果雄株基因組中的特異SCAR分子標記。
[0035]本發(fā)明還提供了一種區(qū)分羅漢果雌雄株的方法，所述方法包括將包含DNA的樣品與多核苷酸探針接觸，所述多核苷酸探針在嚴謹雜交條件下，可以特異性鑒定出羅漢果雌株和雄株，其特征在于，所述探針選自SEQ ID N0:5或與其互補的部分連續(xù)核苷酸序列。
[0036]本發(fā)明上述所提出的羅漢果雄株特異的SCAR分子標記、羅漢果雌雄株鑒定方法、DNA引物、核苷酸探針或試劑盒等，在無毒羅漢果種苗的生產(chǎn)中的具有重要的應用價值。

【具體實施方式】
[0037]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《分子克隆》。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術有限公司合成，測序由北京華大基因研究中心完成，膠回收使用OMEGA B1-TEK公司的Gel Extract1n Kit (D2500-01)，克隆使用TIANGEN公司的pGM-T Easy,方法均參照試劑盒提供的方法進行。
[0038]實施例1.隨機弓丨物P7對羅漢果不同雌雄株的RAPD標記
本發(fā)明先以羅漢果雌雄株葉片為材料，提取基因組DNA，并用10個隨機引物進行擴增多態(tài)性篩選，擴增反應體系及反應程序參照陳其軍等人(陳其軍，韓玉珍，傅永福，等.大麻性別的RAPD和SCAR分子標記[J].植物生理學報，2001，27 ( 2): 173-178.)的方法。實驗結果發(fā)現(xiàn)，其中一條隨機引物P7擴增得到了 I條羅漢果雄株特異性片段。將這條差異片段回收、克隆及進行測序分析，獲得一條長度為1216bp的核苷酸序列，將其命名為Z-1200，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0039]其中，用隨機引物P7對5個二倍體雌株、4個二倍體雄株、2個三倍體雌株和I個三倍體雄株的基因組DNA進行擴增，并將其擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析的結果如圖2所示，所有的羅漢果雄株(泳道6-9為雄性二倍體羅漢果，泳道12為雄性三倍體羅漢果)都擴增獲得了一條大小約為1.2kb的雄株特有多態(tài)性片段；而所有的羅漢果雌株(1-5泳道為雌性二倍體羅漢果，10-11泳道為雌性三倍體羅漢果)都未檢測到這一多態(tài)性片段，圖中箭頭所指，即為特異條帶擴增片段。
[0040]本實施例中羅漢果基因組DNA的提取方法為CTAB法，具體方法及步驟如下:
O取一嫩葉片在液氮中研成粉末；
2)將樣品放入液氮凍過的EP管中，加65°C預熱2XCTAB Iml ；3)65°C水浴 Ih ；
4)加入等體積的酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提,離心1000rpm, 1min,取上清；
5)加入等體積異丙醇，_2(TC沉淀20-30min；
6)1000rpm離心1min,倒掉上清,70%乙醇，1000rpm, 1min,倒掉上清,晾干；
7)加50ul RNase- H20 水溶解，37°C 20min 消化 RNA,放 _20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0041]以上述提取的基因組DNA作為模板，用隨機引物P7按以下PCR擴增體系進行擴增，所述P7引物的核苷酸序列是5’ ANTCCNAAAT 3’(SEQ ID NO:1)，PCR擴增體系如下:
1Xbuffer 2 ul dNTP0.4ul
P7Iul
Taq0.4ul
DNA3ul
水13.2ul

20ul
PCR 擴增程序是:95°C,3min ；94°C,30sec ;32_45°C，60sec ；72°C,90sec ；30 個循環(huán)，72°C，10min，4°C 保存。
[0042]實施例2.羅漢果雌雄株特異性SCAR標記的確定
為了將RAPD標記轉化為更加精確的SCAR標記，發(fā)明人依據(jù)上述羅漢果雄株特異片段Z-1200(SEQ ID NO:2)，根據(jù)其核苷酸序列在其兩端設計新的引物對，以特異擴增此片段。所述Z-1200的擴增引物如下:
Z1200-F1: 5’ AGAAACTAATAATGAATTACCACTG 3’ (SEQ ID NO:3);
Z1200-R1: 5’ CAAGTTTTTGGATATAGTGGTAGTT 3’ (SEQ ID NO:4)。
[0043]以11個不同羅漢果雌雄株的基因組DNA作為模板，用引物Z1200-F1和Z1200-R1按以下PCR擴增體系進行擴增。
[0044]PCR擴增體系:
水13.2ul
1Xbuffer 2 ul dNTP0.4ul
Z1200-F1 0.5ul Z1200-R1 0.5ul Taq0.4ul
DNA3ul
PCR 擴增程序是:95°C,3min ；94°C,30sec ；58°C,20sec ；72°C 45sec ；30 個循環(huán)，72°C，10min，4°C 保存。
[0045]將上述PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，結果如圖3所示，所有雄株(泳道8-11)和雌株(泳道1-7)都擴增獲得了一個同樣大小的片段(背景條帶)，此外，雄株還擴增獲得了一個大一點的雄株特異性片段(目的條帶)。
[0046]為分析背景條帶與目的條帶間的差異，本發(fā)明分別回收了雌雄株的目的條帶和背景條帶，克隆到T載體上進行測序分析，結果發(fā)現(xiàn):上述PCR中的雄株特異性片段(目的條帶)為648bp，用DNAMAN進行序列比對，發(fā)現(xiàn)PCR中的648bp的目的條帶與背景條帶相比較，大部分序列相同，只是中間部分多出了 93個堿基，這93個堿基的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0047]為進一步確定SEQ ID NO: 5是否為羅漢果雄株的特異SCAR分子標記，本發(fā)明根據(jù)這一雄株特異序列，進一步設計引物。由于此序列較短，不適宜在其內(nèi)部設計PCR擴增的引物對來單獨鑒定雌雄株，因此在設計引物時，一條引物設計在此段特異序列中，另外一條引物則設計在其下游，具體引物序列如下所示:
Z1200-F2:5，GAGTTCAAACAAGGTCGGGGTGGGA 3，(SEQ ID NO:6),
Z1200-R2:5’ GCTAAATTCCACCGCTTGCTTGCTC 3’(SEQ ID NO:7)。
[0048]用上述引物對分別擴增羅漢果雌雄單株的基因組DNA時，其擴增結果與預期相符，所有雄株可以擴增得到特異片段，而雌株沒有。具體結果如圖4所示，所有羅漢果雌株(泳道1-7)均沒有檢測出擴增片段，而所有羅漢果雄株(泳道8-11)都獲得了特異性的擴增片段。
[0049]上述結果上面在進行PCR擴增時，雌株由于缺少上述的93bp核苷酸序列，因此不能擴增出條帶，而雄株則可以擴增得到一個Sllbp的特異性片段。
[0050]實施例3.田間隨機取樣的雌雄鑒定
隨機選取田間已經(jīng)開花的26個株系作為鑒定樣品，其中樣品編號為10、11、13、14、20、22、23、24、25的為雄株，其余為雌株。提取基因組DNA，用SCAR標記引物Z1200-F2和Z120-R2對其進行鑒定，具體方法同上，PCR電泳結果如圖5所示:圖中標注編號即為樣品編號，編號為10、11、13、14、20、22、23、24、25的擴增到了大小為811bp條帶，
PCR結果與實際雌雄狀況相符，所有雄株都可以擴增的到目的條帶，而雌株則沒有擴增產(chǎn)物，進一步確定此方法可以用來鑒定羅漢果幼苗的雌雄鑒定。
【權利要求】
1.一種區(qū)分羅漢果雌雄株的方法，其特征在于:所述方法包括利用羅漢果雄株所特有的SCAR分子標記進行鑒定。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的SCAR分子標記的核苷酸序列如SEQID N0:5所/Jn ο
3.—種區(qū)分羅漢果雌雄株的PCR方法，其特征在于所述PCR方法所獲得的羅漢果雄株的擴增產(chǎn)物包含部分或全部的如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
4.一種區(qū)分羅漢果雌雄株的方法，所述方法包括以下步驟: a)提取羅漢果的基因組DNA; b)設計引物，所述引物可以特異性擴增出羅漢果雄株所特有的部分或全部序列； c)進行PCR擴增反應，獲得PCR擴增產(chǎn)物； d)檢測所述PCR擴增產(chǎn)物； 其特征在于，所述引物的核苷酸序列選自SEQ ID N0:5或2或與其互補的核苷酸序列。
5.一種區(qū)分羅漢果雌雄株的方法，所述方法包括將包含DNA的樣品與多核苷酸探針接觸，所述多核苷酸探針在嚴謹雜交條件下，可以特異性鑒定出羅漢果雌株和雄株，其特征在于，所述探針選自SEQ ID N0:5所示的部分序列。
6.一種鑒定羅漢果雌雄株的DNA引物，其特征在于，所述引物選自SEQ ID N0:5或2或與其互補的核苷酸序列。
7.權利要求6所述的DNA引物，其中所述的引物如SEQID N0:6或7所示。
8.一種鑒定羅漢果雌雄株的核苷酸探針，其特征在于，所述探針選自SEQ ID N0:5或與其互補的核苷酸序列。
9.一種用于檢測羅漢果雌雄株的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求6或7所述的引物。
10.一種鑒別羅漢果雌雄株的SCAR分子標記，其特征在于所述SCAR分子標記的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
11.權利要求1-2之任一所述的鑒定方法、權利要求3所述的PCR方法、權利要求4所述的方法、權利要求5所述的方法、權利要求6-7之任一所述的DNA引物、權利要求8所述的核苷酸探針、權利要求9所述的試劑盒、或權利要求10所述的SCAR分子標記在無毒羅漢果種苗生產(chǎn)中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073550SQ201310108992
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權日:2013年3月29日
【發(fā)明者】張會新, 張繼賢 申請人:北京泰朗嘉懋科技發(fā)展有限公司