專利名稱：基于液相芯片檢測傳染性造血器官壞死病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的引物對、引物探針組合物以及它們的應用，具體涉及基于液相芯片檢測傳染性造血器官壞死病毒的方法。
背景技術：
傳染性造血器官壞死癥(IHN)是被列為《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》的二類傳染病，是《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定的三類疫病，是國際獸疫局OIE名錄中的重要疫病。
魚傳染性造血器官壞死癥是由傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)引起的。IHNV為RNA病毒，是彈狀病毒科成員，大約120-180nm長。IHNV可侵害多種海水和淡水養(yǎng)殖魚類，在歐、美、日、韓及部分亞洲國家流行，可通過魚體及所產(chǎn)卵、精液、尿、糞便以及污染的飼料、水等傳播，對養(yǎng)殖場造成致命打擊，危害非常嚴重。
目前魚類病毒的檢測方法主要包括細胞學診斷技術、免疫學診斷技術、分子生物學診斷技術三大類。細胞學診斷技術主要包括采用細胞培養(yǎng)分離病毒、組織病理切片及電鏡觀察，其操作繁瑣、檢測周期長、且靈敏度低。免疫學診斷技術主要包括免疫熒光檢測、免疫點雜交，具有特異性強、敏感性高的優(yōu)點，但步驟相當繁瑣，不適宜對大量樣品進行檢測。分子生物學診斷技術主要包括聚合酶鏈式反應(PCR)，快速、靈敏，但是需要進行瓊脂糖凝膠電泳并通過溴化乙錠染色觀察結果，溴化乙錠是致癌物，對人體和環(huán)境有危害，交叉污染問題比較嚴重。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供輔助鑒定傳染性造血器官壞死癥病毒的引物對、引物探針組合物以及它們的應用，具體涉及基于液相芯片檢測傳染性造血器官壞死病毒的方法。
本發(fā)明提供的輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的特異引物對，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
本發(fā)明還提供了輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的引物探針組合物，由所述特異引物對和探針Tl組成；所述探針Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
所述特異引物對或所述引物探針組合物可用于制備輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的試劑盒。
所述特異引物 對或所述引物探針組合物可用于輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒。
本發(fā)明還保護一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的試劑盒，包括所述特異引物對或所述弓I物探針組合物。
本發(fā)明還保護一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的總RNA為模板，用所述特異引物對進行RT-PCR擴增；如果所述RT-PCR擴增得到了擴增產(chǎn)物，待測病毒為候選的傳染性造血器官壞死病毒；如果所述RT-PCR擴增沒有得到擴增產(chǎn)物，待測病毒為候選的非傳染性造血器官壞死病毒。所述擴增產(chǎn)物的大小可為100-250bp之間，具體可為126bp。所述待測病毒可為傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒或病毒性神經(jīng)壞死病病毒。本發(fā)明還保護另一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的總RNA為模板，用所述特異引物對進行RT-PCR擴增后與所述探針Tl進行雜交，如果雜交結果為陽性待測病毒為候選的傳染性造血器官壞死病毒，如果雜交結果為陰性待測病毒為候選的非傳染性造血器官壞死病毒。所述待測病毒可為傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒或病毒性神經(jīng)壞死病病毒。所述輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法具體包括如下步驟(液相芯片法):(1)以待測病毒的總RNA為模板，用所述特異引物對進行RT-PCR擴增；(2)制備微球懸液①將表面羧基化的熒光編碼微球漩渦振蕩20s，取75 μ L (約含3 X 1O6個微球)置于1.5mL離心管中，1OOOOg離心1min,棄上清；②在步驟①的離心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，漩渦混合，超聲波處理30-60秒(400W的功率，每超聲9秒停6秒)；③在步驟②的離心管中加入1.0nmol所述探針Tl，漩渦混合；④在步驟③的離心管中加入2.5 μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法:將IOmg碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配)充分混勻，室溫避光孵育30min ；⑤在步驟④的離心管中加入2.5μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法同上)充分混勻，室溫避光孵育30min ；⑥在步驟⑤的離心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混勻，1OOOOg離心1min,棄上清；⑦在步驟⑥的離心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混勻，1OOOOg離心1min,棄上清；⑧在步驟⑦的離心管中加入100 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重懸，得到微球懸液；(3)將步驟(1)的產(chǎn)物和步驟(2)得到的微球懸液進行雜交即為實驗組，用TE緩沖液代替步驟(1)的產(chǎn)物即為對照組；將雜交體系混合均勻后于98°C變性lOmin，然后在與雜交溫度相同的溫度下孵育15min，18000g離心2min，棄上清；然后加入50 μ L用1 X TMAC雜交液稀釋至500倍體積的SA-PE，48°C -54°C (優(yōu)選為52°C)雜交15min，18000g離心2min，棄上清；然后加入50 μ L1 X TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，置于BD FACSArray液相芯片儀中進行分析；如果LQRR ≥ 3，檢測結果為陽性；如果LQRR < 2，檢測結果為陰性；LQRR=MFIS/MFIB, MFIS為實驗組的熒光強度中位值，MFIB為對照組的熒光強度中位值。RT-PCR 擴增的反應程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 個循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保溫。液相芯片是一種新型快速檢測技術，集流式細胞術、納米熒光微球、熒光信號數(shù)字處理和傳統(tǒng)化學發(fā)光技術為一體，具有所需樣本量少、檢測周期短的優(yōu)點。采用本發(fā)明提供的特異引物對鑒定傳染性造血器官壞死病毒具有良好的特異性。采用本發(fā)明提供的引物探針組合物結合液相芯片鑒定傳染性造血器官壞死病毒，除了良好的特異性外，還具有靈敏度高、操作簡便、所需時間短、不污染環(huán)境、不存在對人的健康威脅，可以進行高通量檢測的優(yōu)點。本發(fā)明非常適合對進出境水生動物進行檢測。


圖1為實施例2中的電泳圖。
圖2為雜交溫度為52°C時，BD FACSArray液相芯片儀的輸出圖譜。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
N-甲基咪唑(TE)、碳二亞胺購置美國BD公司。DL2000marker購于大連寶生物公司。RNA 提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver4.0):大連寶生物公司，貨號為DV819A。RT-PCR試劑盒(PrimeScript RT-PCR Kit):大連寶生物公司，貨號為DRR014S。表面羧基化的熒光編碼微球:美國BD公司，貨號為558578。TMAC(temtrameihyl-ammdnium chloride):美國Sigma公司，貨號為87718 ;按照產(chǎn)品說明書配制1父丁祖(:雜交液和1.5\丁祖(:雜交液。SA-PE (鏈霉菌抗生物素蛋白一藻紅蛋白):美國Sigma公司，貨號為S6940。Alphamager 2200凝膠成像系統(tǒng):美國AP公司。梯度PCR擴增儀(Eppendorf Mastercycler Gradi ent):德國 Eppendorf 公司。BD FACSArray 液相芯片儀:美國BD公司。
傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)，RNA病毒:參考文獻:岳志芹；劉葒；梁成珠等實時定量RT-PCR檢測魚類傳染性造血器官壞死病毒方法的建立與應用[J].水生生物學報.2008 (01)。
病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)，RNA病毒，參考文獻:悅穗；余曉??；王建平等；應用巢式逆轉錄聚合酶鏈反應檢測魚類病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV) [J]海洋與湖沼2009(07)。
鯉春病毒血癥病毒(SVCV)，RNA病毒，參考文獻:付峰；劉葒；黃佳；蔡生力鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的研究進展[J]中國水產(chǎn)科學.2006 (02)。
傳染性胰臟壞死病病毒(IPNV)，RNA病毒，參考文獻:徐曄；段宏安；周毅實時熒光定量RT-PCR檢測魚類傳染性胰臟壞死病病毒方法的建立安徽農(nóng)業(yè)科學2011 (11)。
病毒性神經(jīng)壞死病病毒(VNNV)，RNA病毒，參考文獻:劉葒；史秀杰；高隆英等.魚病毒性神經(jīng)壞死病病毒(VNNV)不同基因型鑒別方法的建立及在VNN檢疫和監(jiān)測中的應用.[J]水產(chǎn)學報2004(06)。
實施例1、特異引物對和特異探針的設計
通過大量序列比對和擴增效果比較，設計用于擴增傳染性造血器官壞死癥病毒的特異引物對和特異探針。
特異引物對如下(靶序列為126bp):
Fl (序列表的序列 I):5’ -ACGGAGTATCGTCCCAGTA-3’ ；Rl (序列表的序列 2):5’ -GAGGCTCAATGCCTTTCT-3’。特異探針的核苷酸序列(序列表的序列3)如下:5’ -TCCTCCGACTTGACTCACCGC-3’。實施例2、應用特異引物對輔助鑒定傳染性造血器官壞死癥病毒分別將傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒和病毒性神經(jīng)壞死病病毒作為待測病毒進行如下實驗:1、采用RNA提取試劑盒提取待測病毒的總RNA。2、以步驟I得到的總RNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對，采用RT-PCR試劑盒，在梯度PCR擴增儀上進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產(chǎn)物。RT-PCR擴增的反應體系:在0.2mL PCR反應管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L、dNTP(各 2.5mmol/L)2.5 μ L、IOpmoI / μ L F10.5 μ L、IOpmoI / μ L RI0.5 μ L、Inhibiter0.5μ L、AMV XL0.5μ L, AMV Taq (5U/μ L) 0.5 μ L、25mmol/L MgCl25.0 μ L、總RNA3.0μ L (約300ng)，加入雙蒸水使反應體積達到25 μ L。以上反應體系中，除了引物、總RNA和雙蒸水，其它組分均為RT-PCR試劑盒的組分。RT-PCR 擴增的反應程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 個循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保溫。3、將步驟2得到的RT-PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖見圖1，泳道I至泳道5依次為病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒、傳染性造血器官壞死病毒和病毒性神經(jīng)壞死病病毒，泳道M為DL2000markero以傳染性造血器官壞死病毒的總RNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對進行RT-PCR，得到了大小在100-250bp之間擴增產(chǎn)物，其它四種病毒均未得到任何擴增產(chǎn)物。將傳染性造血器官壞死病毒的擴增產(chǎn)物進行測序，測序結果表明，擴增產(chǎn)物的大小為126bp。實施例3、應用引物探針組合物輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒一、引物和探針的制備制備如下引物和探針:F2:5’ -biotin-ACGGAGTATCGTCCCAGTA-3’ ；R2:5’ -biotin-GAGGCTCAATGCCTTTCT-3’。探針T1: 5，-NH2-TCCTCCGACTTGACTCACCGC-3 ’。F2是在Fl的5’末端進行生物素標記得到的，R2是在Rl的5’末端進行生物素標記得到的。探針Tl是在序列表的序列3所示單鏈DNA片段的5’末端進行氨基化修飾得到的。二、液相芯片檢測體系的建立1、采用RNA提取試劑盒提取傳染性造血器官壞死病毒的總RNA。2、以步驟I得到的總RNA為模板，采用F2和R2組成的引物對，采用RT-PCR試劑盒，在梯度PCR擴增儀上進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產(chǎn)物。RT-PCR擴增的反應體系:在0.2mL PCR反應管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L、dNTP(各 2.5mmol/L)2.5 μ L、IOpmoI / μ L F20.5 μ L、IOpmoI / μ L R20.5 μ L、Inhibiter0.5μ L、AMV XL0.5 μ L、AMV Taq (5U/μ L) 0.5 μ L、25mmol/L MgCl25.0 μ L、總RNA3.Ομ L (約300ng)，加入雙蒸水使反應體積達到25 μ L。以上反應體系中，除了引物、總RNA和雙蒸水，其它組分均為RT-PCR試劑盒的組分。
RT-PCR 擴增的反應程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 個循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保溫。
3、寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)
①將表面羧基化的熒光編碼微球漩渦振蕩20s以使其充分分散，取75 μ L (約含3 X IO6個微球)置于1.5mL離心管中，IOOOOg離心lmin，棄上清。
②在步驟①的離心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，漩渦混合，超聲波處理30-60秒(400W的功率，每超聲9秒停6秒)。
③在步驟②的離心管中加入1.0nmol探針Tl，漩渦混合。
④在步驟③的離心管中加入2.5 μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法:將IOmg碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配)充分混勻，室溫避光孵育30min。
⑤在步驟④的離心管中加入2.5μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的制備方法同上)充分混勻，室溫避光孵育30min。
⑥在步驟⑥的離心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清。
⑦在步驟⑤的離心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清。
⑧在步驟⑦的離心管中加入100 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重懸微球(探針已偶聯(lián)至微球表面)，得到微球懸液，2-8°C避光保存，待用。
4、雜交
實驗組的雜交體系:由1.5 μ L步驟3得到的微球懸液、33 μ L1.5 X TMAC雜交液、9 μ L TE緩沖液和8 μ L步驟2得到的RT-PCR擴增產(chǎn)物(即25微升RT-PCR擴增產(chǎn)物的二十五分之八)組成。
空白對照組的雜交體系:用等體積的TE緩沖液代替RT-PCR擴增產(chǎn)物，其它同實驗組的雜交體系。
將雜交體系混合均勻后于98°C變性lOmin，然后在與雜交溫度相同的溫度下孵育15min，18000g離心2mi n，棄上清；然后加入50 μ L用IXTMAC雜交液稀釋至500倍體積的SA-PE，選定溫度下雜交15min (分別采用481:、501:、521:、541:或561:的雜交溫度)，18000g離心2min，棄上清；然后加入50 μ LI X TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，置于BDFACSArray液相芯片儀中進行分析。
每個雜交溫度的實驗組設置三個重復處理，每個雜交溫度的空白對照組設置三個重復處理。
每個重復處理中:參與計數(shù)的熒光編碼微球均在100個以上，表明用于計算的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的熒光強度中位值(MFI)可信；3個空白對照組的熒光編碼微球的MFI值均小于500，試驗可進行結果判斷。
采用48 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為258，實驗組處理的MFI為3167±11.7。
采用50 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為269，實驗組處理的MFI為3193±15.9。采用52 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為263，實驗組處理的MFI為3306±26.1。采用54 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為267，實驗組處理的MFI為2891±19.9。采用56 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為266，實驗組處理的MFI為1287±28.6。結果表明:采用48°C _54°C的雜交溫度，實驗組處理的MFI變動幅度不大，采用高于54°C的雜交溫度時，實驗組處理的MFI下降劇烈，最佳雜交溫度為52°C。雜交溫度為52°C時，BD FACSArray液相芯片儀的輸出圖譜見圖2。圖2中:A:熒光編碼微球的數(shù)量及范圍:采用52°C的雜交溫度，實驗處理組在Red-A、YelloW-A通道下的相對熒光強度； C:采用52°C的雜交溫度，實驗處理組在Red-A通道下相對熒光強度；D:采用52°C的雜交溫度，實驗處理組在Yellow-A通道下相對熒光強度。從圖2可以觀察到，偶聯(lián)在微球上的探針Tl與傳染性造血器官壞死病毒的RT-PCR擴增產(chǎn)物在Red-A、Yel1w-A檢測通道下均有熒光信號，表明液相芯片構建成功。三、液相芯片檢測體系重復性驗證重復進行三次步驟二，雜交溫度均采用52°C，計算各批次間檢測得到的MFI的變異系數(shù)。結果顯示，變異系數(shù)在6.7%以內，表明步驟二的方法具有良好的可重復性。四、液相芯片檢測體系的特異性驗證分別將傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒和病毒性神經(jīng)壞死病病毒作為待測病毒進行步驟二，雜交溫度均采用52°C，結果見表I。表I特異性檢測結果
Imfi~
IHNV 3291+21.5+
IPNV 99 + 4.8~
VHSV 190 + 5.7~
SVCV 205 + 9.4~
VNNV 186 + 3.7~
MFIB 264~結果表明，步驟二的方法對傳染性造血器官壞死病毒的檢測結果為陽性，而對其它四種病毒的檢測結果均為陰性，具有很好的特異性。五、液相芯片檢測體系靈敏度驗證
1、采用RNA提取試劑盒提取傳染性造血器官壞死病毒的總RNA。
2、以步驟I得到的總RNA為模板，采用F2和R2組成的弓I物對，采用RT-PCR試劑盒，在梯度PCR擴增儀上進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產(chǎn)物。
RT-PCR擴增的反應體系:在0.2mL PCR反應管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L、dNTP(各 2.5mmol/L)2.5 μ L、IOpmoI / μ L F20.5 μ L、IOpmoI / μ L R20.5 μ L、Inhibiter0.5μ L、AMV XL0.5 μ L、AMV Taq (5U/μ L) 0.5 μ L、25mmol/L MgCl25.0 μ L、總RNA3.0 μ L (含約 31.25ng、3.125ng、312.5pg、31.25pg、3.125pg、312.5fg、31.25fg 或3.125fg RNA)，加入雙蒸水使反應體積達到25 μ L。以上反應體系中，除了引物、總RNA和雙蒸水，其它組分均為RT-PCR試劑盒的組分。
RT-PCR 擴增的反應程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 個循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保溫。
3、寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)
同步驟二的3。
4、雜交
同步驟二的4。雜交溫度采用52°C。
結果見表2,最低檢測限為lOOpg。
表2靈敏度檢測結果
權利要求
1.輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的特異引物對，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成。
2.輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的引物探針組合物，由權利要求1所述特異引物對和探針Tl組成；所述探針Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.權利要求1所述特異引物對或權利要求2所述引物探針組合物在制備輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的試劑盒中的應用。
4.權利要求1所述特異引物對或權利要求2所述引物探針組合物在輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒中的應用。
5.輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的試劑盒，包括權利要求1所述特異引物對或權利要求2所述引物探針組合物。
6.一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的總RNA為模板，用權利要求1所述特異引物對進行RT-PCR擴增；如果所述RT-PCR擴增得到了擴增產(chǎn)物，待測病毒為候選的傳染性造血器官壞死病毒；如果所述RT-PCR擴增沒有得到擴增產(chǎn)物，待測病毒為候選的非傳染性造血器官壞死病毒。
7.一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的總RNA為模板，用權利要求1所述特異引物對進行RT-PCR擴增后與權利要求2所述引物探針組合物中的探針Tl進 行雜交，如果雜交結果為陽性待測病毒為候選的傳染性造血器官壞死病毒，如果雜交結果為陰性待測病毒為候選的非傳染性造血器官壞死病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于液相芯片檢測傳染性造血器官壞死病毒的方法。本發(fā)明提供了輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的特異引物對，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還保護輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的引物探針組合物，由所述特異引物對和探針T1組成；所述探針T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。采用本發(fā)明提供的特異引物對鑒定傳染性造血器官壞死病毒具有良好的特異性。采用本發(fā)明提供的引物探針組合物結合液相芯片鑒定傳染性造血器官壞死病毒，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、所需時間短、不污染環(huán)境、不存在對人的健康威脅，可以進行高通量檢測的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/70GK103173569SQ201310116510
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權日2013年4月3日
發(fā)明者尹偉力, 鄭小龍, 方紹慶, 賈鵬, 劉寧, 王穎 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心