專利名稱：一種南極冰藻cpd光修復(fù)酶、其編碼基因和表達(dá)載體以及該酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及南極冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L中CPD光修復(fù)酶、其編碼基因，以及南極冰藻CPD光修復(fù)酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的高速發(fā)展，大氣層中臭氧層遭到了破壞，南北兩極臭氧空洞的出現(xiàn)、擴(kuò)大，使得輻射到地球表面的太陽(yáng)光中紫外線增強(qiáng)，導(dǎo)致生物圈受紫外線傷害日益嚴(yán)重。大劑量的紫外線(主要是UV-B)對(duì)整個(gè)地球生態(tài)環(huán)境來(lái)說(shuō)是一個(gè)災(zāi)難性的威脅。紫外線已明顯地抑制了南極水域中浮游植物群落的光合作用。其危害的根本原因是，生物體中DNA的四種堿基在近紫外波段(UV-B，280 320nm)有強(qiáng)吸收，進(jìn)而誘發(fā)DNA同一條鏈內(nèi)相鄰的嘧 啶堿基產(chǎn)生嘧啶二聚體，破壞DNA結(jié)構(gòu)，這些損傷將可引起變異，或?qū)е录?xì)胞死亡。紫外線也給人類皮膚健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅，由于人皮膚細(xì)胞DNA極易吸收中波紫外線，對(duì)DNA造成損傷，因此近年來(lái)皮膚癌、黑瘤病的發(fā)病率激增。近年來(lái)DNA光致?lián)p傷與修復(fù)機(jī)制的研究，尤其對(duì)DNA上氧化態(tài)胸腺嘧啶二聚體修復(fù)機(jī)理的研究引起了人們的極大關(guān)注，研究極地耐輻射植物的光修復(fù)機(jī)理，將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)生物和人類的生存極為重要。南極冰藻生長(zhǎng)在南極海冰、海冰邊緣或海水中，是一種極端微生物。在南極生態(tài)系統(tǒng)中占有極其重要的地位，是南極重要的初級(jí)生產(chǎn)力，同時(shí)也是南極浮游動(dòng)物、磷蝦、魚類的重要實(shí)物來(lái)源。強(qiáng)紫外線輻射是南極生物所承受的主要環(huán)境脅迫之一。盡管生活在強(qiáng)輻射的環(huán)境中，南極冰藻仍旺盛生長(zhǎng)繁殖，這預(yù)示著南極冰藻細(xì)胞內(nèi)除了合成抗輻射物質(zhì)來(lái)吸收紫外線和清除自由基外，遺傳學(xué)上對(duì)DNA紫外損傷的高效自我修復(fù)功能應(yīng)是其適應(yīng)這種惡劣環(huán)境的關(guān)鍵機(jī)制。研究證實(shí)，DNA光修復(fù)酶承擔(dān)了修復(fù)DNA損傷并保持生物遺傳穩(wěn)定性的重要功能。光修復(fù)酶廣泛的存在于各種生物中，可以通過(guò)色氨酸電子傳遞鏈將光信號(hào)傳遞給FAD，F(xiàn)DA發(fā)生氧化還原反應(yīng)改變嘧啶二聚體結(jié)構(gòu)，使之裂解。光修復(fù)酶在生物體內(nèi)的含量極少，每個(gè)細(xì)胞約有10 20個(gè)光修復(fù)酶分子，這使得直接進(jìn)行生物體光修復(fù)酶的分離純化和體外活性等研究極為困難。因此有必要對(duì)長(zhǎng)期生存于強(qiáng)紫外線輻射條件下的南極冰藻進(jìn)行深入研究，以利用基因工程手段克隆其光修復(fù)酶基因，并將其轉(zhuǎn)化到目的宿主中，使其完成光修復(fù)酶的過(guò)量表達(dá)和純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種南極冰藻(PD光修復(fù)酶，是將其編碼基因克隆到表達(dá)載體中，得到其編碼產(chǎn)物，并將編碼產(chǎn)物合理應(yīng)用到化妝品、生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域，從而消除上述背景技術(shù)中缺陷。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種南極冰藻CPD光修復(fù)酶，如(a)或(b)所述的蛋白質(zhì):
(a)其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；(b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有CPD光修復(fù)酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。(b)所述的蛋白質(zhì)，例如將SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替換為Val、或?qū)EQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十個(gè)氨基酸、或?qū)EQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln等，以上修飾均不改變蛋白活性，且由(a)衍生，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了南極冰藻(PD光修復(fù)酶的編碼基因。南極冰藻CPD光修復(fù)酶的編碼基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。或者，與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且編碼光修復(fù)酶活性蛋白的核苷酸序列，能夠編碼(b)所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。例如，針對(duì)將SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替換為Val，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第484-第486個(gè)核苷酸，替換為GTT ;或針對(duì)將SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十個(gè)氨基酸，SEQ ID NO:1所示的核苷酸3’端缺失33個(gè)核苷酸；或針對(duì)將SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln，SEQ ID NO:1所示的核苷酸在5’端第228個(gè)核苷酸后添加CAG。本發(fā)明還提供了南極冰藻CPD光修復(fù)酶的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括:導(dǎo)入了南極冰藻CPD光修復(fù)酶的編碼基因而能夠編碼如(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。本發(fā)明提供的南極冰藻(PD光修復(fù)酶的表達(dá)載體中，還可以加入選擇性標(biāo)記基因，包括但不限于:可在表 達(dá)菌株中產(chǎn)生顏色變化的酶的基因、或發(fā)光化合物的基因、或具有抗生素標(biāo)記物的基因。具體的說(shuō)，本發(fā)明的技術(shù)方案是，從南極冰藻轉(zhuǎn)錄組中篩查獲得目的基因一南極冰藻CPD光修復(fù)酶基因片段序列，對(duì)此片段在NCBI上進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。通過(guò)RACE得到該基因cDNA全長(zhǎng)，同時(shí)，根據(jù)該基因片段序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增全長(zhǎng)CPD光修復(fù)酶基因。同時(shí)，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)該基因在紫外脅迫和強(qiáng)光照射條件下的表達(dá)模式。將該基因克隆到原核克隆載體PMD18-T，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的重組載體經(jīng)酶切后連接原核表達(dá)載體pET-28a(+)，在大腸桿菌BL21中表達(dá)。最終經(jīng)過(guò)親和層析得到純化蛋白。為了方便過(guò)量表達(dá)菌株的鑒定和篩選，可對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物基因(如GFP基因、突光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素標(biāo)記物。1、南極冰藻總RNA的分離將南極冰藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,用Invitrogen公司的Trizol進(jìn)行RNA的提取。2、CPD光修復(fù)酶基因cDNA序列的獲得根據(jù)前期獲得的冰藻轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物: 5，-RACE 引物 GSPl: CGAGCACATGGGTCGTTCCTCTTATCG3，-RACE 弓丨物 GSP2:TGGGACGGAAGTGGAGGGATGAGGT將獲得的高質(zhì)量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為:940C 30s, 72°C 3min, 5 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 3min, 5 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 68°C 30s,72 °C 3min，27 個(gè)循環(huán)。
3、南極冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修復(fù)酶表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)測(cè)序得到的光修復(fù)酶基因完整序列設(shè)計(jì)引物:CPDF:TAGAATTCATGCCGAAGCGAACCPDR:TATCTCGAGTCAAGCTCGTGGCPCR 反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 10min，95°C變性 15s，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；將光修復(fù)酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至原核表達(dá)載體pET-28a (+)，得到重組質(zhì)粒；將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定；鑒定正確的質(zhì)粒以相同方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，測(cè)序鑒定得到重組菌株BL21 (DE3)/pET_28a(+)/phr。4、南極冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修復(fù)酶的純化和蛋白檢測(cè)將重組菌BL21 (DE3)/pET-28a(+)/phr接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，加入IPTG，收集菌體；Ni瓊脂糖親和柱親和層析，得到目的蛋白。 取上述誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET_28a (+) /phr菌體和純化的目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE恒壓電泳，電泳結(jié)束后將凝膠用聚丙烯酰胺凝膠染色液染色。人們?cè)诩?xì)菌、昆蟲、高等植物、脊椎動(dòng)物和某些低等哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了光修復(fù)酶及其基因，但在聞等哺乳動(dòng)物包括人體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)DNA光修復(fù)酶的存在。而在聞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，核酸外切修復(fù)(NER)是修復(fù)DNA損傷的最主要途徑。有部分群體存在NER修復(fù)系統(tǒng)缺乏或不完整，表現(xiàn)出各種疾病，最常見(jiàn)的是著色性干皮病(XP)患者，除此之外Cockayne綜合癥和光敏型的毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙癥也存在NER修復(fù)系統(tǒng)缺乏。因此，光修復(fù)酶也可以應(yīng)用到以上疾病的治療。本發(fā)明將南極冰藻(PD光修復(fù)酶應(yīng)用于保健品、化妝品、生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域以主動(dòng)修復(fù)由紫外線引起病癥。例如，防曬霜可以將皮膚與紫外線隔離開(kāi)來(lái)，通過(guò)對(duì)光的反射和吸收兩種機(jī)制起作用，以減少紫外線對(duì)皮膚的損傷，但無(wú)法對(duì)損傷的皮膚進(jìn)行修復(fù)。本發(fā)明的重組蛋白DNA光修復(fù)酶可以作為高級(jí)護(hù)膚品的功能成分，主動(dòng)修復(fù)由紫外線引起的紅斑、皮膚炎癥以及基因損傷，延緩衰老，徹底突破了當(dāng)前“防”紫外線的概念。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明首次克隆了南極冰藻(PD光修復(fù)酶基因，并成功將其克隆到表達(dá)載體中，獲得大量cro光修復(fù)酶，并將cro光修復(fù)酶應(yīng)用到保健品、化妝品、生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域，能夠主動(dòng)修復(fù)由紫外線引起病癥，帶來(lái)巨大的社會(huì)效益，意義重大。


圖1是紫外條件下南極冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修復(fù)酶基因表達(dá)變化圖；圖2是強(qiáng)光條件下南極冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修復(fù)酶基因表達(dá)變化圖；圖3 是 SDS-PAGE 電泳圖。
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。實(shí)施例1.南極冰藻Chlamydomonas sp.1CE-L CPD光修復(fù)酶cDNA序列的獲得1、南極冰藻的培養(yǎng)、總RNA的分離將南極冰藻4°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,用Invitrogen公司的Trizol進(jìn)行RNA的提取。試驗(yàn)按照Trizol試劑的提取流程說(shuō)明進(jìn)行操作，在整個(gè)過(guò)程中保證無(wú)RNase污染，將提取的RNA分裝成小份，凍存于_80°C冰箱備用。2、CPD光修復(fù)酶基因cDNA序列的獲得根據(jù)前期獲得的冰藻轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物:5，-RACE 引物 GSP1: CGAGCACATGGGTCGTTCCTCTTATCG3，-RACE 弓丨物 GSP2:TGGGACGGAAGTGGAGGGATGAGGT將獲得的高質(zhì)量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。5’ -RACE反轉(zhuǎn)錄體系如下:
權(quán)利要求
1.一種南極冰藻CPD光修復(fù)酶,其特征在于:如(a)或(b)所述的蛋白質(zhì): (a)其如SEQID NO:2所示的氨基酸序列； (b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有(PD光修復(fù)酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的南極冰藻(PD光修復(fù)酶，其特征在于:(b)所述的蛋白質(zhì)，包括:將SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替換為Val、或?qū)EQ ID N0:2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十個(gè)氨基酸、或?qū)EQID NO: 2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln，而且具有CPD光修復(fù)酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
3.編碼如權(quán)利要求1或2所述的南極冰藻CPD光修復(fù)酶的編碼基因。
4.如權(quán)利要求3所述的南極冰藻CPD光修復(fù)酶的編碼基因，其特征在于:其如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的南極冰藻CPD光修復(fù)酶的編碼基因，其特征在于:與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且編碼光修復(fù)酶活性蛋白的核苷酸序列。
6.南極冰藻CPD光修復(fù)酶的表達(dá)載體,其特征在于:所述表達(dá)載體包括:導(dǎo)入了如權(quán)利要求3所述的南極冰藻CPD光修復(fù)酶編碼基因而能夠編碼如(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求6所述的南極冰藻CPD光修復(fù)酶的表達(dá)載體,其特征在于，所述表達(dá)載體中加入選擇性標(biāo)記基因。
8.如權(quán)利要求1或2所述南極冰藻CPD光修復(fù)酶在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1或2所述南極冰藻CPD光修復(fù)酶在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種南極冰藻CPD光修復(fù)酶，如(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)(a)其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；(b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有CPD光修復(fù)酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了所述南極冰藻CPD光修復(fù)酶的編碼基因、表達(dá)載體，以及該南極冰藻CPD光修復(fù)酶在化妝品、生物醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明首次克隆了南極冰藻CPD光修復(fù)酶基因，并成功將其克隆到表達(dá)載體中，獲得大量CPD光修復(fù)酶，并將CPD光修復(fù)酶應(yīng)用到化妝品、生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域，能夠主動(dòng)修復(fù)由紫外線引起病癥，帶來(lái)巨大的社會(huì)效益，意義重大。
文檔編號(hào)C12N15/60GK103160488SQ20131012183
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者繆錦來(lái), 許建方, 馬莉 申請(qǐng)人:青島恒生生物制藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司