一株產(chǎn)黑曲霉葡萄糖氧化酶的畢赤酵母菌及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)葡萄糖氧化酶酵母工程菌及構建方法與應用,屬于基因工程【技術領域】。本發(fā)明采用重組DNA技術將黑曲霉accc30161的葡萄糖氧化酶(GOD)基因克隆連接到含3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子的畢赤酵母分泌型表達載體pGAPZαA,并轉化Pichia?pastoris?KM71,經(jīng)篩選鑒定得到一株可以產(chǎn)較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母KM71-GOD。該菌株在3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子的調(diào)控下表達的葡萄糖氧化酶在酶活達107U/mL,為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)及應用奠定了良好的基礎。
【專利說明】一株產(chǎn)黑曲霉葡萄糖氧化酶的畢赤酵母菌及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術領域】,特別是涉及巴斯德畢赤酵母的新的菌株KM71-G0D 以及該菌株的應用。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,G0D)是一種需氧脫氫酶,廣泛應用于蛋白脫糖、 葡萄糖定量分析、醫(yī)用檢測、食品工業(yè)及生物傳感器等多種領域。目前G0D主要從黑曲霉和 青霉中制備純化,但產(chǎn)量低、純化工藝繁雜,因此用基因工程方法構建更優(yōu)良的G0D生產(chǎn)菌 株一直受到高度重視。
[0003] 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)是目前應用最廣泛的外源基因真核 表達系統(tǒng)之一,其蛋白表達量高,且被表達的蛋白中雜蛋白少。畢赤酵母還具有能夠嚴格調(diào) 控外源蛋白的表達,對表達產(chǎn)物進行加工、折疊和翻譯后修飾,及可將外源蛋白分泌至胞外 等優(yōu)點。
[0004] 宿主菌的選擇顯著影響外源基因的表達。KM71是蛋白酶缺陷性菌株,特別適用于 分泌性表達載體,其P印4基因突變,缺失蛋白水解酶活性,而P印4編碼的蛋白酶A可激活 一系列蛋白酶,因此用KM71表達外源蛋白,可有效降低表達產(chǎn)物降解,提高表達量。研究顯 示使用蛋白酶缺陷菌株表達5-HT5A、乳糖酶等外源蛋白時,蛋白產(chǎn)量得到成倍增加。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本研究利用從黑曲霉aCCC30161克隆的G0D基因構建了含3-磷酸甘油醛脫氫酶 基因啟動子(glyceraldehyde-3-phosphate dehygrogenase gene promoter,pGAP)的分泌 型表達載體,并用其轉化了畢赤酵母蛋白酶缺陷性菌株KM71,實現(xiàn)葡萄糖氧化酶的高效分 泌表達。
[0006] 本發(fā)明的畢赤酵母KM71-G0D,是一種全新的菌株,該菌株能夠高效表達葡萄糖氧 化酶。
【具體實施方式】
[0007] 1材料與方法
[0008] 1. 1 材料
[0009] 1. 1. 1菌株和質粒
[0010] 黑曲霉aCCC30161由山東師范大學生命科學院生物技術系戴美學教授提供;畢赤 酵母KM71及質粒pGAPZaA購自Invitrogen公司;大腸桿菌DH5a購于北京全式金生物技 術有限公司。
[0011] 1.1.2 試劑
[0012] 限制性內(nèi)切酶Notl、ΚρηΙ和EcoRI為TaKaRa公司產(chǎn)品;T4DNA連接酶和限制性 內(nèi)切酶Avr II為Fermentas公司產(chǎn)品;2XEasy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物 技術有限公司;引物合成和基因序列測定由深圳華大基因公司完成;GOD標準品購自Sigma 公司;兔抗黑曲霉GOD -抗為Abeam公司廣品;HRP標記的山羊抗兔_抗購自北點中杉金橋 生物技術有限公司;PVDF膜及ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司;Omega SP Fungal DNA kit試劑盒、質粒小量提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;BCA蛋白含 量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。
[0013] 1.1.3引物設計
[0014] 根據(jù)Genebank中的多個黑曲霉G0D序列,利用Primer Premier5. 0軟件設計引物 P1和P2 (表1),以從黑曲霉accc30161基因組中擴增出含G0D基因的約2. Okb DNA片段。 該DNA片段經(jīng)擴增并測序后,根據(jù)測序結果及質粒pGAPZ α A上的多克隆位點,設計引物P3 和P4 (表1),擴增具有酶切位點的G0D基因。
[0015] 1.2實驗方法
[0016] 1. 2. 1黑曲霉基因組提取
[0017] 將黑曲霉aCCC30161在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L)中 26°C振蕩培養(yǎng)2天,離心后用無菌雙蒸水洗滌菌體3次,將菌體在液氮中研磨至粉狀,用 Omega SP Fungal DNA kit試劑盒提取基因組DNA。
[0018] 1. 2. 2黑曲霉G0D基因擴增與測序
[0019] 以黑曲霉基因組DNA為模板,以P1、P2為上下游引物進行PCR擴增。反應體系包 含:2XEasy Taq PCR SuperMix25yL,黑曲霉基因組DNA2yL,上下游引物各2yL,無菌雙 蒸水19yL。反應條件為:94°C預變性3min,然后94°C變性30s、50°C退火30s、72°C延伸 2min,反應30個循環(huán),最后72°C延伸10min。反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測序。 1. 2. 3重組質粒的構建
[0020] 以黑曲霉基因組DNA為模版,用引物P3和P4進行PCR擴增,反應體系及條件 同1.2.2。?0?產(chǎn)物回收并用邱111和此七1雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的?64?2 〇六質粒 以3 : l(w/w)混合,并用T4DNA連接酶22°C過夜連接。用連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌 DH5a,然后在含25μ8/ιΛ Zeocin的低鹽LB平板(蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉4g/ L及瓊脂粉15g/L)上篩選陽性菌落。用含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)陽 性菌并提取質粒,用PCR擴增和EcoR I酶切分析篩選出G0D基因以正確方向插入pGAPZ a A 的重組子pGAPZaA-GOD,并對其進行測序。其中PCR擴增所用方法同1.2.2,所用引物為 pGAP 和 3' A0X1 (表 1)。
[0021] 表1本研究所用引物序列
[0022]
【權利要求】
1. 一種重組畢赤酵母KM71-G0D,利用基因工程方法構建重組質粒,并將其電擊轉化畢 赤酵母,構建高質高產(chǎn)的黑曲霉葡萄糖氧化酶巴斯德畢赤酵母KM71-G0D。
2. 根據(jù)權利要求1所述的畢赤酵母KM71-G0D,其特征是將黑曲霉accc30161葡 萄糖氧化酶基因擴增后插入pGAPZa A質粒,構建了畢赤酵母葡萄糖氧化酶表達載體 pGAPZ a A-GOD。pGAPZ a A-GOD經(jīng)菌落聚合酶鏈式反應擴增、重組質粒瓊脂糖凝膠電泳、限制 性酶切分析及測序等方法驗證后,被用于轉化畢赤酵母KM71-G0D。
3. 根據(jù)權利要求1所述的畢赤酵母,其特征是葡萄糖氧化酶蛋白表達量高,且被表達 的蛋白中雜蛋白少,并可將蛋白分泌至細胞外,有利于純化回收。
【文檔編號】C12N15/81GK104099259SQ201310116715
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月7日 優(yōu)先權日:2013年4月7日
【發(fā)明者】畢文祥, 邱占軍, 孔峰 申請人:畢文祥, 邱占軍, 孔峰