專利名稱：青霉素?；?、其高產(chǎn)菌株及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及青霉素?；?、其高產(chǎn)菌株及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青霉素?；?penicillin acylase,EC3.5.1.11)又稱為青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，是內(nèi)酰胺抗生素?；D(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)亞類。這類酶是目前為數(shù)不多的已被大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的重要酶。青霉素?；冈卺t(yī)藥工業(yè)中發(fā)揮著重要的作用，主要應(yīng)用于半合成青霉素和頭孢菌素類的工業(yè)生產(chǎn)中，可以催化制備高效、廣譜、適用于不同用途的新型β_內(nèi)酰胺抗生素。該酶一方面可以催化青霉素或頭孢霉素水解，得到半合成抗生素的重要中間體6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA);另一方面可以催化?；磻?yīng)由6-APA合成新型青霉素或由7-ACA合成新型頭孢霉素。此外，青霉素酰化酶作為一種生物催化劑應(yīng)用于許多有潛在價(jià)值的反應(yīng)中，如在肽的合成過(guò)程中用于保護(hù)氨基和羥基，以及用于拆分手性化合物的外消旋混合物等。β_內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上十分重要的一類抗生素，但是由于其大規(guī)模使用也帶來(lái)了一些負(fù)面影響，濫用抗生素導(dǎo)致越來(lái)越多的細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，克服這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)重要方法就是開(kāi)發(fā)和使用新的半合成抗生素。與傳統(tǒng)的化學(xué)半合成法相比，酶法制備
內(nèi)酰胺類抗生素不僅可以減少反應(yīng)步驟，而且還可減少?gòu)U棄物的產(chǎn)生，有利于保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品易分離且質(zhì)量?jī)?yōu)異，所含雜質(zhì)極少。因此，隨著人們對(duì)β_內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成深入研究，相關(guān)的工業(yè)技術(shù)快速發(fā)展，人類對(duì)自身生存環(huán)境狀況日益重視，β -內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成將是21世紀(jì)β -內(nèi)酰胺抗生素發(fā)展的必然趨勢(shì)之一。

盡管青霉素酰化酶的研究已開(kāi)展多年并取得重要進(jìn)展，但基礎(chǔ)性的深入研究和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用所必需的優(yōu)良酶類仍然缺乏，因此篩選性能更優(yōu)越的青霉素?；讣捌涓弋a(chǎn)菌株對(duì)酶法催化半合成內(nèi)酰胺類抗生素具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供青霉素?；父弋a(chǎn)菌株。本發(fā)明的另一目的是提供利用所述菌株制備青霉素?；傅姆椒ā１景l(fā)明的再一目的是提供所述菌株產(chǎn)生的青霉素?；傅陌被嵝蛄屑盎蛐蛄?。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先從南京、蘇州等地藥廠周邊土壤中篩選獲得青霉素酰化酶高產(chǎn)菌株，該菌株為木糖氧化無(wú)色桿菌iAchromobacter xy losoxi dans ) K18,其保藏登記號(hào)為CCTCC NO:M 2012541。本發(fā)明對(duì)木糖氧化無(wú)色桿菌dAroffioAacier xy losoxi dans ) K18的生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定，該菌株為革蘭氏陰性菌株，無(wú)芽孢，菌落呈淡黃色，輕微隆起，圓形，邊緣整齊，濕潤(rùn)、半透明、光滑；顯微鏡觀察菌體為桿菌，0.5 1.2X0.5 2.6 μ m,專性好氧,最適生長(zhǎng)溫度為28°C 37°C。其生理生化特性表現(xiàn)在:過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、硝酸還原反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，明膠反應(yīng)結(jié)果為陰性，有動(dòng)力，氧化木糖產(chǎn)酸，可利用木糖、果糖、甘露糖等，不可利用海藻糖、甘露醇、阿拉伯糖。經(jīng)BIOLOG全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，該菌與Achromobacter屬的Sim值為
0.747 ;后經(jīng)16S rDNA序列分析，結(jié)果表明該菌株與多株JcAroffioAacier xylosoxidans菌的同源性為99%。綜合BIOLOG和16S rDNA分析結(jié)果，該菌株鑒定為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xy losoxi dans ),命名為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacterxy losoxi dans ) K18。一種利用所述菌株制備青霉素酰化酶的方法，通過(guò)發(fā)酵木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xy losoxi dans ) K18,得到青霉素酸化酶。發(fā)酵木糖氧化無(wú)色桿菌dAroffioAacier18米用的培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑選自苯甲酸、苯乙酸、4-輕基苯乙酸、苯氧乙酸、苯丙酸和苯甘氨酸中的一種或兩種以上。所述誘導(dǎo)劑濃度為1-4 g/L。所述培養(yǎng)基的碳源為甘油，氮源為酵母粉、蛋白胨或其混合物，表面活性劑為Span-20、Tween 80和Triton X-100中的一種或兩種以上；所述培養(yǎng)基中碳源濃度為5 25 g/L，氮源濃度為7.5 15g/L，表面活性劑濃度為0.1 I mL/L。發(fā)酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵溫度為25 30 C，搖床轉(zhuǎn)速為150-200 rpm, 250 mL三角瓶中培養(yǎng)基的裝液量30-50 mL，發(fā)酵時(shí)間為40 60h。一種所述菌株產(chǎn)生的青霉素?；福浒被嵝蛄腥鏢EQ ID NO:2所示。

編碼所述青霉素酰化酶的基因，其序列如SEQ ID N0:1所示。DNA全序列分析結(jié)果表明，該青霉素?；富蛉L(zhǎng)2532個(gè)核苷酸,編碼843個(gè)氨基酸，與Achromobacterxylosoxidans A8青霉素酰化酶基因同源性為86%,氨基酸序列同源性為85%。本發(fā)明對(duì)該青霉素酰化酶粗酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，實(shí)驗(yàn)證明該青霉素?；笇?duì)多種有機(jī)溶劑都具有良好的耐受性，并且耐受濃度高達(dá)40% (V/V)以上，在多元醇和疏水性有機(jī)溶劑中青霉素?；傅姆€(wěn)定性提高，半衰期延長(zhǎng)；甲醇、DMSO處理24h，其酶活可維持在50%以上；該青霉素?；傅淖钸m反應(yīng)pH為8.0，在pH 5.0 8.5的范圍具有較高的穩(wěn)定性；其最佳反應(yīng)溫度為45°C，60°C處理2小時(shí)，其酶活還維持在70%以上，表明其具有良好的熱穩(wěn)定性。該酶最適反應(yīng)底物是青霉素G。本發(fā)明還提供青霉素酰化酶在合成β -內(nèi)酰胺類抗生素中的應(yīng)用。所述青霉素?；冈诜撬囿w系中合成以6-青霉素烷酸為母核的β -內(nèi)酰胺類抗生素。所述的非水相酶催化反應(yīng)是以6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和酰基供體為原料，在青霉素?；傅拇呋饔孟逻M(jìn)行縮合反應(yīng)，形成以6-ΑΡΑ為母核的β_內(nèi)酰胺類抗生素。所述的6-ΑΡΑ與酰基供體的摩爾比為1:1 1:3，其中6-ΑΡΑ的濃度為10 80mmol/L，?；w的濃度為10 240 mmol/L0所述的非水相體系為親水性有機(jī)溶劑和水組成的混合溶齊U，所述親水性有機(jī)溶劑選自甲醇、丙三醇、乙二醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇中的任意一種，其體積百分含量為5 80%。所述的?；w為羧酸及其甲酯、酰胺、酸酐等，所述羧酸可以為脂肪酸或芳香酸。本發(fā)明的有益效果在于:木糖氧化無(wú)色桿菌xylosoxidans ") K18是青霉素?；傅母弋a(chǎn)菌。采用該菌株，以含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，青霉素?；傅漠a(chǎn)量可達(dá)200U/L以上。木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xy losoxi dans ) K18所產(chǎn)青霉素?；改透邷?、在酸性環(huán)境下能保持較高活力、底物特異性較高、有機(jī)溶劑耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。該青霉素?；冈诜撬嘀谐晒Υ呋铣搔耞內(nèi)酰胺類抗生素，進(jìn)一步證明該酶在有機(jī)溶劑催化反應(yīng)所表現(xiàn)的優(yōu)良性質(zhì)，為后續(xù)研究非水相催化合成新型內(nèi)酰胺類抗生素提供了有益前提。


圖1顯示青霉素?；甫?8的最適反應(yīng)pH。圖2顯示青霉素酰化酶K18的pH穩(wěn)定性(在各pH條件下放置2h后的剩余酶活)。圖3顯示青霉素?；窴18的最適反應(yīng)溫度。圖4顯示青霉素?；窴18的溫度穩(wěn)定性(在各溫度條件下放置2h后的剩余酶活)。圖5顯示青霉素?；窴18的底物特異性。圖6顯示40%有機(jī)溶劑對(duì)青霉素酰化酶K18的影響。所用有機(jī)溶劑為丙三醇(.)、乙二醇(▲)、聚乙二醇(T)Ud-丁二醇(X)、甲醇()、叔丁醇()、DMS0( )、DMF (★)、正己烷(* )、二甲醚( )、對(duì)照(_)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
本實(shí)施例說(shuō)明產(chǎn)青霉素?；柑烊痪甑暮Y選程序。

初篩采用如下方法:以高濃度青霉素G為篩選壓力從南京、蘇州藥廠周邊土壤等樣品中篩選獲得耐高濃度青霉素微生物。具體篩選培養(yǎng)基的配方為:酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L, NaCl 2 g/L，苯乙酸2 g/L，青霉素IO5 107U/ml ,pH 7.0，溶劑為水。培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為24 48 h，搖床轉(zhuǎn)速為180 rmp。此方法可篩選到大量耐高濃度青霉素微生物。將初篩獲得的菌株進(jìn)行復(fù)篩，具體方法如下:用50mM磷酸緩沖液(pH7.5)配制濃度為2mg/ml的3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸(縮寫為NIPAB，下同)溶液，并加到透明的48孔板中。將初篩獲得的菌株挑到48孔板中，以不加菌株的為空白對(duì)照，37°C反應(yīng)，直接觀察反應(yīng)液的顏色變化。如果反應(yīng)液變?yōu)辄S色，說(shuō)明孔中有青霉素?；府a(chǎn)生菌株。將青霉素?；府a(chǎn)生菌株接種到產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，具體配方為:酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L, NaCl 2 g/L，苯乙酸2 g/L，pH 7.0，溶劑為水。培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，搖床轉(zhuǎn)速為180rmp。發(fā)酵結(jié)束后,取發(fā)酵液于8000 rpm、4°C離心10 min,棄上清,取菌體用與發(fā)酵液相同體積的50mM磷酸緩沖液(pH7.5)重懸，超聲破碎細(xì)胞后，于12，000 rpm、4°C離心10 min,取上清為粗酶液。測(cè)定粗酶液的青霉素?；富盍?，選取粗酶液活力最高的菌株作為產(chǎn)青霉素?；妇?。通過(guò)上述方法，發(fā)明人獲得了一株青霉素?；府a(chǎn)生菌株K18，采用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，青霉素?；富盍_(dá)到104.7U/L。青霉素?；富盍z測(cè)方法(以NIPAB為底物)為:用50mM磷酸緩沖液(ρΗ7.5)配制濃度為2mg/ml的NIPAB底物溶液。反應(yīng)體系中先加入ΙΟΟμ 酶液，再加入ΙΟΟμ 底物溶液，在酶標(biāo)儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為4min，在405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束時(shí)生成的3-氨基-6-硝基苯甲酸(ANBA)的量。以煮沸滅活的酶液為空白對(duì)照。每I個(gè)單位(U)青霉素?；付x為，在相應(yīng)條件下，每分鐘催化水解NIPAB分解產(chǎn)生I MmolANBA所需的酶量。實(shí)施例二
本實(shí)施例說(shuō)明青霉素?；府a(chǎn)生菌株K18的生物學(xué)性質(zhì)、鑒定。菌株K18的生物學(xué)性質(zhì):該菌株為革蘭氏陰性菌株，無(wú)芽孢，菌落呈淡黃色，輕微隆起，圓形，邊緣整齊，濕潤(rùn)、半透明、光滑；顯微鏡觀察菌體為桿菌，0.5 1.2X0.5
2.6 μ m，專性好氧，最適生長(zhǎng)溫度為28 V 37°C。其生理生化特性表現(xiàn)在:過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、硝酸還原反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，明膠反應(yīng)結(jié)果為陰性，有動(dòng)力，氧化木糖產(chǎn)酸，可利用木糖、果糖、甘露糖等，不可利用海藻糖、甘露醇、阿拉伯糖。經(jīng)BIOLOG全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，菌株K18與Achromobacter屬的Sim值為0.747。經(jīng)16S rDNA序列分析，結(jié)果表明菌株K18與多株JcAroffioAacier xylosoxidans菌的同源性為99%。綜合BIOLOG和16S rDNA分析結(jié)果，菌株K18鑒定為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xy losoxi dans ),命名為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacterxylosoxidans ) K18。木糖氧化無(wú)色桿菌t/a/75.) K18,已經(jīng)保藏。分類命名為Achromobacter xylosoxi dans K18保藏日期為2012年12月21日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏單位地址:武漢大學(xué)，保藏登記號(hào)為:CCTCC NO:M2012541。實(shí)施例三`
本實(shí)施例說(shuō)明木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) K18發(fā)酵產(chǎn)酶方法。平板培養(yǎng)基配方::酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L,瓊脂1.8 2.0g/L, pH 7.0，溶劑為水。種子培養(yǎng)基配方:酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.0，溶劑為水。種子液的制備:250 mL三角瓶中種子培養(yǎng)基的裝液量為30 mL。刮取平板培養(yǎng)24h的菌株K18，接入種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為180 rmp，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為8 10h，得到種子液。方法I
產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方:甘油5 g/L，酵母粉7.5 g/L, NaCl 2 g/L, Triton X-100 0.25mL/L,苯乙酸lg/L, pH 6.0，溶劑為水。250 mL三角瓶中產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量30mL。將種子液接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為5% (V/V)，發(fā)酵溫度28 C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵時(shí)間為60h。粗酶液(制備方法同實(shí)施例一)中青霉素酰化酶活力為222.3U/L。方法2
產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方:甘油25 g/L，酵母粉15 g/L, NaCl 5g/L，Span-20 0.75 mL/L,苯乙酸4 g/L培養(yǎng)基的pH7.2，溶劑為水。250 mL三角瓶中產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)的裝液量50mL。將種子液接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為5% (V/V)，發(fā)酵溫度30 C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵時(shí)間為52h。
粗酶液(制備方法同實(shí)施例一)中青霉素?；富盍?33.6U/L。方法3
產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方:甘油15 g/L，酵母粉12 g/L, NaCl 4 g/L, Span-20 0.5 mL/L,苯甲酸2 g/L培養(yǎng)基的pH6.5，溶劑為水。250 mL三角瓶中產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)的裝液量40mL。將種子液接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為5% (V/V)，發(fā)酵溫度29 C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，發(fā)酵時(shí)間為40h。粗酶液(制備方法同實(shí)施例一)中青霉素?；富盍?10.9U/L。方法4
產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方:甘油15 g/L，蛋白胨12 g/L, NaCl 4 g/L, Tween 80 0.5 mL/L，4-羥基苯乙酸2 g/L培養(yǎng)基的pH6.5，溶劑為水。250 mL三角瓶中產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)的裝液量40mL。將種子液接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為5% (V/V)，發(fā)酵溫度29 C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，發(fā)酵時(shí)間為40h。粗酶液(制備方法同實(shí)施例一)中青霉素?；富盍?30.9U/L。實(shí)施例四
本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明青霉素酰化酶粉的制備程序。將木糖氧化無(wú)色桿菌K18在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)52 h后，發(fā)酵液在8，000 rpm、4°C離心20 min，棄上清，菌體重懸于0.025 M磷酸緩沖液(pH 6.5)，采用高壓 勻質(zhì)機(jī)(破碎壓力為850 950Bar)進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心取上清為粗酶液。將粗酶液用30KD的超濾膜進(jìn)行超濾，于_55°C條件下真空干燥，制得青霉素?；阜?。超濾后的粗酶液酶活力為1095U/L，青霉素?；阜刍盍?0.6U/g。將木糖氧化無(wú)色桿菌所產(chǎn)青霉素?；该麨榍嗝顾仵；窴18。實(shí)施例五
本實(shí)施例說(shuō)明木糖氧化無(wú)色桿菌iAchromobacter所產(chǎn)青霉素?；?br> 酶K18編碼基因的分離克隆程序。采用酹一氯仿法抽提菌體總DNA。根據(jù)木糖氧化無(wú)色桿菌(Jchromobac terxylosoxi dans ) A8 (NCBI Reference Sequence:NC_014640.1)的全基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，獲得一個(gè)編碼青霉素?；傅幕颍鶕?jù)該基因序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)Ul和LD1。LUl (SEQ ID NO:3)序列為:GTTGCGACAAGTTGACCGCCTCT，
LDl (SEQ ID N0:4)序列為:CACCTCGCATCTGGACACCTTG。以木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacterxylosoxi dans ) K18 總 DNA 為模板，以 LUl和LDl為引物擴(kuò)增青霉素?；窴18的⑶S編碼序列。將擴(kuò)增到的3.0 kb的PCR片段連接到pMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定和分析，青霉素?；傅幕蛐蛄腥鏢EQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所不。木糖氧化無(wú)色桿菌)K18與Achromobacter xylosoxi dans A8青霉素酰化酶基因同源性為86%,氨基酸序列同源性為 85 %。實(shí)施例六
用實(shí)施例四中超濾后的粗酶液進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)青霉素?；窴18性質(zhì)。青霉素?；窴18最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的檢測(cè):以不同pH緩沖液溶解的NIPAB為底物，pH7.5條件下的青霉素?；富盍閷?duì)照(100% )，不同pH反應(yīng)體系中的酶活如圖1所示。本發(fā)明青霉素酰化酶的最適反應(yīng)pH為8.0。以原始酶液的青霉素酰化酶活力為對(duì)照，檢測(cè)該酶的PH穩(wěn)定性(圖2)。將青霉素酰化酶K18與不同pH的緩沖溶液按照體積比1:1進(jìn)行混合，在30°C保溫2 h后測(cè)殘余酶活，實(shí)驗(yàn)表明該青霉素?；冈趐H
5.0 8.5的范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性，在pH 10.5的溶液中保溫2h后，仍然保留最高活力的 61%。青霉素?；窴18最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的檢測(cè):最適反應(yīng)溫度的測(cè)定，在
0.05 M Na2HP04*12H20-NaH2P04*2H20緩沖體系(pH 7.5)中進(jìn)行，在不同的溫度下以NIPAB為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)。結(jié) 果顯示該酶的最適反應(yīng)溫度為45°C (圖3)。熱穩(wěn)定性測(cè)定:青霉素酰化酶K18在30°c、40°c、50°c、6(rc、7(rc、8(rc下處理2h以后，測(cè)定殘留酶活。由圖4可以看出該青霉素?；妇哂休^好的熱穩(wěn)定性，50°C以下處理2 h后活力基本不變，在60°C處理2 h后仍然保留最高活力的72%。青霉素酰化酶K18底物特異性的檢測(cè):利用青霉素?；改軌虼呋猞?-內(nèi)酰胺類抗生素生成6-ΑΡΑ或7-ADCA (7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸)來(lái)檢測(cè)青霉素?；甫?8的底物特異性。將粗酶液與反應(yīng)底物按照體積比1:1進(jìn)行混合，在30°C、轉(zhuǎn)速180 rpm條件下反應(yīng)，定時(shí)取樣，采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)底物分別為氨芐青霉素，青霉素G，青霉素V，阿莫西林，頭孢氨芐。結(jié)果如圖5，青霉素?；窴18對(duì)青霉素類抗生素有水解活力，而對(duì)頭孢菌素類抗生素?zé)o水解能力，其中最適反應(yīng)底物為青霉素G。青霉素?；窴18的有機(jī)溶劑耐受性:向青霉素?；窴18中分別加入10種有機(jī)溶劑(按照實(shí)施三制備)，其混合比例為酶液:有機(jī)溶劑=3: 2(V/V)，疏水有機(jī)溶劑組中對(duì)照不添加有機(jī)溶劑，親水有機(jī)溶劑組中對(duì)照添加與溶劑等體積的緩沖液。30°C，150 rpm振蕩，定時(shí)取樣，以NIPAB為底物檢測(cè)青霉素?；富盍ΑＧ嗝顾仵；窴18具有良好的有機(jī)溶劑耐受性，其在乙二醇、甘油、聚乙二醇、1，4 丁二醇、正己烷、二甲醚有機(jī)溶劑中半衰期有明顯延長(zhǎng)；甲醇、DMSO處理24h，其酶活可維持在50%以上(圖6)。實(shí)施例七
本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明青霉素?；窴18在非水相體系中催化合成β_內(nèi)酰胺類抗生素的應(yīng)用。分別以ΡΗ6.5磷酸緩沖液、乙二醇-磷酸緩沖液、丙三醇-磷酸緩沖液、聚乙二醇-磷酸緩沖液、甲醇-磷酸緩沖液、1，2-丙二醇-磷酸緩沖液、I, 4- 丁二醇-磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)。反應(yīng)總體積為lmL，其中含有IOmM 6-APA, 20 mM D-HPGM (對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯)，加入青霉素酰化酶K18酶粉(實(shí)施例四制備)33 mg，在15°C，轉(zhuǎn)速180rpm條件下反應(yīng)，定時(shí)取樣。樣品用溶劑(水:甲醇:乙酸=60: 35: 5 (V/V))稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明丙三醇-磷酸緩沖液為最佳反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)20h，阿莫西林的合成率可達(dá) 50%。結(jié)果表明青霉素?；窴18具有良好的合成阿莫西林的能力，表明該酶將來(lái)在合成新型β_內(nèi)酰胺類抗生素中具有巨大的潛力，在生物制藥工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.青霉素?；父弋a(chǎn)菌株，其特征在于該菌株為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter^77ο.5θ^ο. / .5)Κ18，保藏登記號(hào)為 CCTCC NO:Μ 2012541。
2.一種利用權(quán)利要求1所述菌株制備青霉素?；傅姆椒?，其特征在于通過(guò)發(fā)酵木糖氧化無(wú)色桿菌xylosoxidans) K18,得到青霉素?；?。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備青霉素?；傅姆椒?，其特征在于:發(fā)酵木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans ) K18米用的培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑選自苯甲酸、苯乙酸、4-羥基苯乙酸、苯氧乙酸、苯丙酸和苯甘氨酸中的一種或兩種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備青霉素?；傅姆椒?，其特征在于:所述培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑濃度為1-4 g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備青霉素酰化酶的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基的碳源為甘油，氮源為酵母粉、蛋白胨或其混合物，表面活性劑為Span-20、Tween 80和TritonX-100中的一種或兩種以上；所述培養(yǎng)基中碳源濃度為5 25 g/L,氮源濃度為7.5 15g/L，表面活性劑濃度為0.1 I mL/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備青霉素酰化酶的方法，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵溫度25 30 C，搖床轉(zhuǎn)速150 200 rpm,發(fā)酵時(shí)間40 60h。
7.—種權(quán)利要求1所述菌株產(chǎn)生的青霉素?；福浒被嵝蛄腥鏢EQ ID N0:2所示。
8.編碼權(quán)利要求7所述青霉素?；傅幕?，其序列如SEQID N0:1所示。
9.權(quán)利要求7所述青霉素酰化酶在合成β-內(nèi)酰胺類抗生素中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述青霉素酰化`酶在合成β-內(nèi)酰胺類抗生素中的應(yīng)用，其特征在于所述青霉素?；冈诜撬囿w系中合成以6-青霉素烷酸為母核的β -內(nèi)酰胺類抗生素。
全文摘要
本發(fā)明提供青霉素?；?、其高產(chǎn)菌株及應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。菌株為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)K18，保藏號(hào)為CCTCC NOM2012541。通過(guò)發(fā)酵菌株K18，得到青霉素?；浮Ｋ銮嗝顾仵；福被嵝蛄腥鏢EQIDNO2，基因序列如SEQIDNO1。本發(fā)明還提供青霉素?；冈诤铣搔?內(nèi)酰胺類抗生素中的應(yīng)用。菌株K18是青霉素?；傅母弋a(chǎn)菌，以含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，青霉素?；傅漠a(chǎn)量可達(dá)200U/L以上。菌株K18所產(chǎn)青霉素?；改透邷?、在酸性環(huán)境下能保持較高活力、底物特異性較高、有機(jī)溶劑耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/84GK103184182SQ20131012481
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者何冰芳, 孔佳佳, 王欣, 潘鑫, 柏中中, 吳斌 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)