專利名稱：植酸酶玉米phyA2基因檢測用質(zhì)粒分子pPZ的構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子PPZ的構(gòu)建及其在轉(zhuǎn)基因玉米定量檢測中的應(yīng)用，屬于分子生物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植酸酶(phytase)，是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，系統(tǒng)名稱為肌醇六磷酸酶，屬于磷酸單脂水解酶，是一類特殊的酸性磷酸酶，能水解植酸最終釋放出無機磷。在植物來源的動物飼料中，大部分磷酸鹽是以植酸的形式存在的。而單胃動物例如豬和家禽缺少分解植酸的酶。在動物飼料中添加異種植酸酶可以改良磷酸鹽的生物利用度，消除植酸的抗營養(yǎng)作用；減少磷在環(huán)境中的排泄，由此降低了農(nóng)業(yè)生態(tài)的負擔，并減緩了水生環(huán)境的富營養(yǎng)化；同時也減少了動物飼料中無機磷的添加，后者是一種不可再生的資源。利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)植酸酶的研究由來已久，比如來源于WT煙曲霉的植酸酶和經(jīng)過改造的熱穩(wěn)定植酸酶已經(jīng)在小麥和大麥中成功表達；來源于無花果曲霉的植酸酶也已在煙草，苜蓿和馬鈴薯葉片中成功表達。我國科學家通過分離來自黑曲霉的植酸酶基因phyA2并構(gòu)建到玉米特異表達載體上，得到了 27個表達植酸酶并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因玉米純合系。其種子中植酸酶活性均在1000U / kg以上，最高達到120000U / kg，完全達到中國飼料工業(yè)標準(Ikg玉米添加IOOOu植酸酶)的要求，可以替代傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)的植酸酶添加劑。以玉米為載體生產(chǎn)的植酸酶直接用于飼料加工，實現(xiàn)了以環(huán)保、節(jié)能的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式生產(chǎn)“綠色磷”的夢想，具有巨大的產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢和應(yīng)用前景。標準分子的概念由日本科學家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測目的外源基因和內(nèi)標準基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)驗證質(zhì)粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準陽性物質(zhì)替代物。質(zhì)粒分子的優(yōu)點主要是可以通過微生物進行大量培養(yǎng)，DNA易于擴增，所以可提供無限穩(wěn)定量的標準物質(zhì)，并且純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因，經(jīng)濟又高效。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種適用于轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性實時熒光定量PCR檢測的質(zhì)粒分子pPZ，本發(fā)明還提供了其構(gòu)建方法，以及其在定量檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ，其空白載體為質(zhì)粒載體pMD19_T載體，包含有轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列，該質(zhì)粒分子的序列如下:CCAATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTGT CCGGTGTGACTCTCACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGAC ACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCA TGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCTTGAAAAAGTATTACGGCCATGGTG CAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTG ATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAA CCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT，如序列表中 I 所示。所述植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ的構(gòu)建方法為:首先，設(shè)計特異性PCR引物，從植酸酶玉米模板DNA中擴增獲得轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列，然后，利用分子克隆技術(shù)將這兩段DNA片段構(gòu)建到PMD19-T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子pPZ(常規(guī)方法，工藝步驟均為常規(guī)的，但PCR特異性引物和新的質(zhì)粒分子序列為本發(fā)明的發(fā)明點之一)。具體構(gòu)建步驟如下:(I)設(shè)計PCR特異性引物:利用GenBank等數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析，獲得轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列，根據(jù)序列設(shè)計PCR特異性引物；(2)獲取目的片段:利用上述PCR特異性引物特異性的擴增目的片段:轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列；回收這兩個目的片段，以此為模板采用引物C-phyA2-lF/C-zSSIIb-2R 進行重疊 PCR 擴增；(3)質(zhì)粒的構(gòu)建:上述得到的PCR產(chǎn)物回收后，通過連接酶連接到pMD19-T載體(2692bp)上；連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci，采用凝膠電泳法鑒定陽性質(zhì)粒并測序驗證，鑒定為陽性質(zhì)粒的即為植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ。所述步驟(I)中，PCR特異性引物為兩對，序列如下: C-phyA2-lF:5，-CCAATTTCACCGCCACG-3，；C-phyA2-2R:5’-GCGGGCTCTGGCTTCAGGTTACCTGCACCATGGCC-3’ ；C-zSSIIb-lF:5’-GGCCATGGTGCAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGC-3’ ；C-zSSIIb-2R:5’-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3’ ；如序列表中 2、3、4、5 所示。所述步驟(2)中，獲取目的片段的具體步驟如下:擴增所用引物為C-phyA2-lF/C-phyA2-2R 和 C-zSSIIb-lF/C-zSSIIb_2R，擴增體系為PremixExTaq (Takara) 20 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各2.5 μ L,植酸酶玉米模板 DNA(50ng/yL)2yL，加水補足至 50yL;反應(yīng)程序為:95°C 5min ；95°C 30s, 58 °C 30s，72°C 30s，35個循環(huán)；72°C 7min。重疊PCR擴增的擴增體系和反應(yīng)程序如下:擴增體系為PremixrTaq(Takara) 15 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各 1.5 μ L,回收的目的片段 2 μ L,加水補足至 30yL ;反應(yīng)程序為:95°C 5min ；95 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C 45s，35 個循環(huán)；72 °C 7min。本發(fā)明所構(gòu)建的質(zhì)粒分子pPZ，可用于轉(zhuǎn)植酸酶基因的定性、定量檢測；定量檢測包括SYBRGreenI實時熒光定量檢測和TaqMan探針實時熒光定量檢測。定性檢測時，方法如下:首先，提取待檢測樣品的基因組DNA，以此為模板，使用phyA2基因特異性引物進行PCR擴增，以植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ作為陽性對照；然后，待檢測樣品的PCR擴增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產(chǎn)物，若存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品中含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因；若不存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因。所述PhyA2基因特異性引物序列如下:
phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ ；phyA2-2R: 5’ -GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’，如序列表中 6、7 所示。SYBRGreenI實時熒光定量檢測時，具體方法如下:(I)建立phyA2基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBR GreenI實時熒光定量PCR標準曲線:①對質(zhì)粒分子pPZ進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入phyA2基因特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標準引物，進行擴增；②擴增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶基因玉米phyA2基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入phyA2基因特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標準引物，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的phyA2基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標準基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的百分含量。所述步驟(I)①和(2)中，zSSIIb引物序列(國家標準)如下:
zSSIIb-F:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ ；zSSIIb-R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ 。所述步驟(I)①和(2)中，擴增的參數(shù)如下:擴增反應(yīng)體積為20μ L，2 X PremixExTaq (Rox) 10 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forwardprimer0.4 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverseprimer0.4 μ L, ddH208.2 μ L, DNA 模板 I μ L ;擴增反應(yīng)條件:95°C IOmin 預變性；95°C 15s，60。。30s，在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。所述PhyA2基因特異性引物序列如下:phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ ；phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'。TaqMan探針實時熒光定量檢測時，方法如下:(I)建立植酸酶玉米phyA2基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線:①對質(zhì)粒分子pPZ進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入phyA2基因特異性引物和熒光標記探針，以及zSSIIb基因的國家標準引物和熒光標記探針，進行擴增；②擴增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶基因玉米phyA2基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入phyA2基因特異性引物和熒光標記探針，以及zSSIIb基因的國家標準引物和熒光標記探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的定量PCR標準曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標準基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的百分含量。所述步驟(I)①和(2)中，zSSIIb引物和探針序列(國家標準)如下:zSSIIb-lF:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ ；zSSIIb-2R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ ；zSSIIb-P:FAM-5’-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRAo所述步驟(I)①和(2)中，擴增的參數(shù)如下:擴增反應(yīng)體積為20μ L，2 X PremixExTaq (Rox) 12.5 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forwardprimerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverseprimerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 TaqManprobe0.5 μ L, ddH204 μ L, DNA 模板I μ L ;擴增反應(yīng)條件:95°C IOmin預變性；95°C 15s,60°C 30s，在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。所述步驟(I)①和(2)中，MIR162基因特異性引物和探針序列如下:phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ ； phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'；phyA2-P:FAM-5’ -CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3' -Eclipse ;如序列表中 6、7、8 所
/Jn ο 本發(fā)明利用重疊PCR和分子亞克隆的方法首次構(gòu)建了含有轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因和玉米內(nèi)標基因序列的標準質(zhì)粒分子pPZ。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒分子pPZ可用于SYBRGreenI實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米含量，其適用性強，穩(wěn)定性好，對實際樣品分析的結(jié)果比較準確，很好的解決了該品系檢測過程中陽性標準物質(zhì)缺乏的問題，具有極高的應(yīng)用價值與市場前景。


圖1為實施例1中所構(gòu)建質(zhì)粒分子pPZ圖譜。圖2為實施例2中內(nèi)標基因zSSIIb的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線。圖3為實施例2中植酸酶玉米phyA2基因SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線。圖4為實施例3中內(nèi)標基因zSSIIb的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線。圖5為實施例3中植酸酶玉米phyA2基因TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1構(gòu)建質(zhì)粒pPZ步驟如下:(I)設(shè)計PCR特異性引物:利用GenBank等數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析，獲得轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列，根據(jù)序列設(shè)計PCR特異性引物，序列如下:C-phyA2-lF:5’-CCAATTTCACCGCCACG-3’ ；C-phyA2-2R:5’-GCGGGCTCTGGCTTCAGGTTACCTGCACCATGGCC-3’ ；C-zSSIIb-lF:5，-GGCCATGGTGCAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGC-3，；
C-zSSIIb-2R:5’-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'。(2)獲取目的片段:利用上述PCR特異性引物特異性的擴增目的片段:轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列；回收這兩個目的片段，以此為模板采用引物C-phyA2-lF/C-zSSIIb-2R 進行重疊 PCR 擴增；獲取目的片段的具體步驟如下:采用DNA提取試劑盒(Omega)提取植酸酶玉米種子DNA,使用引物C_phyA2_lF/C-phyA2-2R 和 C-zSSIIb-lF/C-zSSIIb_2R 進行 PCR 擴增，擴增體系為 PremixExTaq (Takara) 20 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各 2.5 μ L，植酸酶玉米模板 DNA (50ng/yL)2yL，加水補足至 50yL ;反應(yīng)程序為:95°C 5min ；95 °C 30s,58 °C 30s,72 °C 30s,35個循環(huán)；72 V 7min。重疊PCR擴增的擴增體系和反應(yīng)程序如下:擴增體系為PremixrTaq(Takara) 15 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各 1.5 μ L,回收的目的片段 2 μ L,加水補足至 30μ L ;反應(yīng)程序為:95°C 5min ；95 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C 45s, 35 個循環(huán)；72 °C 7min。(3)質(zhì)粒的構(gòu)建:上述得到的PCR產(chǎn)物回收后，通過連接酶連接到pMD19-T載體(2692bp)上；連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci，采用凝膠電泳法鑒定陽性質(zhì)粒并測序驗證，鑒定為陽性質(zhì)粒的即為植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ，經(jīng)測序，其序列如下:
CCAATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTGT CCGGTGTGACTCTCACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGAC ACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCC A TGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCTTGAAAAAGTATTACGGCCATGGTG CAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTG ATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAA CCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT。所構(gòu)建質(zhì)粒分子pPZ圖譜如圖1所示。實施例2轉(zhuǎn)植酸酶玉米基因特異性SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測方法將質(zhì)粒分子pPZ按5倍倍比分別稀釋至25000、5000、1000、200和40copies/y L，每個濃度設(shè)3個重復，檢測擴增的重復性。引物和探針由大連Takara公司合成,稀釋成10 μ mol/L備用。合成的植酸酶玉米基因特異性引物序列如下:phyA2-lF:5，-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3，；phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'。玉米內(nèi)標引物與探針(zSSIIb)采用國家標準引物，其序列如下:zSSIIb-F:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ ；zSSIIb-R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ 。擴增反應(yīng)體積為20 μ L，擴增反應(yīng)體積為20 μ L，2 XPremixExTaq(Rox)IOyL,濃度為 10 μ mol/L 白勺 Forwardprimer0.4 μ L, 農(nóng)度為 10 μ mol/L 白勺 Reverseprimer0.4 μ L,ddH208.2 μ L, DNA 模板 I μ L。擴增反應(yīng)條件:95 °C IOmin 預變性；95 °C 15s, 50 °C 30s,72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計40循環(huán)。每個試樣重復3次，同時設(shè)立無菌雙蒸水(ddH20，空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品(鄭單958，陰性)對照。結(jié)果:通過對不同植酸酶玉米標準品拷貝數(shù)為25000、5000、1000、200和40的DNA進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR擴增，計算機軟件自動生成標準曲線，縱坐標為Ct，橫坐標為起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)。根據(jù)標準曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的植酸酶玉米標準品(3%，1%, 0.5%, 0.1%)、陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對玉米內(nèi)標準基因zSSIIb和轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的基因特異性引物對同一組標準品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR擴增，分別得至IJ PCR擴增曲線，并由系統(tǒng)軟件自動生成標準曲線。玉米內(nèi)標準基因zSSIIb的標準曲線如圖2示，該曲線的斜率為-3.388，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性引物的標準曲線如圖3示，該曲線的斜率為-3.436，相關(guān)系數(shù)R2為0.997。兩條標準曲線的標準偏差(SD)均小于0.12，相對標準偏差(RSD)均小于0.27%，因此根據(jù)未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式:樣品中植酸酶玉米含量=(phyA2基因拷貝數(shù)/內(nèi)標基因zSSIIb拷貝數(shù))X 100%可以計算出待測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。對轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量為5%、3%、1%、0.5%的混合樣品的定量結(jié)果為5.12%,3.19%、1.06%和0.54%，百分偏差均小于8%，三次重復的標準偏差(SD)均小于0.061，相對標準偏差(RSD)均小于14% ;上述定量結(jié)果準確度和精確度較高，均符合歐盟的定量檢測標準。實施例3質(zhì)粒分子pPZ在植酸酶玉米TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測中的應(yīng)用將質(zhì)粒分子pPZ按5倍倍比分別稀釋至25000、5000、1000、200和40copies/y L，每個濃度設(shè)3個重復，檢測擴增的重復性。引物和探針由大連Takara公司合成,稀釋成10 μ mol/L備用。合成的植酸 酶玉米基因特異性引物與探針序列如下: phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ ；phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’ ；phyA2-P:FAM-5' -CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3' -Eclipse。玉米內(nèi)標引物與探針(zSSIIb)采用國家標準引物與探針，其序列如下:zSSIIb-F:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ ；zSSIIb-R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ ；zSSIIb-P:FAM-5' -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRAo擴增反應(yīng)體積為20 μ L，擴增反應(yīng)體積為20 μ L，2XPremixExTaq(Rox) 12.5 μ L，濃度為 10 μ mol/L 的 Forwardprimerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverseprimerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 TaqManprobe0.5 μ L, ddH204 μ L，DNA 模板 I μ L。擴增反應(yīng)條件:95°C IOmin預變性；95°C 15s,60°C 30s，在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。每個試樣重復3次，同時設(shè)立無菌雙蒸水(ddH20,空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品對照。結(jié)果:通過對不同質(zhì)粒分子pPZ拷貝數(shù)為25000、5000、1000、200和40的DNA進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，計算機軟件自動生成標準曲線，縱坐標為Ct，橫坐標為起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)。根據(jù)標準曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的植酸酶玉米標準品(3%，1%, 0.5%, 0.1%)、陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。
對玉米內(nèi)標準基因zSSIIb和轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的基因特異性引物對同一組標準品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，分別得到PCR擴增曲線，并由系統(tǒng)軟件自動生成標準曲線。玉米內(nèi)標準基因zSSIIb的標準曲線如圖4所示，該曲線的斜率為-3.471系數(shù)R2為0.998，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性引物的標準曲線如圖5所示，該曲線的斜率為-3.285，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。兩條標準曲線的標準偏差(SD)均小于0.11，相對標準偏差(RSD)均小于0.30%,因此根據(jù)未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式:樣品中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米含量=(phyA2基因拷貝數(shù)/內(nèi)標基因zSSIIb拷貝數(shù))X100%可以計算出待測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。對轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量為5%、3%、1%、0.5%的混合樣品的定量結(jié)果為4.84%,3.21%、1.06%和0.44%，百分偏差均小于12%，三次重復的標準偏差(SD)均小于0.049，相對標準偏差(RSD)均小于10.4% ;上述定量結(jié)果準確度和精確度較高，均符合歐盟的定量檢測標準。以上結(jié)果可以證明，本發(fā)明提供了一種適用性強、穩(wěn)定性好，可替代轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標準品的陽性質(zhì)粒分子。為轉(zhuǎn)基因標識提供了一種強有力的技術(shù)支撐，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了 必要的手段。
權(quán)利要求
1.植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ,其特征在于:該質(zhì)粒分子的序列如下: CCAATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTG TCCGGTGTGACTCTCACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGA CACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCC ATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCTTGAAAAAGTATTACGGCCATGGTG CAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTG ATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAA CCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT。
2.權(quán)利要求1所述的植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ的構(gòu)建方法，其特征在于:首先，設(shè)計特異性PCR引物，從植酸酶玉米模板DNA中擴增獲得轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列，然后，利用分子克隆技術(shù)將這兩段DNA片段構(gòu)建到pMD19-T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子pPZ。
3.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟如下: (1)設(shè)計PCR特異性引物:根據(jù)轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列設(shè)計PCR特異性引物； (2)獲取目的片段:利用上述PCR特異性引物特異性的擴增目的片段:轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因序列和玉米內(nèi)標基因序列；回收這兩個目的片段，以此為模板采用引物C-phyA2-lF/C-zSSIIb-2R 進行重疊 PCR 擴增； (3)質(zhì)粒的構(gòu)建:上述得到的PCR產(chǎn)物回收后，通過連接酶連接到pMD19-T載體上；連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，采用凝膠電泳法鑒定陽性質(zhì)粒并測序驗證，鑒定為陽性質(zhì)粒的即為植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ。
4.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(I)中，PCR特異性引物為兩對，序列如下: C-phyA2-lF:5’-CCAATTTCACCGCCACG-3’ ；C-phyA2-2R:5’-GCGGGCTCTGGCTTCAGGTTACCTGCACCATGGCC-3’ ；C-zSSIIb-lF:5’-GGCCATGGTGCAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGC-3’ ；C-zSSIIb-2R:5’-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3’ 。
5.權(quán)利要求1所述的植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ在定性檢測轉(zhuǎn)植酸酶基因中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:檢測方法如下:首先，提取待檢測樣品的基因組DNA，以此為模板，使用phyA2基因特異性引物進行PCR擴增，以植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子PPZ作為陽性對照；然后，待檢測樣品的PCR擴增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產(chǎn)物，若存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品中含有轉(zhuǎn)植酸酶基因；若不存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含有轉(zhuǎn)植酸酶基因； 所述phyA2基因特異性引物序列如下: phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ ； phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’ 。
7.權(quán)利要求1所述的植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ在SYBRGreenI實時熒光定量檢測中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:檢測方法如下:(1)建立phyA2基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線: ①對質(zhì)粒分子PPZ進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入phyA2基因特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標準引物，進行擴增； ②擴增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶基因玉米phyA2基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線； (2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加Λ phyA2基因特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標準引物，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的phyA2基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標準基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的百分含量； 所述步驟(I)①和(2)中，zSSIIb引物序列如下:
9.權(quán)利要求1所述的植酸酶玉米phyA2基因質(zhì)粒分子pPZ在TaqMan探針實時熒光定量檢測中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:檢測方法如下: (1)建立植酸酶玉米phyA2基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線: ①對質(zhì)粒分子PPZ進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入phyA2基因特異性引物和熒光標記探針，以及zSSIIb基因的國家標準引物和熒光標記探針，進行擴增； ②擴增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶基因玉米phyA2基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線； (2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入phyA2基因特異性引物和突光標記探針，以及zSSIIb基因的國豕標準引物和突光標記探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的定量PCR標準曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標準基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的百分含量；所述步驟(I)①和(2)中，zSSIIb引物和探針序列如下: zSSIIb-lF:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ ； zSSIIb-2R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ ； zSSIIb-P:FAM-5’-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3’-TAMRA ； 所述步驟(I)①和(2)中，擴增的參數(shù)如下:擴增反應(yīng)體積為20yL，.2 X PremixExTaq (Rox) 12.5 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forwardprimerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverseprimerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 TaqManprobe0.5 μ L, ddH204 μ L, DNA 模板IuL ;擴增反應(yīng)條件:95°C IOmin預變性；95°C 15s，60°C 30s，在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)； 所述步驟(I)①和(2)中，MIR162基因特異性引物和探針序列如下: phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ ； phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’ ； phyA2-P:FAM-5’-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3’-Eclipse。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性質(zhì)粒分子pPZ，其空白載體為質(zhì)粒載體pMD19-T載體，包含有植酸酶玉米phyA2基因特異性序列和玉米內(nèi)標基因序列，如序列表中1所示。構(gòu)建方法為首先，設(shè)計特異性PCR引物，從植酸酶玉米基因組DNA中擴增獲得目的片段，然后，利用分子克隆技術(shù)將這目的片段構(gòu)建到pMD19-T載體中，獲得質(zhì)粒分子pPZ。本發(fā)明的質(zhì)粒分子pPZ，可作為轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標準品的替代品，用于轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的定性、定量檢測，適用性強，穩(wěn)定性好，對實際樣品分析的結(jié)果比較準確，很好的解決了該品系檢測過程中陽性標準物質(zhì)缺乏的問題，具有極高的應(yīng)用價值與市場前景。
文檔編號C12N15/63GK103205446SQ20131012181
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者路興波, 張廣遠, 李凡, 高瑞, 徐曉輝, 楊淑珂, 孫紅煒 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所