專利名稱：甘藍(lán)型油菜抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及能賦予植物(尤其是油菜)除草劑抗性(耐受性)的蛋白及其在植物育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)田中雜草是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力資源和成本很高，而且不便于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)，嚴(yán)重制約了農(nóng)作物種植向高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低成本方向的發(fā)展進(jìn)程。因此，除草劑就應(yīng)運(yùn)而生，其使用為解決農(nóng)田草害、促進(jìn)栽培方式的革新及增產(chǎn)起了很大的作用。常見的除草劑，包括有磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑，目前已經(jīng)大面積商業(yè)推廣使用。然而，由于這些除草劑通常也能殺死農(nóng)作物本身，因此對一般不具有除草劑抗性(耐受性)的農(nóng)作物而言，除草劑的使用在時間和空間上受到了極大限制，如需要在農(nóng)作物播種前一段時間使用除草劑。為此，人們研究開發(fā)具有除草劑抗性(耐受性)的植物(農(nóng)作物)，這樣可以在種植期間使用除草劑，殺死雜草，但不影響植物本身的生長，由此拓寬了除草劑的使用范圍。盡管當(dāng)前有不少文獻(xiàn)報道在某些基因上進(jìn)行突變再導(dǎo)入野生型植物成為轉(zhuǎn)基因植物，可以給植物帶來除草劑抗性，但是實驗多針對擬南芥等遺傳背景比較清楚的模式植物，但是對于實際種植的農(nóng)作物，尤其是經(jīng)過大量前期轉(zhuǎn)基因和/或非轉(zhuǎn)基因育種獲得的具有良好性狀(同時遺傳背景復(fù)雜)的農(nóng)作物來說，往往情況很不樂觀，如我們發(fā)現(xiàn)，在體外和/或擬南芥導(dǎo)入測試具有除草劑抗性的突變基因，導(dǎo)入植株等后卻發(fā)生大量發(fā)生了回復(fù)喪失除草劑抗性的情況，有些雖然保留了除草劑抗性，但是植株生長發(fā)育不正常而根本無法實踐中應(yīng)用，這很可能是由于植株中大量基因協(xié)同作用的結(jié)果。所以，對于復(fù)雜遺傳背景的植物(如油菜，尤其是改良過的油菜)，具有除草劑抗性的植物及其真實能起決定性的物質(zhì)(如蛋白、基因等)目前還沒有理論來定向 設(shè)計出，只能依賴于科研人員艱苦實踐而獲得，尤其是依賴長期篩選，并且憑借一些運(yùn)氣才能獲得。對于四倍體的植物來說，情況更為復(fù)雜。本發(fā)明人正是經(jīng)過長期而艱苦的研究實踐，憑借運(yùn)氣偶然地利用滅草煙在油菜中雙9號突變植株中發(fā)現(xiàn)了一系列(突變)蛋白，其能夠在除草劑存在的條件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，從而使得油菜(尤其是中雙9號)具有除草劑抗性(耐受性)。本發(fā)明人還開發(fā)了這些蛋白及其編碼基因在轉(zhuǎn)基因或者非轉(zhuǎn)基因植物育種中的應(yīng)用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農(nóng)作物，如油菜等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的使植物具有除草劑抗性的蛋白質(zhì)，彌補(bǔ)原有專利或技術(shù)的不足。另外，本發(fā)明還提供了編碼這些蛋白質(zhì)的核酸以及基因工程中間體(如，表達(dá)盒、載體和細(xì)胞等)，獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應(yīng)用，并且提供了判斷植物是否采用本發(fā)明方法獲得的鑒定方法。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了使植物具有除草劑抗性的ALS突變蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2、4、6、8、10或12所示。該蛋白質(zhì)能使植物(如油菜，尤其是中雙9號)具有除草劑抗性。在本文中，ALS就是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)的簡稱，其酶分類編號為EC4，1.3.18。乙酰乳酸合成酶是支鏈氨基酸合成中的一個關(guān)鍵酶，如在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化丙酮酸與丁酮酸生成2-乙醒基-2-輕基丁酸(James C.Global Status ofCommercialized Biotech/GM Crops: 2006.1SAAA Briefs.1thaca, NY)。油菜是四倍體植物，其基因組具有五個ALS基因，但是在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)兩個基因的突變能夠?qū)е鲁輨┛剐?，這兩個分別是也分和也ALSl的氨基酸序列如GenBank登錄號⑶192448所示，ALS3的氨基酸序列如GenBank登錄號AB618066.1所示，這兩個基因在本文中被稱為“野生型”的ALS，其不具有除草劑抗性。本發(fā)明提供的的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是在野生型ALSl的氨基酸序列上帶有Alal07、Alal90、Trp559和/或Ser638突變，和/或，在野生型ALS3的氨基酸序列上帶有Alal04和/或Trpl79突變。在本文中，中雙9號是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所培育的非轉(zhuǎn)基因油菜品種，其來源是中油821/雙低油菜品系84004//中雙4號變異株系，已經(jīng)商業(yè)推廣，其品種審定編號為國審油2005014。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)中雙9號可以通過滅草煙實驗而篩選出抗咪草煙突變植株。本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)是經(jīng)過大量篩選才終于從本發(fā)明人突變的油菜植株(如，中雙9號)中發(fā)現(xiàn)的，能使相應(yīng)植株具有除草劑抗性。目前，還沒有報道表明，在來自油菜的氨基酸序列如SEQ ID顯:2、4、6、8、10或12所示的突變蛋白，會使得相應(yīng)植物(尤其是油菜)具有除草劑抗性，更無法預(yù)測在保持除草劑抗性的同時，還能保持正常的生長情況。除了本發(fā)明具體 實施方式所述的突變植株篩選和擴(kuò)增方法之外，在蛋白質(zhì)序列已知的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力通過改變已知蛋白質(zhì)的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，就可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，這些方法記載于《分子克隆實驗指南》(北京:科學(xué)出版社，2002年)等文獻(xiàn)中。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，編碼這些蛋白質(zhì)的基因可以導(dǎo)入植物中,優(yōu)選導(dǎo)入油菜中,例如導(dǎo)入(野生型)中雙9號中，從而賦予植物抗除草齊 性能。目前，以抑制ALS為靶位的除草劑包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸卩密唳類等除草劑(Peter Babczinski, Thomas Zelinsk1.Mode of actionherbicidal ALS—inhibitors on acetolactate synthase from green plant cellcultures, yeast, and Escherichia col1.Pesticide science, 1991, 31: 305-323;鄭培忠，沈健英.乙酰乳酸合成酶抑制劑的種類及其耐藥性研究進(jìn)展.雜草科學(xué)，2009，2: 4-8)。因此，在本文中，除草劑抗性指的是對包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類在內(nèi)的除草劑具有耐受性。優(yōu)選在本發(fā)明中，除草劑是咪唑啉酮類除草劑，如在本發(fā)明的具體實施方式
中，除草劑是滅草煙(其化學(xué)名稱為3-吡啶羧酸_2-[4，5- 二氫-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧-1H-咪唑-2-基]酯，其CAS號為81334-34-1)。即優(yōu)選在本發(fā)明中，除草劑抗性是咪唑啉酮類除草劑抗性，更優(yōu)選是滅草煙抗性。在第二方面，本發(fā)明提供了核酸，其編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)。在本文中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，優(yōu)選是DNA。在知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過常規(guī)的密碼子對應(yīng)關(guān)系和宿主表達(dá)頻率，運(yùn)用PCR方法、DNA重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力獲得并優(yōu)化編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)的核酸。一旦獲得該核酸，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞，然后通過常規(guī)的宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從中分離得到大量的核酸。優(yōu)選本發(fā)明第二方面的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或3或5或7或9或11所示。在第三方面，本發(fā)明提供了表達(dá)盒(cassette)，其包含本發(fā)明第二方面的核酸。本發(fā)明第三方面的表達(dá)盒優(yōu)選在5’ -3’的轉(zhuǎn)錄方向上包含啟動子區(qū)、本發(fā)明第二方面的核酸和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止區(qū)。本發(fā)明第三方面的表達(dá)盒優(yōu)選適合在植物中表達(dá)本發(fā)明第二方面的核酸。示例性的啟動子包括來自CaMV 35S啟動子或煙草花葉病毒(TMV) Ω元件的啟動子；示例性的轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止區(qū)包括轉(zhuǎn)錄終止元件或多聚腺苷酸化信號等。本發(fā)明第三方面的表達(dá)盒還可以包括，在細(xì)菌中復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)(例如，來自pBR322或P15A ori的ORI區(qū))，土壤桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的元件(例如，T-DNA的左邊界和/或右邊界)，從而方便從細(xì)菌往植物中的轉(zhuǎn)化過 程。另外，本發(fā)明第三方面表達(dá)盒還可以包含增強(qiáng)子、內(nèi)含子、多克隆位點(diǎn)、操縱基因、阻遏物結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等，例如來自TMV或苜蓿花葉病毒(AMV)的前導(dǎo)序列等作為增強(qiáng)子。在第四方面，本發(fā)明提供了載體，其包含本發(fā)明第二方面的核酸。在本文中，載體是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。根據(jù)所應(yīng)用的目的不同，載體可以分為克隆載體、表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化載體，指的是所使用的目的分別針對克隆并驗證基因、表達(dá)相應(yīng)基因和將相應(yīng)基因轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中可用的載體包括但不限于:在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體)、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體、在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達(dá)用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達(dá)用的各種載體。本發(fā)明第四方面的載體是轉(zhuǎn)化載體，尤其是植物轉(zhuǎn)化載體，特別是適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的載體。這些載體很多已經(jīng)商品化了。在第五方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞，其包含本發(fā)明第二方面的核酸。細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。在本文中，植物細(xì)胞指的是來自植物的細(xì)胞(可以包括細(xì)胞群，但優(yōu)選是單個細(xì)胞)，但是這些細(xì)胞不能僅僅借助光合作用而以水、二氧化碳和無機(jī)鹽等無機(jī)物合成碳水化合物、蛋白質(zhì)來發(fā)育成存活的單個植株。植物細(xì)胞可以是必須使用有機(jī)物(如某些植物激素)才能發(fā)育的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，也可以是完全無發(fā)育成植株能力的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，通俗地說，即死亡的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，如榨油后的菜餅等。本發(fā)明的第二方面的核酸可被插入轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞中的任何載體中。優(yōu)選的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤其是用于克隆或儲存核酸、或是用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞，例如農(nóng)桿菌、大腸桿菌，包括根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌等。另外優(yōu)選的細(xì)胞是植物細(xì)胞，優(yōu)選是油菜細(xì)胞，更優(yōu)選是中雙9號細(xì)胞，所述植物細(xì)胞中包含的本發(fā)明第二方面的核酸可以是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入植物細(xì)胞的，包括導(dǎo)入到植物細(xì)胞的核、葉綠體、線粒體和/或質(zhì)體中，也可以是通過突變技術(shù)(如本發(fā)明具體實施方式
所述的技術(shù))使得本發(fā)明第二方面的核酸存在于植物細(xì)胞中的。在第六方面，本發(fā)明提供了植物，其包含本發(fā)明第二方面的核酸，和/或其表達(dá)本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)。由于引入了本發(fā)明第二方面的核酸和本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)，本發(fā)明第六方面的植物具有除草劑抗性。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和無機(jī)鹽等無機(jī)物就能合成碳水化合物、蛋白質(zhì)來維系生存的單個植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品種、植株、植物事件、植物后代、植物種子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生的植物后代、與其他植物品種雜交產(chǎn)生的植物后代、以及回交或自交產(chǎn)生的植物后代。本發(fā)明第六方面的植物可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物。示例性的植物包括油菜、玉米、小麥、黑麥、燕麥、大麥、大豆、馬鈴薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西紅柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、煙草、或擬南芥等。在本發(fā)明的具體實施方式
中，優(yōu)選本發(fā)明第六方面的植物是油菜，更優(yōu)選是中雙9號。其中，中雙9號是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所培育的非轉(zhuǎn)基因油菜品種，其來源是中油821/雙低油菜品系84004//中雙4號變異株系，已經(jīng)商業(yè)推廣，其品種審定編號為國審油2005014。本發(fā)明優(yōu)選的植物，可以繼承了中雙9號高產(chǎn) 、抗病、優(yōu)質(zhì)等特性，并帶來除草劑抗性，尤其是咪唑啉酮類除草劑抗性，特別是滅草煙抗性。當(dāng)然，如在本發(fā)明的具體實施方式
中，擬南芥也是可選的植物品種。在第七方面，本發(fā)明提供了前述各方面在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應(yīng)用。在獲得具有除草劑抗性的植物過程中，可以應(yīng)用到本發(fā)明前述各方面。本發(fā)明第七方面所提供的包括，本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應(yīng)用，本發(fā)明第二方面的核酸在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應(yīng)用，本發(fā)明第三方面的表達(dá)盒在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應(yīng)用，本發(fā)明第四方面的載體在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應(yīng)用，本發(fā)明第五方面的細(xì)胞在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應(yīng)用，本發(fā)明第六方面的植物在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應(yīng)用。優(yōu)選在本發(fā)明的第七方面中，除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優(yōu)選是滅草煙。在本文中，獲得包括制備、培育、生產(chǎn)或以其他方式產(chǎn)生得到，包括通過轉(zhuǎn)基因育種方式獲得，如將本發(fā)明第二方面的核酸轉(zhuǎn)化入植物后使之表達(dá)本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)；也包括通過非轉(zhuǎn)基因育種方式獲得，如通過雜交、回交、自交或無性繁殖本發(fā)明第六方面的植物并分選出仍舊包含本發(fā)明第二方面的核酸并表達(dá)本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)的植物。因此，本發(fā)明的第七方面提供的應(yīng)用包括，在獲得具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物過程中的應(yīng)用和在獲得具有除草劑抗性的非轉(zhuǎn)基因植物過程中的應(yīng)用。在第一個獨(dú)立的方面，本發(fā)明提供了(野生型)中雙9號在獲得具有除草劑抗性的植物(如，油菜)中的應(yīng)用，優(yōu)選是在獲得包含本發(fā)明第二方面的核酸和/或表達(dá)本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)的具有除草劑抗性的油菜中的應(yīng)用。中雙9號本身具有優(yōu)良的性狀，但是更重要的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對它的種子用化學(xué)誘變劑處理后用除草劑滅草煙進(jìn)行篩選，能夠獲得具有除草劑抗性的油菜，而針對其他品種或使用其他除草劑的篩選則困難。在第八方面，本發(fā)明提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法，其包括如下步驟:
(1)使植物包含本發(fā)明第二方面的核酸；和/或，
(2)使植物表達(dá)本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)。優(yōu)選在本發(fā)明第八方面的方法中，植物是油菜，更優(yōu)選是中雙9號。當(dāng)然，如在本發(fā)明的具體實施方式
中，擬南芥也是可選的植物品種。
可以采用前述或者本領(lǐng)域技術(shù)人員能獲知的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因方法，使植物包含本發(fā)明第二方面的核酸，或者使植物表達(dá)本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)。實施本發(fā)明第八方面的方法，能夠獲得本發(fā)明第六方面的植物。優(yōu)選在本發(fā)明的第八方面中，可以采用的步驟包括轉(zhuǎn)基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。這些步驟本身對于轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，都是可以獲知并實施的。在第九方面，本發(fā)明提供了鑒定本發(fā)明第六方面的植物或者本發(fā)明第八方面的方法獲得的植物的方法，其包括如下步驟: (1)測定所述植物是否包含本發(fā)明第二方面的核酸；和/或，
(2)測定所述植物是否表達(dá)本發(fā)明第一方面的蛋白質(zhì)。通過該方法，可以判斷植物是否屬于本發(fā)明的植物，即是否屬于本發(fā)明第六方面的植物，或者是否屬于本發(fā)明第八方面的方法獲得的植物。測定的步驟可以通過常規(guī)的核酸檢測和/或蛋白質(zhì)檢測方法來進(jìn)行，只需要能夠檢測出蛋白質(zhì)或其編碼核酸帶有前述非天然存在的突變或其相應(yīng)核酸突變的方法都可以，優(yōu)選能夠檢測出蛋白質(zhì)或其編碼核酸帶有如SEQ ID NO:2、4、6、7、8、10或12所示的突變蛋白或其相應(yīng)核酸突變的方法。示例性的方法包括蛋白質(zhì)測序、核酸測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測、探針雜交檢測等。本發(fā)明取得的有益效果在于獲得可替代現(xiàn)有技術(shù)的使植物具有除草劑抗性的蛋白質(zhì)、核酸、表達(dá)盒、載體、細(xì)胞、植物、獲得具有除草劑抗性的植物的應(yīng)用和方法、以及鑒定本發(fā)明的植物的方法，并且可以通過轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因方法獲得具有除草劑抗性的植物品種，尤其是油菜品種。本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的了。


圖1示例性地顯示了抗咪唑啉酮類除草劑的油菜突變植株的照片。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常用分子生物學(xué)、組織培養(yǎng)技術(shù)和農(nóng)學(xué)手冊所記載的方法。例如，具體步驟可參見:《Molecular Cloning: A LaboratoryManual (3rd edition))) (Sambrook, J.,Russell, David ff., 2001,Cold Spring Harbor),((Plant Propagation by Tissue Culture)) (Edwin F.George, Michael A.Hall, Geert-JanDe Klerk, 2008, Springer)。實施例1從中雙9號突變植株中提取抗咪唑啉酮類除草劑的蛋白突變體
播種各品種/品系油菜種子，其中包括中雙9號(可購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所)。播種前將各品種/品系油菜種子在25°C培養(yǎng)箱中用水浸泡22小時后，將種子撈出，控干水分。然后，用0.4% (w/w)甲磺酸乙酯(EMS)浸泡各油菜種子，浸泡12小時，期間每I小時搖動一次種子。12小時后棄去EMS溶液，換自來水浸泡種子，棄自來水，浸泡共重復(fù)5次，每次浸泡5分鐘，然后用自來水沖洗種子2小時，沖洗過程中翻動種子，從而將EMS洗凈。取少量種子放在濕紙表面，放入28°C培養(yǎng)箱中，測定發(fā)芽率為6(Γ70%，剩余的種子播種于大田。待植株成熟后分地塊收割，每個地塊面積30平方米，同一品種/品系的種子混收，晾干至含水量8%。將收割的種子分別用咪唑啉酮類除草劑“滅草煙”(3-吡啶羧酸_2-[4，5- 二氫-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧-1H-咪唑-2-基]酯，CAS號81334-34-1)水劑(濃度為0.345%，購自山東先達(dá)化工有限公司)浸泡處理10 h后播種，20天后調(diào)查秧苗生長情況，有6株秧苗已長出真葉(圖1 )，確認(rèn)它們均為來自中雙9號的抗咪唑啉酮類除草劑的突變株。保留并繁殖這些綠色秧苗，這些植株均能夠正常生長發(fā)育，其余油菜均死亡。取上述中雙9號突變植株的葉片，連同野生型的中雙9號植株葉片，分別提取它們的基因組DNA，委托深圳華大基因研究院進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn):相對于野生型中雙9號，突變植株的乙酰乳酸合成酶(ALS)基因分別有6種不同的變異。突變植株I在乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的第1913位點(diǎn)發(fā)生突變，由G變?yōu)锳，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第638位由絲氨酸變?yōu)樘於０?，即中雙9號突變植株I的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示沖雙9號突變植株2在乙酰乳酸合成酶(ALSl)基因的第569位點(diǎn)發(fā)生突變，由C變?yōu)門，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第190位由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，即中雙9號突變植株2的ALSl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示沖雙9號突變植株3在乙酰乳酸合成酶(ALSl)基因的第319位點(diǎn)發(fā)生突變，由G變?yōu)锳，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第107位由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，即中雙9號突變植株3的ALSl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。相對于野生型中雙9號，中雙9號突變植株4在ALS基因的第1775位點(diǎn)發(fā)生突變，由G變?yōu)門，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第559位由色氨酸變?yōu)榘腚装彼?，即中雙9號突變植株4的ALSl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其編碼的ALSl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；中雙9號突變植株5在乙酰乳酸合成酶(ALS3)基因的第311位點(diǎn)發(fā)生突變，由C變?yōu)門，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第104位由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，即中雙9號突變植株5的ALS3基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO: 10所示；中雙9號突變植株6在乙酰乳酸合成酶(ALS3)基因的第536位點(diǎn)發(fā)生突變，由G變?yōu)門，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第179位由脯氨酸變?yōu)榱涟彼?，即中雙9號突變植株6的ALS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。實施例2蛋白突變體的抗咪唑啉酮類除草劑的離體活性測定
參照 Fan ZJ 等的方法(Specific activity determination of acetolactatesynthase from maize (Zea mays L.).參見 Han WN 等編.The Proceedings of the 18th Asia-Pacific Weed Science Society Conference.515 - 522.May 28 -June 2,2001.Beijing Standards Press of China.),提取上述中雙9號的野生型和突變植株的ALS酶，并測定相應(yīng)酶活性被咪唑啉酮類除草劑抑制的比率。過程簡而言之，分別取各植株苗5g切碎后，加入10 mL pH 7的50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(其中含I mmol/L丙酮酸鈉,0.5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L TPP, 10 μ mol/L FAD),用石英砂研磨粉碎后用 8 層紗布過濾，濾液于4°C、20000rpm離心30分鐘。取上清液，加入硫酸銨使之達(dá)到50%飽和度，然后0°C放置2小時后，于4°C、20000rpm離心30分鐘。棄上清液，將沉淀溶解于5mL pH 7的 50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4 緩沖液(其中含 20mmol/L 丙酮酸鈉，0.5 mmol/L MgCl2)，分別得各植株的ALS酶液。將0.1mL 0.345% “滅草煙”水劑(對照用水替代)、0.5mL酶反應(yīng)液(其中含 24 mmol/L丙麗酸納,0.6 mmol /T, MgCl2,1 mmol/L TPP, 20 μ mol/L FAD, 50 mmol/LK2HPO4-KH2PO4, pH 7)和0.4 mL ALS酶液混合，與35°C避光靜置反應(yīng)I小時，然后加入0.1mL3mol/L硫酸終止反應(yīng)，于60°C放置15分鐘脫羧。然后加入顯色劑(0.5ml 0.5% (w/w)肌酸和0.5 ml 5% (w/w) α -萘酚的混合溶液(溶于2.5mol/L的NaOH溶液))于60°C放置15分鐘顯色，測定525 nm處的吸光度。將加入對照的野生型中雙9號的ALS酶活性分別記為100%,計算咪唑啉酮類除草劑對中雙9號的野生型和突變ALS酶的活性的影響。結(jié)果如下表所示，中雙9號的突變ALS酶都基本保持了野生型ALS酶的活性，而且在存在咪唑啉酮類除草劑的情況下，野生型ALS酶的活性都有十分顯著的下降，而突變ALS酶卻都基本保持了原有酶活性，表明突變ALS酶能夠帶來抗咪唑啉酮類除草劑的性能。咪唑啉酮類除草劑對中雙9號的野生型和突變ALS酶活性的影響表
權(quán)利要求
1.ALS突變蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或4或6或8或10或12所示。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優(yōu)選是滅草煙。
3.權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其來自油菜，如甘藍(lán)型油菜，如中雙9號。
4.核酸，其編碼權(quán)利要求f3之任一所述的蛋白質(zhì)，優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID NO:I或3或5或7或9或11所示。
5.表達(dá)盒、載體或細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4所述的核酸。
6.權(quán)利要求f3之任一所述的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求4所述的核酸、權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒、載體或細(xì)胞、包含權(quán)利要求4所述的核酸的植物、表達(dá)權(quán)利要求f 3之任一所述的蛋白質(zhì)的植物、或者中雙9號在獲得具有除草劑抗性的植物中的應(yīng)用，優(yōu)選其中除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優(yōu)選是滅草煙。
7.獲得具有除草劑抗性的植物的方法，其包括如下步驟: (1)使植物包含權(quán) 利要求4所述的核酸；或， (2)使植物表達(dá)權(quán)利要求f3之任一所述的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其包括轉(zhuǎn)基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。
9.權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用或方法，其中所述植物是油菜。
10.鑒定植物的方法，其中植物是包含權(quán)利要求4所述的核酸的油菜、表達(dá)權(quán)利要求1 3之任一所述的蛋白質(zhì)的油菜、或者權(quán)利要求7、8或9所述的方法獲得的植物(如，油菜)，其包括如下步驟:其包括如下步驟: (1)測定所述植物是否包含權(quán)利要求4所述的核酸；或， (2)測定所述植物是否表達(dá)權(quán)利要求f3之任一所述的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了使植物具有除草劑抗性的ALS蛋白質(zhì)序列及其應(yīng)用，其衍生自甘藍(lán)型油菜品種中雙9號的突變株，其氨基酸序列如SEQIDNO2、4、6、8、10或12所示。另外，本發(fā)明還提供了相應(yīng)的核酸、表達(dá)盒、載體、細(xì)胞、植物、獲得具有除草劑抗性的植物的應(yīng)用和方法、以及鑒定本發(fā)明的植物的方法。
文檔編號C12N5/10GK103215243SQ201310116228
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者劉東風(fēng), 王承旭, 唐曉艷, 鄧興旺 申請人:深圳興旺生物種業(yè)有限公司, 深圳市作物分子設(shè)計育種研究院