專利名稱：一種高耐熱性植酸酶酵母工程菌及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域，具體屬于一種高比活高耐熱性植酸酶酵母工程菌及其構建方法。
背景技術：
植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)的一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶。植酸酶具有特殊的空間結構，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸(鹽)降解為肌醇和無機磷，同時釋放出與植酸(鹽)結合的其它營養(yǎng)物質。植酸是植物性飼料中存在的主要抗營養(yǎng)因子之一，對無機離子、蛋白質等都具有螯合作用，從而影響動物對營養(yǎng)物質的吸收。作為動物飼料中主要成份的植物性飼料含有相當數(shù)量的磷，其中50%以上是以植酸磷的形式存在的，而單胃動物因缺乏分解植酸所必需的酶而不能有效地利用植酸磷。如果在單胃動物的飼料中直接添加磷必然會造成磷資源浪費，形成高磷糞便而造成環(huán)境污染；如果不在飼料中添加磷，這勢必將影響到動物生長、發(fā)育和繁殖。目前，植酸酶的工業(yè)化生產在世界范圍內已形成了一個巨大的產業(yè)。不僅為生產企業(yè)帶來可觀的經濟效益，也從根本上解決了目前單胃動物糞便中磷對環(huán)境的污染，降低了使用無機磷酸鹽作為飼料添加劑給我國礦物質資源帶來的壓力，表現(xiàn)出極大的社會經濟效益。因此，植酸酶作為新型飼料添加劑，可以提高飼料中磷和其他成分的利用率并減輕環(huán)境污染，已得到越來越多的重視和應用(丁強等，中國農業(yè)科技導報，2010，12 (3) ；27 33)。來源于大腸桿菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最強的植酸酶(Lei，et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2001，57 (4): 474-481 )。自 1952 年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中有植酸酶活性以來，人們已分離了大腸桿菌植酸酶(appA)基因，在原核表達系統(tǒng)(Golovan, et al., Can J Microbiol, 2000，46 (I): 59 71;羅會穎，生物工程學報，2004，20 (I): 78 84;陳寅等，Microbiol, 2004，31 (3) 74 78;黃敏等，應用與環(huán)境生物學報，2009，15 (3):371 375)和真核表達系統(tǒng)(Rodriguez, et al., Arch BiochemBiophys, 2000, 382(1):105 112;羅會穎等，生物工程學報，2006，22 (4) ; 528 533 ;黃光瑞等，湖北大學學報，2007, 29 (3) ; 290 293)中表達了 appA植酸酶，并對其酶學性質進行了系統(tǒng)研究。目前在生產實踐中應用的來源于大腸桿菌的植酸酶appA，其pH特性較好，比活性也是目前報道最高的，但它的熱穩(wěn)定性較差，通過制粒高溫過程后其活性將損失70%以上，難以在主要的顆粒料中應用(丁強等，中國農業(yè)科技導報，2010，12 (3) ;27 33)。近年來，利用基因工程技術定向改造appA植酸酶提高酶的熱穩(wěn)定性，成為改造植酸酶的一個方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種高耐熱性植酸酶酵母工程菌及其構建方法。本發(fā)明提供的一種高耐熱性植酸酶基因(Appa-M2),其核苷酸序列為SEQ IDN0.1。
該基因通過如下方法得到:根據(jù)GenBank中報道的AppA序列(DQ513832 )，委托生物技術公司合成了植酸酶基因Appa ;分別在5’和3’端加入EcoRI和NotI酶切位點；對Appa序列通過生物信息學分析，找到有兩個可以引進糖基化的潛在糖基化位點，通過引進糖基化提聞在酵母中表達植酸酶的熱穩(wěn)定性；通過定點突變利用互補引物對上述兩個位點進行突變，引入糖基化，合成定點突變引物，下劃線標記為突變位點；Q258N 引物:(CAG-AAC)FQ258N5’ -CTACTTGCTGAACAGAACTCCAGAGG-3，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.3RQ258N5’ -CCTCTGGAGTTCTGTTCAGCAAGTAG-3，其核苷酸序為 SEQ ID N0.4Q349N 引物: (CAG-AAC)FQ349N5’ -CTCTCAATGGATTAACGTTTCGTTGG-3，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.5RQ349N5’ -CCAACGAAACGTTAATCCATTGAGAG-3，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.6獲得能在酵母中高效表達的改良后的植酸酶基因(Appa-M2),其核苷酸序列為SEQID N0.1。與合成了的植酸酶基因Appa相比，改良后的植酸酶基因(Appa-M2)在+ 772、+774、+ 1045和1047位的堿基發(fā)生了改變。導致所編碼的氨基酸序列在+ 259、+ 350位的氨基酸發(fā)生了改變，使得+259Q、+ 350Q改變?yōu)? 259N, + 350N，其氨基酸序列為SEQ ID
N0.2o本發(fā)明提供一種高耐熱性植酸酶酵母工程菌，含有上述基因。本發(fā)明提供一種高耐熱性植酸酶酵母工程菌的構建方法，包括如下步驟:I)將上述改良后的植酸酶基因(Appa-M2)通過限制性內切酶EcoRI和NotI消化，構建到酵母穿梭載體PPIC9上，得到重組載體pPIC9-Appa-M2 ；2)大量制備pPIC9-Appa_M2制粒，然后通過BglII酶進行線性化；3)通過氯化鋰轉化法轉化畢赤酵母GSl 15 ;4)篩選高效表達植酸酶Appa-M2的重組酵母菌株。誘導表達純化Appa-M2植酸酶，對純化得到的植酸酶酶學性質進行分析，結果表明，本研究構建篩選的重組酵母工程菌表達的植酸酶耐熱性能好，85°C保溫10分鐘，殘余酶活可達到60%。本發(fā)明所提供的重組酵母工程菌株經過中試發(fā)酵以后，進一步可用于大規(guī)模的工業(yè)生產植酸酶，本發(fā)明所建立的基因改造，酵母表達體系可以為植酸酶的改造提供新的思路。在飼料和食品工業(yè)中有廣泛的應用前景。


圖l:Appa突變測序2:pPIC9-Appa_M2 酶切鑒定3:pPIC9-Appa-M2BglII內切酶線性化電泳4: pPIC9-Appa-M2轉化酵母RDB培養(yǎng)基轉化5: MD、MM培養(yǎng)基篩選圖
圖6:穩(wěn)定性傳代培養(yǎng)7:提取酵母基因組PCR鑒定Appa-M28:純化SDS-PAGE電泳9:植酸酶最適溫度10:植酸酶最適pH11:植酸酶溫度穩(wěn)定性檢測圖
具體實施例方式實施例1一、植酸酶基因Appa的獲得根據(jù)GenBank中報道的AppA序列(DQ513832)，委托生物技術公司合成植酸酶基因Appa,克隆到T-Easy載體上,得到重組質粒T_Easy_Appa。二、Appa序列糖基化位點分析 當?shù)鞍踪|含有一致性序列Asn-X-Ser/Thr (N_X_S/T ) (X代表任何氨基酸)時，畢赤酵母能對其中天冬氨酰殘基上的酰胺氮進行糖基化，產生N-糖基化。據(jù)相關文獻報道糖基化對酶的熱穩(wěn)定性有重要的影響，序列分析表明，由Appa基因編碼的植酸酶本身有三個糖基化位點，分別為:N139，N204，N317位點。分析發(fā)現(xiàn)，該基因通過改造還有兩個潛在的可以引進糖基化的位點，分別為:Q259，Q350，天冬酰胺N密碼子有:AAT、AAC，酵母中AAC為偏愛密碼子。所以設計突變引物把谷氨酰胺密碼子(CAG)置換為天冬酰胺(N)密碼子(AAC)。三、通過快速定點突變引入糖基化位點利用兩對互補引物(SEQ ID N0.3_6)，使用帶有合成植酸酶基因Appa的重組質粒T-Easy-Appa作為模板,通過PCR技術進行擴增，得到突變后的重組質粒T-Easy-Appa-M2。再經過DpnI消化掉PCR體系中的模板質粒T-Easy-Appa，消化產物轉入大腸桿菌DH5 a大量擴增，提取質粒測序，結果表明Appa-M2突變成功，得到的Appa-M2核苷酸序列SEQ IDN0.1，氨基酸序列SEQ ID N0.2，突變結果見圖1。四、構建酵母重組載體pPIC9_Appa_M2分別對Appa-M2和穿梭載體pPIC9進行EcoRI和NotI消化，酶切產物回收，用酶切后的Appa-M2和pPIC9，按比例混合，用T4連接酶16°C過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 a，涂含氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，純化質粒做EcoRI和NotI酶切鑒定見圖2，pPIC9-Appa-M2酶切后的片段分別為8kb 和 1.236kb。五、pPIC9_Appa_M2制粒大量制備及線性化使用500 μ I反應體系，15 μ I BglII內切酶，50 μ I酶的緩沖液400 μ IpPIC9_Appa_M2,用無菌水補足500 μ I,過夜消化,再經過酹氯仿抽提，20%乙醇沉淀,最后用20 μ I無菌水溶解。消化結果電泳圖見圖3。六、氯化鋰轉化法轉化畢赤酵母Α.感受態(tài)細胞準備:
1.在 50mlYPD 中培養(yǎng)畢赤酵母至 0D600 = 0.8-1.0 (約 108 個 /ml)。2.收集細胞，用25ml滅菌水洗滌，室溫1500g離心lOmin。
3.去除水，用ImllOOmM LiCl重懸細胞。4.將細胞懸液轉至1.5ml離心管中。5.最大轉速沉淀細胞15s，用吸頭吸去LiCl。6.在 400 μ IlOOmM LiCl 中懸浮細胞。7.將50 μ I細胞懸浮液移到1.5ml離心管中，每次用一管，現(xiàn)做現(xiàn)用，不要置于冰上或-20度保存。B.轉化:1.煮沸單鏈DNA5min，快速放于冰水中使變冷，后置于冰上。注意:載體DNA不需。要在每次用之前都煮，在-20度保存等份少量樣品，每次解凍一管，用3-4次后再煮。2.取上面第7步中細胞，離心去除LiCl。3.每個轉化樣品，按順序加入下列試劑，PEG可保護細胞免受高濃度LiCl的有害作用。240 μ 150%PEG,36y IlM LiCl，25 μ 12mg/ml 單鏈 DNA，溶解于 50 μ I 滅菌水中的質粒 DNA (5-10 μ g)。4.劇烈渦旋細胞沉淀至完全混勻(lmin)。5.在30°C孵育30min (不要搖動)。

6.在 42°C 水浴熱擊 20_25min。7.6000-8000rpm離心，將轉化溶液轉移走。8.用Iml滅菌水重懸細胞沉淀。9.在RDB或MD平板上涂25-100 μ 1，在30°C孵育2_4天，轉換結果見圖4。七、高效表達植酸酶Appa_M2酵母菌株篩選方法一(常規(guī)篩選方法):平板篩選:用無菌牙簽挑取上面篩選到的重組子分別點種MM平板和MD平板。在MM和MD上生長一致的，其表型為Mut+。在MD上生長正常，在麗上生長緩慢或不長的，其表型為MutS，見圖5。再經過傳代培養(yǎng)使得植酸酶基因穩(wěn)定整合到酵母基因組上見圖6。PCR 鑒定:挑取平板篩選出的陽性克隆，提取酵母總DNA。1.分別用 IOml MD，MDH，30°C培養(yǎng)重組菌和受體菌(GS115)到 0D600=5_10 (約 12小時)，5000rpm室溫IOmin離心收集細胞，用IOml無菌水洗滌菌體一次。2.將細胞沉淀重懸于新配制的2ml SCED pH7.5緩沖液中[SCED:1M山梨醇，IOmM檸檬酸鈉(pH7.5)，IOmM EDTA, IOmM DTT]，加 0.3mg 消解酶混勻 37°C溫育 50min。3.加2mll%SDS將管倒置數(shù)次混勻內容物，在冰上放置5min，操作應盡可能溫和小心,加入1.5ml5M乙酸鉀(pH8.9),輕柔混勻。12000rpm4°C IOmin離心。棄沉淀取上清。4.上清中加2倍體積無水乙醇，室溫靜置15min，12000rpm4°C 20min離心取沉淀。5.沉淀重懸于0.7ml TE (pH7.4)，輕柔溶解后轉至1.5ml離心管中。6.酚:氯仿(1:1)，氯仿:異戊醇(24:1)各抽提一次離心取水相。7.將水相等份轉移到兩個1.5ml離心管中。加1/2體積7.5M乙酸銨(pH7.5)和2倍體積的無水乙醇，混勻_20°C 60min沉淀。8.12000rpm4°C 20min離心回收核酸，棄上清用70%乙醇洗滌沉淀物，離心棄上清，晾干殘留乙醇，每管沉淀重懸于50iU TE (pH7.5)中，_20°C保存待用。提取的酵母基因組，利用植酸酶特異引物進行PCR擴增，結果見圖7。選取PCR陽性克隆測序，測序結果表明改造后的植酸酶基因已成功整合到酵母基因組上。八、對整合有Appa_M2重組體酵母誘導表達植酸酶及純化A.誘導表達重組酵母500mL BMGY[1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB, 0.00004%Biotin, 1%甘油(體積比)]中，30°C劇烈振搖使細胞生長至飽和狀態(tài)(A600=10 20)，離心收集菌體，加入250mL誘導培養(yǎng)基BMMY (用甲醇代替BM GY中的甘油)，30°C下繼續(xù)誘導培養(yǎng)2天。B.酶的純化對上述得到的發(fā)酵液8000rpm離心30min,將上清用80%硫酸銨沉淀,離心去除上清，再用40mM pH4.5乙酸鈉緩沖液溶解,使用相同緩沖液透析三天,使用陽離子樹脂純化，得到純度98%的植酸酶,再經Hiprep26/10desalting脫去洗脫緩沖液中的氯化鈉得到純酶。SDS-PAGE檢測結果見圖8。九、Appa-M2酶學性質測定 經純化的植酸酶在不同pH及不同溫度條件下進行酶促反應以測定其最適pH和最適溫度，結果見圖9-10 。將酶液在不同溫度(40、50、60、70、80、85、90、95、100°C)下分別處理10分鐘，在37°C、pH4.5的條件下分別測定酶活性以測定酶的熱穩(wěn)定性，結果見圖11。結果顯示，重組酵母工程菌表達的植酸酶Appa-M2耐熱性能好，85°C保溫10分鐘，殘余酶活可達到60%。
權利要求
1.一種高耐熱性植酸酶基因Appa-M2，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.一種高耐熱性植酸酶酵母工程菌,含有權利要求1所述的基因Appa-M2。
3.一種高耐熱性植酸酶酵母工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將權利要求1所述的植酸酶基因Appa-M2通過限制性內切酶EcoRI和NotI消化，構建到酵母穿梭載體PPIC9上，得到重組載體pPIC9-Appa-M2 ； 2)大量制備pPIC9-Appa-M2制粒，然后通過BglII酶進行線性化； 3)通過氯化鋰轉化法轉化畢赤酵母GS115； 4)篩選高效表達植酸酶A ppa-M2的重組酵母菌株。
全文摘要
本發(fā)明通過生物信息學方法對已報道的植酸酶AppA基因進行分析，找出潛在的熱穩(wěn)定相關位點，利用定點突變技術對該基因的關鍵位點進行定點突變，獲得突變基因Appa-M2,將突變基因構建到酵母穿梭載體pPIC9上，轉化到畢赤酵母GS115中，篩選出高效表達耐熱植酸酶的菌株。本發(fā)明構建篩選的重組酵母工程菌表達的植酸酶耐熱性能好，85℃保溫10分鐘，殘余酶活可達到60％。在飼料和食品工業(yè)中有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N15/55GK103205443SQ20131012527
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權日2013年4月11日
發(fā)明者梁愛華, 姚明澤, 王偉, 柴寶峰, 付月君, 張志云, 申泉 申請人:山西大學