專利名稱：一種通過端粒長(zhǎng)度篩選抗衰老中藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥篩選方法，特別涉及一種通過端粒長(zhǎng)度篩選抗衰老中藥的方法。
背景技術(shù)：
中藥的應(yīng)用在我國(guó)有著幾千年的歷史，為中華民族的繁衍和延續(xù)提供了有力的保障，尤其是對(duì)危急重癥、疑難雜病的治療展現(xiàn)了獨(dú)具特色的優(yōu)勢(shì)。隨著全球天然藥物潮流的興起，植物藥與傳統(tǒng)醫(yī)藥取得了前所未有的發(fā)展機(jī)遇，2000年全球天然植物藥市場(chǎng)銷售額達(dá)165億美元，近幾年保持在10% 15%的增長(zhǎng)速度。云南素有“動(dòng)植物王國(guó)”之稱。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，全省有藥用植物4，758種，藥用動(dòng)物260種，礦物藥32種，共計(jì)5，050種。因此，有效利用云南現(xiàn)有的中藥資源豐富的優(yōu)勢(shì)，并將其與現(xiàn)代生物學(xué)知識(shí)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，達(dá)到更加合理的應(yīng)用該項(xiàng)資源的目的，是目前云南中藥材行業(yè)加速發(fā)展的一條有效途徑。端粒是存在于真核 細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽子”結(jié)構(gòu)，能夠維持染色體的完整。端粒DNA是由簡(jiǎn)單的DNA高度重復(fù)序列組成的，染色體末端沿著5’到3’方向的DNA鏈富含鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)兩種核苷酸。在酵母和人中，端粒序列分別為Cl - 3A/TG1 一 3和TTAGGG/CCCTAA，并有許多蛋白與端粒DNA結(jié)合。端粒DNA主要功能有:第一，保護(hù)染色體不被核酸酶降解；第二，防止染色體相互融合；第三，為端粒酶提供底物，解決DNA復(fù)制的末端隱縮，保證染色體的完全復(fù)制。端粒、著絲粒和復(fù)制原點(diǎn)是染色體保持完整和穩(wěn)定的三大要素。同時(shí)，端粒又是基因調(diào)控的特殊位點(diǎn)，?？梢种莆挥诙肆８浇虻霓D(zhuǎn)錄活性(稱為端粒的位置效應(yīng)，TPE)。在大多真核生物中，端粒的延長(zhǎng)是由端粒酶催化的，另端粒與衰老
1990年，Harley等證實(shí)端粒的長(zhǎng)度可以隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而逐漸變短。這一發(fā)現(xiàn)在端粒和細(xì)胞衰老之間建立了緊密的聯(lián)系。端粒重復(fù)序列的長(zhǎng)度可能起著一種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細(xì)胞的壽命明顯不同,其端粒的長(zhǎng)度也不相同。是隨著年齡的增長(zhǎng)而縮短。來(lái)自新生兒的體細(xì)胞可在體外傳代培養(yǎng)80 90代，來(lái)自70歲老人的體細(xì)胞在體外只能傳代培養(yǎng)20 30代，而且端粒的重復(fù)序列長(zhǎng)度也縮短很多。實(shí)驗(yàn)證明，端粒長(zhǎng)度控制著衰老進(jìn)程。Olovnikov通過實(shí)驗(yàn)推測(cè),端粒DNA末端復(fù)制而造成的堿基序列丟失很可能調(diào)節(jié)了細(xì)胞的壽命。當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就開始衰老或步入死亡。Bodnar等通過激活視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞和表皮成纖維細(xì)胞的端粒酶的活性，使端粒得以延長(zhǎng)，有絲分裂次數(shù)增加，正常細(xì)胞的生命周期也得以延長(zhǎng)，從而有力地證實(shí)了端粒與衰老的關(guān)系。2003年，((Lancet))上發(fā)表的報(bào)告稱端?；蛟S可以預(yù)測(cè)人類生存期限，認(rèn)為端粒的縮短通過促進(jìn)多種衰老相關(guān)疾病的發(fā)生而影響壽命。在小于65歲的人群中，端粒長(zhǎng)度短于平均值的人比端粒長(zhǎng)于平均值者壽命短4 5年。盡管同一年齡組的人端粒長(zhǎng)度的變異很大，大量研究證明端粒長(zhǎng)度與年齡呈負(fù)相關(guān)。該現(xiàn)象的解釋為:端粒長(zhǎng)度短的人過早地死于衰老相關(guān)的疾病。另外，有關(guān)端粒與衰老的證據(jù)來(lái)自于許多罕見的遺傳性早老性疾病。罹患先天性角化不良、遺傳性肺纖維化等疾病的人都伴有明顯端粒長(zhǎng)度異?？s短和端粒酶基因的突變，提示端?？s短可能在早衰癥的發(fā)病或者病情進(jìn)展中起重要作用。
影響端粒長(zhǎng)度的因素分為遺傳和非遺傳兩類。遺傳因素包括種族差異、年齡差異、同一年齡不同個(gè)體間的差異、甚至同一個(gè)體不同器官細(xì)胞間的差異等，在此不做細(xì)述。我們關(guān)注的主要是非遺傳因素，因?yàn)檫@一類因素與我們周圍的環(huán)境息息相關(guān)，對(duì)人體健康、衰老和疾病發(fā)生起到了非常關(guān)鍵的作用。影響端粒長(zhǎng)度的環(huán)境因素有吸煙、飲食、運(yùn)動(dòng)、精神壓力等及一些新的危險(xiǎn)因素包括炎癥和氧化應(yīng)激等。對(duì)于吸煙、飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)及精神壓力大這些傳統(tǒng)的于健康密切相關(guān)的因素在很多綜述中已有很詳細(xì)的報(bào)道。相對(duì)于傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，氧化應(yīng)激和炎癥與端粒損耗相關(guān)性更密切。如Bekaert等發(fā)現(xiàn)外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與膽固醇和血壓無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，但與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:提供一種快速篩 選抗衰老中藥的方法。技術(shù)方案
人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞，在叔丁基過氧化氫的作用下加速其衰老，制作衰老細(xì)胞模型；在造模后，使用各種選取的中藥濃縮復(fù)合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理；處理結(jié)束后，提取細(xì)胞基因組DNA，檢測(cè)其端粒長(zhǎng)度。有益效果
1、路易斯中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心首席科學(xué)家，1998年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主路易斯J.伊格納羅教授常年來(lái)對(duì)中國(guó)的中醫(yī)理論很感興趣，最近他提出了一個(gè)全新的設(shè)想:中藥的“寒，涼，平，溫，熱”性，從現(xiàn)代分子生物學(xué)層面上考慮，可以表現(xiàn)為該藥物對(duì)端粒長(zhǎng)度的影響水平。熱性中藥都能延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度，從而減緩機(jī)體衰老，延年益壽。中醫(yī)所說的熱性體質(zhì)的人，體內(nèi)細(xì)胞端粒平均長(zhǎng)度應(yīng)該大于體質(zhì)為寒性的同齡人，表現(xiàn)為衰老慢一些；同理，寒性體質(zhì)的人，端粒平均長(zhǎng)度應(yīng)該較同齡人要短。2、通過檢測(cè)人的端粒長(zhǎng)度，我們可以預(yù)測(cè)其理論上剩余的壽命，通過研究具有代表性的熱性中草藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒長(zhǎng)度的影響，有極大的可能為延緩衰老提供新的科學(xué)理論和治療手段，造福人類。同時(shí)，在更高的成面上，通過研究中藥和端粒長(zhǎng)度的關(guān)系，可以在抽象的中醫(yī)理論和具體的現(xiàn)代生物學(xué)理論間建立起一個(gè)重要的紐帶。這對(duì)于更好的理解基礎(chǔ)中醫(yī)理論，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)中藥的現(xiàn)代化，具有非常重要的意義。3、我國(guó)的中藥出口已遍及世界130個(gè)國(guó)家及地區(qū)，但由于中藥的藥用成分多、分離難、驗(yàn)證難,有效成分還不清楚,成分比例含量不能有效地控制，中藥的質(zhì)量控制尚達(dá)不到現(xiàn)代社會(huì)用藥的要求水平，國(guó)際市場(chǎng)的份額只有3 5%左右。開展該項(xiàng)目研究，為提升我省乃至我國(guó)地道中草藥在全球范圍的影響力和知名度，提出可以讓世界范圍認(rèn)可的中藥藥性理論，帶動(dòng)傳統(tǒng)中藥的發(fā)展，是十分必要的。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)獲知，具有明顯熱性的中草藥不經(jīng)過分離研究其有效成分，而直接通過其濃縮復(fù)合物作用于人體細(xì)胞，影響細(xì)胞內(nèi)染色體端粒長(zhǎng)度，來(lái)達(dá)到減緩衰老的功效。4、中藥影響細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的另一個(gè)重要形式主要由其所具有的抗氧化性所決定。前文提到，端粒損耗與氧化應(yīng)激間有非常密切關(guān)系，因此富含抗氧化活性成分的中藥材對(duì)保護(hù)細(xì)胞特別是端粒的氧化損傷具有十分重要的意義。自由基生命科學(xué)的研究自20世紀(jì)70年代以來(lái)迅猛發(fā)展，相關(guān)文獻(xiàn)大量涌現(xiàn)，1998年以來(lái)的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)更是授與了研究一氧化氮自由基的，包括伊格納羅教授在內(nèi)的3位美國(guó)藥學(xué)家。事實(shí)上由于器官的正?；顒?dòng)或氧化壓力過剩，體內(nèi)可產(chǎn)生活性氧(ROS，reactive Oxygen species)和活性氮(RNS, reactive nitrogen species)等自由基，當(dāng)體內(nèi)自由基超出一定量后就會(huì)產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，自由基將不斷產(chǎn)生并由此引起一系列的生物學(xué)反應(yīng)，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。同自由基反應(yīng)損傷相關(guān)的疾病有:動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、白內(nèi)障、癌癥、心肌缺血灌注損傷、關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕癥等，中藥材的獨(dú)特療效與其作為抗氧化劑，高效清除體內(nèi)自由基作用密切相關(guān)。目前在醫(yī)療和食品領(lǐng)域使用較多的是合成抗氧化劑，而最近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，合成抗氧化劑BHT、BHA等對(duì)生物體有潛在的毒副作用，因此，眾多研究者矚目于從我國(guó)豐富的中藥材資源中來(lái)尋求高效、低毒的天然抗氧化劑，其開發(fā)研究也必將對(duì)醫(yī)藥，營(yíng)養(yǎng)和食品工程產(chǎn)生極其重要的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
Cl)體外實(shí)驗(yàn)
具體實(shí)施方案:W1-38細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，IXlO4細(xì)胞/孔，并在培養(yǎng)基中加入2.0 mmol -L -1谷氨酰胺，1.0 mmol.L -1丙酮酸鈉，0.1 mmol.L -1非必需氨基酸，1.5 g.L -1碳酸氫鈉。通常年輕W1-38細(xì)胞的倍增時(shí)間是12 h，連續(xù)傳代至50代后細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。一般3 4 d細(xì)胞完全融合時(shí)1: 4傳代，1:2傳代算一代。細(xì)胞隨機(jī)分為4組:a年輕組、b空白對(duì)照組、c單純t- BHP處理組和d待測(cè)藥物預(yù)處理組。年輕組:從20代開始培養(yǎng)，傳代至30代時(shí)收集細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組:將細(xì)胞培養(yǎng)至38代。

單純t-BHP處理組:從31代開始，每?jī)纱┞对趖-BHP (100 μ mol/L)的MEM培養(yǎng)液中I h后用MEM培養(yǎng)液沖洗2遍，培養(yǎng)48 h后根據(jù)細(xì)胞融合情況(一般4 7 d) I:4傳代，t-BHP共作用4次后收集細(xì)胞。藥物預(yù)處理組:從第24代換含不同濃度的待測(cè)藥物(5、10和20 mg.L_ O的MEM培養(yǎng)液，加藥培養(yǎng)96h后，在31到34代t-BHP誘導(dǎo)細(xì)胞衰老期間暫停使用待測(cè)藥物，以排除待測(cè)藥物直接與t-BHP反應(yīng)，撤去t-BHP后修復(fù)期間繼續(xù)使用待測(cè)藥物至34代收集細(xì)胞。各組設(shè)5個(gè)平行對(duì)照。細(xì)胞處理結(jié)束后，提取基因組DNA，然后檢測(cè)其端粒的平均長(zhǎng)度和最短長(zhǎng)度。
2平均長(zhǎng)度使用RT-qPCR法測(cè)量:
a.引物設(shè)計(jì):RT_qPCR引物除了常規(guī)的用于擴(kuò)增端粒片段的引物對(duì)和用于擴(kuò)增用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的β-actin的引物對(duì)以外,還包括一段84 bp的寡核苷酸片段(84_mer)和一段79 bp的β -actin片段。 b.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:
I)將84mer梯度稀釋:1,1(T2,......., 10'84mer寡核苷酸鏈總長(zhǎng)度計(jì)算方法如下(假
設(shè)每個(gè)反應(yīng)需未稀釋84mer 60pg,即60X1(T12 g,已知84mer的分子量為26667.2):-平均一個(gè) 84mer 的質(zhì)量為:2.6667 x 1O4 / 6.02 x 1O23 = 0.44 χ 109;
-每個(gè)PCR反應(yīng)體系中未稀釋84mer總量為:60 χ 10-12 / 0.44 χ 10-19 = 1.36 χ 1O9;- 因此每個(gè)PCR反應(yīng)體系中未稀釋84mer總長(zhǎng)度為:1.36 x 1O9 χ 84 / 2 = 1.14χ 1O8 kb ；
同理可得不同稀釋濃度84mer在每個(gè)反應(yīng)體系中的總長(zhǎng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線1，見

圖1。2)繪制β -actin 79 bp片段拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線:
-將 79 bp 的 β-actin 梯度稀釋:1,10' …….，10_6 ;
-actin片斷為79 bp，相對(duì)分子量為26307，單個(gè)actin 79 bp片段質(zhì)量為2.6307 χIO4 / 6.02 χ IO23 = 0.44 χ 10_19 g ；
-假設(shè)反應(yīng)體系中最高濃度79 bp actin含量為200 pg，那么每個(gè)反應(yīng)體系中79 bpactin 的拷貝數(shù)為:200 χ 1(Γ12 / 0.44 χ 10-19 = 4.55 χ 1O9 ；
-同理得不同稀釋濃度反應(yīng)體系中79 bp actin拷貝數(shù)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線2，見圖2。擴(kuò)增gDNA樣品中端粒和β-actin
RT-qPCR 擴(kuò)增 gDNA 樣品中端粒和 β -actin,獲得 T/S 值(CT (telomere)/ CT(actin)),并通過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算gDNA樣品中端粒的總長(zhǎng)度及樣品中g(shù)DNA總拷貝數(shù)，即可以計(jì)算端粒平均長(zhǎng)度:端粒平均長(zhǎng)度=樣品中端?？傞L(zhǎng)度/ gDNA總拷貝數(shù)。2最短端粒長(zhǎng)度使用改良STELA法檢測(cè):
a.限制性內(nèi)切酶消化:細(xì)胞中提取的gDNA經(jīng)過MseI和NdeI兩種限制性內(nèi)切酶酶切(1:1)。經(jīng)過這兩種內(nèi)切酶的酶切后，gDNA被消化成若干片斷(10-3000 bp)，其中不含端粒的片斷兩端形成5’端突出的TA粘末端(5’ -TA-3’)，而在含端粒的片斷的近端(即遠(yuǎn)離端粒的一端)也形成5’ -TA-3’。b.Linker寡核苷酸連接:兩個(gè)序列經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的寡核苷酸Linker通過互補(bǔ)配對(duì)連接到各個(gè)gDNA片斷的5’-TA-3’。其中一個(gè)Linker含42個(gè)核苷酸(42-mer oligo),另一個(gè)Linker含13個(gè)核苷酸(11+2-mer oligo),這兩個(gè)linker可以互補(bǔ)配對(duì)并形成一個(gè)含5’ -TA-3’的粘末端，可以與酶切后的gDNA片斷粘末端互補(bǔ)配對(duì)。c.Telorette片斷的連接:另一個(gè)單鏈寡核苷酸片段telorette被連接到端粒富含C的5’端。該Telorette 5’端含有7個(gè)可以與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸，之后是20個(gè)非互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸。d.PCR擴(kuò)增端粒片段:首先由42-mer oligo和11+2-mer oligo配對(duì)形成的5’突出粘末端由PCR使用的DNA聚合酶補(bǔ)齊，形成平末端；PCR正向引物可以特異識(shí)別被補(bǔ)齊部分，反向引物特意識(shí)別Telorette 3’端,從而特意擴(kuò)增含端粒的DNA片段；不含端粒的gDNA片段由于兩端連接的寡核苷酸可以互補(bǔ)配對(duì)，形成環(huán)狀，不能被PCR反應(yīng)擴(kuò)增。PCR結(jié)果通過0.85%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增的端粒片段大小通過與已知大小的核酸marker比較而得到。
權(quán)利要求
1.人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞，在叔丁基過氧化氫的作用下加速其衰老，制作衰老細(xì)胞模型；在造模后，使用各種選取的中藥濃縮復(fù)合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理；處理結(jié)束后，提取細(xì)胞基因組DNA，檢測(cè)其 端粒長(zhǎng)度，根據(jù)結(jié)果判斷是否熱性藥物即具有抗衰老活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥篩選方法，特別涉及一種通過端粒長(zhǎng)度篩選抗衰老中藥的方法；人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞，在叔丁基過氧化氫的作用下加速其衰老，制作衰老細(xì)胞模型；在造模后，使用各種選取的中藥濃縮復(fù)合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理；處理結(jié)束后，提取細(xì)胞基因組DNA，檢測(cè)其端粒長(zhǎng)度，根據(jù)結(jié)果判斷是否熱性藥物即具有抗衰老活性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146840SQ201310115649
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月4日
發(fā)明者葉亞東, 路易斯伊格納羅, 張娟, 全利, 郝小江, 朱兆云, 滕凌, 朱文華, 胡娟, 肖慧, 潘鸝, 張俊, 楊紫俊 申請(qǐng)人:常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司