專利名稱：一種用細(xì)胞色素P450clTct酶基因遺傳多態(tài)性預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的分子生物學(xué)方法。適合于優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員在基因水平上的早期選材，屬于體育科學(xué)與分子生物學(xué)交叉的學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代競(jìng)技運(yùn)動(dòng)的迅速發(fā)展和選材育材的科學(xué)化進(jìn)程，運(yùn)動(dòng)員的身體形態(tài)特征對(duì)運(yùn)動(dòng)成績(jī)的影響逐漸受到重視。身高是評(píng)價(jià)體格發(fā)育的重要項(xiàng)目，也是反映骨骼系統(tǒng)增長(zhǎng)的常用指標(biāo)。身高作為發(fā)育水平的一個(gè)重要的生理參數(shù)，已成為了廣大教練員選拔青少年運(yùn)動(dòng)員和預(yù)測(cè)項(xiàng)目身高要求的一項(xiàng)重要身體形態(tài)指標(biāo)之一。現(xiàn)代競(jìng)技體育運(yùn)動(dòng)中許多項(xiàng)目對(duì)運(yùn)動(dòng)員身高都有特殊的高度要求，譬如體操、跳水、技巧項(xiàng)目的矮身材要求，雙人或多人項(xiàng)目的同身高同長(zhǎng)度要求，尤其在冰雪運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目中，最適身高的運(yùn)動(dòng)員占據(jù)得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。雖然最理想的身高條件并非是運(yùn)動(dòng)員獲取優(yōu)異成績(jī)的唯一保證，但它卻是運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目選項(xiàng)、潛質(zhì)運(yùn)動(dòng)員接受訓(xùn)練的一個(gè)起點(diǎn)和基礎(chǔ)，其后效作用在競(jìng)技比賽中決不可低估。因此，青少年運(yùn)動(dòng)員身高的選拔和預(yù)測(cè)，就成為運(yùn)動(dòng)員科學(xué)選材工作中對(duì)優(yōu)秀體育后備人才篩選的重要研究課題。實(shí)踐證明，原有的選材的方法和手段極大地促進(jìn)了我國(guó)體育事業(yè)發(fā)展，發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)了大批優(yōu)秀體育人才。目前，運(yùn)動(dòng)員身高的預(yù)測(cè)方法主要包括依父母身高來(lái)預(yù)測(cè)子女未來(lái)成年身高、依少兒當(dāng)年或動(dòng)態(tài)身高年增長(zhǎng)值來(lái)預(yù)測(cè)未來(lái)成年身高、依少兒肢體骨發(fā)育長(zhǎng)度來(lái)預(yù)測(cè)未來(lái)身高、依判斷發(fā)育程度水平來(lái)預(yù)測(cè)未來(lái)身高等幾類方法。這幾類身高的預(yù)測(cè)方法主要從人體身高的外在表現(xiàn)性狀出發(fā)，通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法來(lái)預(yù)測(cè)身高。然而，很多遺傳因素會(huì)限制或阻礙運(yùn)動(dòng)成績(jī)的提高，其中遺傳度越高的指標(biāo)，限制后天運(yùn)動(dòng)水平再提高的程度越明顯。憑經(jīng)驗(yàn)選材、形態(tài)觀察、競(jìng)賽淘汰等方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于運(yùn)動(dòng)員科學(xué)選材的發(fā)展要求。國(guó)際高水平的體育科研已經(jīng)進(jìn)入分子研究領(lǐng)域，并推動(dòng)競(jìng)技運(yùn)動(dòng)水平不斷提高，運(yùn)動(dòng)員科學(xué)選材領(lǐng)域已出現(xiàn)了利用基因選材的理念。明確基因和運(yùn)動(dòng)能力的密切關(guān)系，進(jìn)而從基因水平選材，將成為未來(lái)運(yùn)動(dòng)員選材的主導(dǎo)方向之一。近年來(lái)，生命科學(xué)尤其是分子生物學(xué)和人體運(yùn)動(dòng)科學(xué)取得了突破性發(fā)展，為運(yùn)動(dòng)員的選材提供了理論基礎(chǔ)。從分子水平上探討身高的發(fā)展和變化規(guī)律引起廣大遺傳學(xué)家、教練員和選材工作者的關(guān)注。基因作為決定人體組織結(jié)構(gòu)和功能性狀的基本單位，基因選材的技術(shù)和方法自然也就在運(yùn)動(dòng)員選材領(lǐng)域應(yīng)運(yùn)而生?；蜻x材相對(duì)與傳統(tǒng)科學(xué)選材有很多新的優(yōu)勢(shì)，(I) 一生只需進(jìn)行一次，可以在胚胎開(kāi)始后的任何時(shí)刻進(jìn)行基因分析?；蚍浅７€(wěn)定，一般情況下一生不變。(2)結(jié)合了分子和表觀遺傳學(xué)，并結(jié)合了環(huán)境因素，建立復(fù)雜變量的數(shù)學(xué)模型，更為準(zhǔn)確，應(yīng)用年齡更廣。
(3)分析檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便，只要提供含有基因組的細(xì)胞即可，比如脫落細(xì)胞、毛囊細(xì)胞等。(4)能更加有針對(duì)性的提出科學(xué)訓(xùn)練措施，幫助運(yùn)動(dòng)員更好的成長(zhǎng)。(5)隨著基因研究的深入，基因運(yùn)動(dòng)能力關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)也能不斷的改進(jìn)，具有良好的發(fā)展前景。
研究發(fā)現(xiàn)，青春期身高突增，人體內(nèi)生長(zhǎng)激素濃度變化并不明顯，相反，血清性激素(主要是睪酮)濃度升高，而且同身高的增長(zhǎng)呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明不同的T濃度可能導(dǎo)致了不同個(gè)體間身高的差異。17 α-羥化酶和17、20裂解酶與人體性激素的合成有著直接關(guān)系，催化著性激素合成的限速步驟。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)不管是17a-羥化酶還是17、20裂解酶均存在于同一種蛋白中，即細(xì)胞色素P450cl7a (CYP17)，17a_羥化酶和17、20裂解酶是它的兩種同工酶，故編碼CYP17基因的突變或多態(tài)性變化與人類身材高低的關(guān)系密切。人類CYP17基因位于常染色體10q24.3，長(zhǎng)度為8549bp，有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，共發(fā)現(xiàn)15個(gè)單堿基突變。CYP17基因多態(tài)性是指在第一個(gè)外顯子的5’啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游第27個(gè)堿基處，翻譯起始點(diǎn)上游第34個(gè)堿基處存在著T — C替代的多態(tài)性結(jié)構(gòu)。Zmuda等調(diào)查分析了 333名白人男性CYP17基因中該單堿基替換(T — C)與性激素水平、身高和股骨長(zhǎng)度的變化關(guān)系。發(fā)現(xiàn)了 CYP17基因多態(tài)性與身高個(gè)體差異有關(guān)，具有C/C基因型的男子身高比T/T基因型的男子高近3cm(0.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)、血清有效睪酮水平高20%且股骨頸橫斷面也大0.6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差?？梢?jiàn)A2等位基因的出現(xiàn)與歐美國(guó)家高身材的發(fā)生有著S切關(guān)系。目前的研究發(fā)現(xiàn)，與冰雪運(yùn)動(dòng)員身高有關(guān)CYP17基因的多態(tài)性位點(diǎn)主要為MspAlI位點(diǎn)。關(guān)于CYP17MspAl I位 點(diǎn)基因多態(tài)性影響身高個(gè)體差異的作用機(jī)制為:CYP17啟動(dòng)子區(qū)域234bp處存在單堿基替換(T —C)時(shí)，該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)變異恰好成為限制性內(nèi)切酶MspAl I的酶切位點(diǎn)，在堿基T變?yōu)镃后，則該處由CCACT (Al等位基因)變?yōu)镃CACC(A2等位基因)，產(chǎn)生一個(gè)能被轉(zhuǎn)錄因子SPl (SPl是類固醇/甲狀腺受體家族成員)識(shí)別的共有序列CCACC，相當(dāng)于增加了一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，由于翻譯因子的數(shù)量與啟動(dòng)子的活性有關(guān)，增加一個(gè)SPI可能使CYP17基因的轉(zhuǎn)錄水平得到上調(diào)，增加了酶的活性，從而使性激素的合成水平得到提高，進(jìn)而影響到個(gè)體間身高的差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在分子生物學(xué)水平上預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的方法。本發(fā)明從分子生物學(xué)水平上預(yù)測(cè)了優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高，通過(guò)與身高密切相關(guān)的CYP17 MspAl I位點(diǎn)基因多態(tài)性，即CYP17 MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)的基因型概率來(lái)預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高。
具體實(shí)施例方式下面以優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員CYP17基因的單核苷酸多態(tài)性為例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施。實(shí)施例:檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員CYP17基因的單核苷酸多態(tài)性選取5名優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員，每名外周靜脈取血5ml，于抗凝管中備用(抗凝管編號(hào)為01-05，設(shè)為5個(gè)重復(fù))，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；選取5名普通人進(jìn)行外周靜脈取血，每名5ml，于抗凝管中備用(抗凝管編號(hào)為06-10，設(shè)為5個(gè)重復(fù))，設(shè)為對(duì)照組。CYP17基因多態(tài)性檢測(cè)，具體方法如下:(I)外周血DNA提取將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的外周血樣用中量血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP332)獲得DNA標(biāo)本，_20°C保存。(2) PCR 反應(yīng)利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)符合研究需要的引物序列。含MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)PCR擴(kuò)增的引物序列為 Pl:5，-CATTCGCACTCTGGACCT-3，P2:5，-AGGCTCTTGGGGTACTTG-3，。擴(kuò)增參數(shù)為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性60s ;53°C復(fù)性60s ;72°C延伸90s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小為414bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存，并在2%的瓊脂糖凝膠上電泳確證。(3)酶切反應(yīng)及基因多態(tài)性將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)在EP管中進(jìn)行，20 μ I酶切體系:BSA0.2 μ 1，10ΧΝΕ緩沖液2 μ 1，內(nèi)切酶0.5 μ 1，PCR產(chǎn)物15 μ 1，37°C反應(yīng)4h。2%瓊脂糖凝膠電泳。檢測(cè)結(jié)果:酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)出三種狀態(tài)，即未切開(kāi)、部分切開(kāi)及全部切開(kāi)，可說(shuō)明該基因存在著3種基因型，即Al/Al, A1/A2和A2/A2, A1/A1基因型為一條400bp_450bp的電泳帶；A1/A2基因型為三條電泳帶片段大小分別為120bp-150bp、250bp-300bp和400bp-450bp ；A2/A2基因型為兩條電泳帶，片段大小分別為120bp_150bp和250bp_300bp。(不能被MspAl I酶切開(kāi)的基因型定義為Al型，能被切開(kāi)的基因型定義為A2型，因此，酶切后可以產(chǎn)生3種基因型A1/A1，A1/A2和A2/A2。T/T基因型又定義為A1/A1基因型，T/C型為A1/A2基因型，C/C型為A2/A2基因型。)。

(4)測(cè)序:隨機(jī)選取3種基因型PCR產(chǎn)物各4份進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果用0miga2.0軟件與Genbank中CYP17基因序列比較。(5)計(jì)算優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員CYP17 MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)三種基因型A1/A1、A1/A2和A2/A2的概率。CYP17 MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)三種基因型A1/A1、A1/A2和A2/A2的概率分別為 17.9%,37.5%,44.6%0通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CYP17 MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)遺傳多態(tài)性，即CYP17 MspAlI多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率分布特征來(lái)預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的身高。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞色素P450clTct酶基因遺傳多態(tài)性預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的身高的分子生物學(xué)方法。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的分子生物學(xué)方法，其特征在于對(duì)細(xì)胞色素P450clTct酶基因MspAlI單核苷酸多態(tài)性(Singles Nucleotide Polymorphism, SNP)位點(diǎn)上的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，即通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)位點(diǎn)基因型概率特征來(lái)預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高。
3.依據(jù)權(quán)利要求2所述，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，細(xì)胞色素P450clTct酶基因MspAl I SNP位點(diǎn)有三種基因型，分別為Al/Al，A1/A2和A2/A2，A1/A1基因型為一條電泳帶，片段大小為400bp-450bp ；A1/A2基因型為三條電泳帶，片段大小分別為120bp_150bp、250bp-300bp和400bp-450bp ；A2/A2基因型為兩條電泳帶，片段大小分別為120bp_150bp和 250bp-300bp。
4.依據(jù)權(quán)利要求2所述，優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員CYP17MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)三種基因型Al/AUA1/A2 和 A2/A2 的 概率分別為 17.9%,37.5%,44.6%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員身高的分子生物學(xué)方法。本發(fā)明通過(guò)采集優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員和普通人外周血、DNA提取、目的基因的PCR擴(kuò)增、酶切鑒定、測(cè)序和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)檢測(cè)細(xì)胞色素P450clTct酶基因遺傳多態(tài)性，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞色素P450clTct酶基因遺傳多態(tài)性特點(diǎn)，即對(duì)細(xì)胞色素P450clTct酶基因MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行命名并檢測(cè)相應(yīng)基因型的概率來(lái)預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的最適身高。優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員細(xì)胞色素P450clTct酶基因MspAl I多態(tài)性位點(diǎn)三種基因型A1/A1、A1/A2和A2/A2的概率分別為17.9％、37.5％、44.6％，此概率可以作為預(yù)測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員最適身高的參考標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明為建立該項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員潛能的早期預(yù)測(cè)、評(píng)定、選材和育材的科學(xué)體系打下堅(jiān)實(shí)的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，提升選材的成功率，突破一次性選材的理論和技術(shù)難關(guān)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103160590SQ20131011348
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者姜龍江, 闞軍常, 李萬(wàn)哲, 崔鵬, 孫博, 關(guān)偉軍 申請(qǐng)人:哈爾濱體育學(xué)院