專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種螯合鈣，具體是一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法。
背景技術(shù)：
鈣是人體含量最多的礦質(zhì)元素之一，也是體內(nèi)最活躍的元素，具有多種重要的生理功能，是維持神經(jīng)和肌肉正常興奮所必須的成分，也是保證骨骼生長(zhǎng)和維持骨質(zhì)硬度說(shuō)必須的物質(zhì)。然后，缺鈣屬于全球性的健康，最新《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查》結(jié)果表明，我國(guó)約有97 %的人群缺鈣，大部分人屬于一般性缺鈣，少數(shù)人則屬于嚴(yán)重缺鈣，全國(guó)平均每人每日僅為391mg。缺鈣的現(xiàn)象在兒童、婦女和老人中比較普遍，有資料表明，我國(guó)某些地區(qū)3歲以下兒童佝僂病的患病率平均為40% ;全國(guó)有2億婦女患有骨質(zhì)增生及骨質(zhì)疏松癥，孕婦缺鈣人數(shù)為監(jiān)測(cè)對(duì)象的100% ;我國(guó)80歲以上的老年人口約1900萬(wàn)，以及1.6億的老年人都屬于骨質(zhì)疏松重度發(fā)生人群。缺鈣會(huì)給人體造成嚴(yán)重的危害，兒童長(zhǎng)期缺鈣將導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，身體矮小，牙齒不全，易患佝僂病，并有晝驚夜啼、煩躁多動(dòng)和多汗、抽筋等癥狀。青年人缺鈣將導(dǎo)致骨質(zhì)鈣化不良，骨骼軟化，易彎曲，并可導(dǎo)致四肢、脊柱、胸廓和盆腔畸形，在壓力作用下易發(fā)生病理性骨折。中老年人和絕經(jīng)期的婦女缺鈣易發(fā)生骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、背下部疼痛，易發(fā)生生理性骨折，并有高血壓、肥胖病、大腸癌等疾病發(fā)生的可能。孕婦缺鈣不利于胎兒正常生長(zhǎng)、骨骼鈣化、 牙齒形成，孕婦妊娠、分娩、產(chǎn)后哺乳期中由于大量消耗鈣，必須及時(shí)補(bǔ)充足夠的鈣。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上口服鈣劑品種繁多，但大體上分為有機(jī)鈣和無(wú)機(jī)鈣兩種類(lèi)型，有機(jī)鈣主要有葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、醋酸鈣、檸檬酸鈣、果糖酸鈣、氨基酸鈣、L蘇糖酸鈣、三羥基丁酸鈣等，其優(yōu)點(diǎn)是溶度高，胃腸刺激小。無(wú)機(jī)鈣:如磷酸鈣、碳醋鈣、氯化鈣、氫氧化鈣等，優(yōu)點(diǎn)是含鈣量較高，但水溶性不如有機(jī)鈣，且胃腸反應(yīng)較大，如惡心、嘔吐、腹脹等。很多鈣源都不同程度地存在著副作用，如氯化鈣對(duì)胃腸有較大的毒副作用，只能通過(guò)注射方能用于應(yīng)急狀態(tài)下的補(bǔ)鈣；醋酸鈣的急性毒性較大，可引起高鈣血癥、痙攣、軟組織及血管鈣化、腎結(jié)石等病變；氧化鈣的強(qiáng)堿性，使其具有明顯的急性毒性；碳酸鈣要消耗大量的胃酸而造成對(duì)胃腸道的損傷。近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)注螯合鈣的研究，祝德義等(2005)對(duì)膠原多肽和Ca2+的結(jié)合行為進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:膠原多肽和Ca2+之間既有羧基與氨基的配位結(jié)合，又有羧基的離子鍵結(jié)合，還有一定吸附作用。菅景穎(2007)選用豬皮為原料，采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解提取膠原多肽，對(duì)影響酶作用的PH值、溫度、酶濃度、底物濃度、時(shí)間等因素進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，得出水解的最佳工藝條件。并以葡萄糖酸鈣、碳酸鈣為陽(yáng)性對(duì)照研究膠原多肽螯合鈣在防治骨質(zhì)疏松和壯骨方面的效果。結(jié)果表明:膠原多肽螯合鈣無(wú)論是在對(duì)骨質(zhì)疏松的防治中還是在促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)、壯骨作用中，其效果均優(yōu)于葡萄糖酸鈣和碳酸鈣，是一種優(yōu)良的功能性補(bǔ)鈣制劑。付文雯(2010年)以水解度和可溶性多肽得率為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)木瓜蛋白酶、A1398中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶的水解效果進(jìn)行比較。并選用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶來(lái)對(duì)牛骨進(jìn)行分步酶解。復(fù)合酶解最佳工藝為t =
2: 2，E/S = 2: 2，丁 = 55°〇，酶解順序:先堿性蛋白酶后木瓜蛋白酶。經(jīng)葡聚糖凝膠6-25分尚，可將酶解液分成四個(gè)組分，分子量大概分布在117-81283Da之間，主要以4000Da左右的小肽為主。對(duì)以上四個(gè)組分分別進(jìn)行收集，測(cè)其與鈣的螯合率，發(fā)現(xiàn)分子量小于4000Da的小肽(主要是II，III，IV組分)螯合率明顯高于81283Da的肽段(I組分)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低分子短肽與鈣的螯合物具有更好的溶解性、吸收性。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01010220253.1，發(fā)明名稱(chēng)為一種膠原多肽螯合鈣的制備方法，申請(qǐng)?zhí)?00910063282.9，發(fā)明名稱(chēng)為一種由低值淡水魚(yú)骨制備符合氨基酸螯合鈣的方法，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01110412878.2，發(fā)明名稱(chēng)為一種豬骨膠原多肽鈣螯合補(bǔ)鈣劑的制備方法，及專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01110412900.3的一種低分子量羊骨膠原多肽鈣螯合物微膠囊的制備方法的發(fā)明專(zhuān)利中，分別公開(kāi)了采用明膠、魚(yú)骨、豬骨及羊骨膠原蛋白制備螯合鈣的方法，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?CN201110295057.5 一種魚(yú)骨小分子多肽螯合鈣及制備方法介紹了魚(yú)骨蒸煮、搗碎、復(fù)合蛋白酶水解、離心分離、3ku的過(guò)濾膜超濾，與魚(yú)骨粉與復(fù)合酸溶液魚(yú)骨鈣液螯合，干燥，得魚(yú)骨小分子多肽螯合鈣粉。在現(xiàn)有公開(kāi)的蛋白肽螯合鈣制備方法中，都包括蛋白肽的制備方法，但存在以下不足:一是沒(méi)有考慮到肽分子量大小對(duì)螯合鈣性質(zhì)的影響，如水溶解性，在蛋白肽螯合鈣的制備中，分子量大的肽形成螯合鈣后，其水溶解性降低，并出現(xiàn)沉淀，這樣會(huì)影響螯合鈣在體內(nèi)的吸收，目前，在已有的蛋白肽制備方法中，蛋白肽，尤其是2肽、3肽等短肽的比例低，大分子量的肽比例比較高，影響了產(chǎn)品的水溶解性和螯合鈣的生物利用率；其二，現(xiàn)有的蛋白肽的制備方法中，沒(méi)有或很少考慮到蛋白肽的得率，蛋白短肽的制備率較低，這樣會(huì)增加生產(chǎn)的原料成本，同樣的蛋白原料在制備蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的生產(chǎn)率也隨之降低，產(chǎn)品成本高，增加了消費(fèi)者的 負(fù)擔(dān)。除此之外，在蛋白肽與鈣的螯合過(guò)程中，為了提高螯合效率和提高螯合度，即單位重量螯合鈣產(chǎn)品中螯合鈣的量，除了蛋白肽的性質(zhì)、螯合工藝中的溫度、時(shí)間、PH等參數(shù)條件外，需要足夠的可溶性鈣才有利于提高產(chǎn)品中螯合鈣的量。因此，在螯合反應(yīng)中，為了提高螯合鈣在產(chǎn)品中的比例，通常需要加入過(guò)量的可溶性鈣，如氯化鈣、氫氧化鈣等。由于氯化鈣、氫氧化鈣對(duì)人體胃腸有比較嚴(yán)重的副作用，因此，在螯合反應(yīng)完成后，需要去除溶液中多余的氯化鈣、氫氧化鈣?，F(xiàn)有采用氯化鈣或氫氧化鈣制備螯合鈣的方法中，均是采用無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀，來(lái)除去多余的氯化鈣或氫氧化鈣，乙醇的濃度需要達(dá)到90%以上，才能將螯合反應(yīng)溶液中的短肽螯合鈣沉淀完全，沉淀的蛋白肽螯合鈣需要反復(fù)用乙醇清洗，清洗干凈的蛋白肽螯合鈣經(jīng)干燥得到蛋白肽螯合鈣產(chǎn)品，沉淀和清洗用的乙醇經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇。這樣，在工業(yè)化生產(chǎn)中，需要使用大量的酒精，生產(chǎn)成本高，且存在有機(jī)溶劑易燃易爆的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，該方法采用二次水解來(lái)得到高品質(zhì)的蛋白質(zhì)短肽水解液，然后采用過(guò)量的可溶性鈣來(lái)進(jìn)行螯合，生產(chǎn)的螯合鈣產(chǎn)品中鈣的含量高，并且采用有效的方法去除螯合過(guò)程中多余的氯化鈣或氫氧化鈣，產(chǎn)品質(zhì)量好，生產(chǎn)安全性高，大大簡(jiǎn)化了工藝，節(jié)約了成本。
本發(fā)明的技術(shù)方案:所述一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于具體步驟如下:(I)將原料蛋白經(jīng)過(guò)清洗、破碎后與水按重量比1: 5 20混合，并將混合物送入膠體磨微細(xì)化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質(zhì)濃度為2% 10%原料液，并對(duì)其進(jìn)行殺菌后加入蛋白水解酶進(jìn)行第一次水解，第一次水解的條件為 溫度30 60°C，pH2 10，時(shí)間1.0 6小時(shí)，蛋白水解酶與原料蛋白的質(zhì)量比為1% 10% ；(2)將步驟(I)中第一次水解后的水解液經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾后分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，并將其分別收集起來(lái)；然后將收集的水解液液相部分采用截留分子量為1000 6000Da超濾膜進(jìn)行超濾，將超濾膜非透過(guò)的大分子肽液和透過(guò)的小分子低聚肽液分別收集起來(lái)；(3)將步驟(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超濾后收集的非透過(guò)的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，并加水控制二次水解原料液中蛋白質(zhì)濃度在1% 10%之間，然后加入蛋白水解酶進(jìn)行第二次水解，第二次水解的條件為:溫度30 60°C, pH2-10，時(shí)間I 5小時(shí)，蛋白水解酶與二次水解原料液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1% 10% ；(4)將步驟(3)中二次水解后的水解液經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾后采用截留分子量(molecular weight cutoff)為1000 6000Da的超濾膜超濾,將超濾膜透過(guò)的小分子低聚肽液收集起來(lái)并與步驟(2)中第一次水解液超濾后的透過(guò)的小分子低聚肽液一起依次經(jīng)過(guò)純化，得到分子量小的蛋白質(zhì)短肽水解液；(5)在步驟⑷中得到的蛋白質(zhì)短肽水解液加入氫氧化鈣(CaCl2)或氯化鈣Ca(OH)2 在溫度為 20-70°C、pH 4.0-9.0 的條件下螯合 20_60min ；(6)測(cè)量出步驟(5)中螯合反應(yīng)完畢后的螯合液中剩余游離鈣離子的濃度，根據(jù)螯合液中剩余游離鈣離子的濃度加入與螯合液中剩余的游離鈣離子完全反應(yīng)量的碳酸鈉，在室溫下充分?jǐn)嚢?-15分鐘，使碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應(yīng)形成碳酸鈣沉淀，并將完全反應(yīng)后的螯合液的PH調(diào)為中性，然后過(guò)濾去除碳酸鈣沉淀；其中:定量加入碳酸鈉的量也可以適當(dāng)超過(guò)與氯化鈣或氫氧化鈣反應(yīng)所需的量，超出量控制在以能完全與氯化鈣或氫氧化鈣反應(yīng)為原則，過(guò)濾采用板框式過(guò)濾法進(jìn)行過(guò)濾；(7)將步驟(6)中完成反應(yīng)且pH為中性的螯合液依次采用納濾膜脫鹽、殺菌、濃縮、干燥后得到蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品。步驟⑴中所用的原料蛋白包括食品級(jí)的動(dòng)物蛋白、植物蛋白或微生物蛋白。其中食品級(jí)植物蛋白包括大 蛋白、玉米蛋白、跳 蛋白等，食品級(jí)動(dòng)物蛋白包括水生動(dòng)物蛋白和陸生動(dòng)物蛋白，食品級(jí)動(dòng)物蛋白包括陸生動(dòng)物蛋白和水生動(dòng)物蛋白，包括蛋清蛋白、雞肉蛋白、豬肉蛋白、牛肉蛋白、牛奶蛋白、昆蟲(chóng)蛋白以及魚(yú)皮膠原蛋白、魚(yú)骨膠原蛋白、魚(yú)肉蛋白、牡蠣蛋白、海參蛋白、貝類(lèi)蛋白等，微生物蛋白包括酵母蛋白、藻類(lèi)蛋白等。在步驟(I)和步驟⑶中所用的蛋白水解酶，包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一種或任意兩種的混合物，任意兩種混合的比例為I 3: 3 I。步驟(I )中，經(jīng)膠體磨分散均勻的原料液體在70 100°C，10秒-15分鐘時(shí)間的條件下采用常壓殺菌法殺菌，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時(shí)殺菌法進(jìn)行殺菌，然后采用板式冷卻器冷卻到30 60°C后再加入蛋白水解酶進(jìn)行第一次水解。步驟⑵和步驟⑷中的離心采用臥螺離心或沉降離心，管式離心機(jī)分離出水解的蛋白肽液，再經(jīng)板框式或?yàn)V袋式或?yàn)V芯式或陶瓷膜方式的過(guò)濾法進(jìn)行過(guò)濾，得到透明度良好的蛋白肽溶液。在步驟(5)中，螯合時(shí)使用的可溶性鈣原料為氯化鈣時(shí)，氯化鈣與蛋白質(zhì)短肽的質(zhì)量比為1: 1-1: 3，反應(yīng)完畢后的螯合液呈酸性，可以加入堿性物質(zhì)比如氫氧化鈉調(diào)節(jié)螯合液的pH，使其呈中性，產(chǎn)生的鹽可以直接通過(guò)步驟(7)中的納濾脫鹽的方法脫掉；螯合中使用的可溶性鈣原料為氫氧化鈣時(shí)，氫氧化鈣與蛋白質(zhì)短肽的質(zhì)量比為1: 1-1: 2，反應(yīng)完畢后的螯合液呈堿性，含有少量的氫氧化鈉，加入濃度為用濃度在l_3mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)螯合液的PH，使其呈中性，反應(yīng)完畢后的鈉鹽可以通過(guò)步驟(7)中的納濾脫鹽將其脫掉。在步驟(5)采用EDTA滴定法測(cè)定反應(yīng)完畢的螯合液中游離鈣的含量，根據(jù)螯合液中存在的游離鈣含量，在螯合反應(yīng)液中定量加入碳酸鈉，使氯化鈣或氫氧化鈣與碳酸鈉反應(yīng)生成碳酸鈣沉淀，并使用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)其pH為中性。具體測(cè)定方法為:取定量的IOOml反應(yīng)完成的溶液，乙醇沉淀去除蛋白肽螯合鈣，過(guò)濾去蛋白肽螯合鈣，剩余溶液采用EDTA法測(cè)游離鈣含量方法測(cè)定鈣的含量。在步驟(7)中，納濾脫鹽中采用納濾膜截留分子量在100_300Da，納濾一遍或多遍，直到氯化鈉(NaCl)的含量達(dá)到產(chǎn)品要求為止。在步驟(7)中的殺菌采用在70 100°C，10秒-15分鐘時(shí)間的條件下常壓殺菌法，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時(shí)殺菌法，然后采用板式冷卻器冷卻到40 60°C，之后采用真空濃縮，溫度30 70°C，-0.1Mpa -0.05Mpa，使?jié)饪s液中固形物含量在20-40%，濃縮好的蛋白質(zhì)短肽螯合鈣液，采用噴霧干燥或冷凍干燥或真空干燥，控制產(chǎn)品中的水分在10%以?xún)?nèi)。 采用碳酸鈉反應(yīng)去除螯合反應(yīng)溶液中氯化鈣的化學(xué)反應(yīng)如下:CaCl2+Na2C03—~- CaCO3 丨 +2NaCl采用碳酸鈉反應(yīng)去除螯合反應(yīng)溶液中氫氧化鈣的化學(xué)反應(yīng)如下:Ca (OH) 2+Na2C03—~- CaCO3 丨 +2Na0HNaOH+HCl — NaCl+H20上述反應(yīng)中生成的NaCl通過(guò)納濾法去除。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):1.本發(fā)明采用兩次水解來(lái)制備蛋白質(zhì)短肽酶水解液，大大提高了蛋白質(zhì)短肽的得率和原料蛋白的利用率，降低生產(chǎn)成本；2.本發(fā)明采用兩次水解來(lái)制備蛋白質(zhì)短肽，提高了 2肽、3肽等短肽的得率，普通工藝生成的蛋白肽中，分子量在580Da以下的短肽的比例一般在30% _40%，而采用本工藝生成的蛋白肽中，分子量在580Da以下的短肽的比例可以達(dá)到60%-70%，因此，采用本技術(shù)生成的蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品的水溶解性明顯提高；3.本發(fā)明采用適當(dāng)過(guò)量的可溶性鈣來(lái)進(jìn)行螯合，可以使蛋白短肽與可溶性鈣充分螯合，生產(chǎn)的螯合鈣產(chǎn)品中的鈣含量高；4.本發(fā)明采用碳酸鈉來(lái)去除螯合液中多余的氯化鈣和氫氧化鈣，可以快速、安全的除掉了螯合液中的氯化鈣和氫氧化鈣成分，同時(shí)，研究表明，添加的碳酸鈉不會(huì)與已經(jīng)與蛋白質(zhì)短肽螯合的鈣發(fā)生反應(yīng)，所得到的蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品質(zhì)量好，生產(chǎn)安全性高，由于省略乙醇沉淀和酒精回收工序，大大簡(jiǎn)化了工藝，節(jié)約了有機(jī)溶劑的使用成本，也提高了生產(chǎn)安全性。
具體實(shí)施例工藝流程為:原料蛋白一加水混合一殺菌、冷卻一第一次蛋白水解酶水解一第一次水解液分離一第一次分離液超濾一收集第一次水解液分離的固相部分和超濾非透過(guò)部分，進(jìn)行第二次蛋白水解酶水解一第二次水解液分離一第二次分離液超濾一第一次和第二次超濾透過(guò)液合并一純化(脫鹽、脫色)一加入可溶性鈣離子螯合一定量加入碳酸鈉反應(yīng)—調(diào)pH中性一去碳酸鈣沉淀一納濾脫鹽一殺菌一濃縮一干燥實(shí)施例一一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備 方法，其特征在于具體步驟如下:(1)將淡水白鰱魚(yú)皮經(jīng)清洗，破碎，與水按1: 15混合，并將混合物送入膠體磨微細(xì)化處理使原料蛋白充分分散均勻，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度在5%，磨細(xì)并分散均勻的原料液體在85°C的條件下常壓殺菌60秒，并采用板式冷卻器冷卻到50°C，加入原料液中蛋白質(zhì)質(zhì)量的3.0%添加堿性蛋白酶進(jìn)行水解，酶水解條件為50°C，初始pH9.0，時(shí)間4小時(shí)。(2)將步驟(I)中第一次水解后的水解液經(jīng)過(guò)采用臥螺離心和板框過(guò)濾方式分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，并將其分別收集起來(lái)；然后將收集的水解液液相部分采用截留分子量(molecular weight cutoff)為2000Da的超濾膜進(jìn)行超濾,將超濾膜非透過(guò)的大分子肽液和透過(guò)的小分子低聚肽液分別收集起來(lái)；(3)將步驟(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超濾后收集的非透過(guò)的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，測(cè)定分離成分中的蛋白質(zhì)含量，再定量加水控制二次水解原料液中蛋白質(zhì)濃度在5%，然后加入木瓜蛋白酶進(jìn)行第二次水解，第二次水解的條件為:溫度45°C，pH6.5，時(shí)間4小時(shí)，木瓜蛋白酶與二次水解原料液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1.5% ；(4)將步驟(3)中二次水解后的水解液經(jīng)臥螺離心、板框過(guò)濾后，進(jìn)一步采用截留分子量為2000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過(guò)的小分子低聚肽液收集起來(lái)并與步驟(2)中第一次水解液超濾后的透過(guò)的小分子低聚肽液一起依次經(jīng)過(guò)樹(shù)脂脫鹽、活性炭脫色后，得到分子量小的蛋白質(zhì)短肽水解液；(5)在步驟(4)中得到的蛋白質(zhì)短肽水解液加入CaCl2,使其在溫度為50°C、pH
6.0的條件下螯合50min，其中CaCl2與蛋白短肽的質(zhì)量比為1:2;(6)步驟(5)中螯合反應(yīng)完畢后，采用EDTA法測(cè)游離鈣含量，根據(jù)溶液中剩余游離鈣的含量，計(jì)算碳酸鈉的添加量，在溶液中加入計(jì)算好的與螯合液中剩余的游離鈣離子完全反應(yīng)的碳酸鈉，在常溫下反應(yīng)lOmin，板框過(guò)濾去除碳酸鈣沉淀，反應(yīng)完畢后的螯合液呈弱酸性，可以加入氫氧化鈉將其調(diào)整為中性，之后采用截留分子量為200Da的納濾膜納濾3遍脫鹽，使產(chǎn)品中氯化鈉的含量達(dá)到產(chǎn)品要求，脫鹽后的螯合液在121°C的條件下高溫殺菌2秒，并冷卻到50°C，然后在溫度為溫度50°C的-0.1Mpa真空條件下，真空濃縮，使固形物含量達(dá)到35%，噴霧干燥，控制產(chǎn)品中的水分在10%以?xún)?nèi)，即得到蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品。實(shí)施例二
一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于具體步驟如下:(I)將食品級(jí)大豆分離蛋白經(jīng)過(guò)清洗、破碎后與水按重量比1: 15混合，并將混合物送入膠體磨微細(xì)化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質(zhì)濃度為6%原料液，將在121°C的條件下高溫殺菌2秒，采用板式冷卻器冷卻到45°C后加入木瓜蛋白酶進(jìn)行第一次水解，第一次水解的條件為:溫度為50°C，pH6，時(shí)間6小時(shí)，蛋白水解酶與原料蛋白的質(zhì)量比為4% ；(2)將步驟(I)中第一次水解后的水解液采用沉降離心機(jī)離心和板框過(guò)濾方式分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，并將其分別收集起來(lái)；然后將收集的水解液液相部分采用截留分子量為4000Da超濾膜進(jìn)行超濾，將超濾膜非透過(guò)的大分子肽液和透過(guò)的小分子低聚肽液分別收集起來(lái)；(3)將步驟(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超濾后收集的非透過(guò)的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，測(cè)定混合物中的蛋白質(zhì)含量，再定量加水控制第二次水解原料液中蛋白質(zhì)濃度在3-5 %，然后在調(diào)配好的第二次水解原料液中同時(shí)加入堿性蛋白酶和胃蛋白酶，第二次水解的條件為:溫度45°C，pH9.5，時(shí)間5小時(shí)，堿性蛋白酶和胃蛋白酶的質(zhì)量比為1: 1，且兩種酶混合量與二次水解原料液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為 2.5% ;(4)將步驟(3)中二次水解后的水解液經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾后采用截留分子量為4000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過(guò)的小分子低聚肽液收集起來(lái)并與步驟(2)中第一次水解液超濾后的透過(guò)的小分子低聚肽液一起依次經(jīng)過(guò)樹(shù)脂脫鹽、活性炭脫色，得到分子量小的蛋白質(zhì)短妝水解液；(5)在步驟(4)中得到的蛋白質(zhì)短肽水解液加入氫氧化鈣在溫度為60°C、pH 6.0的條件下螯合60min，氫氧化鈣與蛋白質(zhì)短肽的質(zhì)量比為1: 1.5 ;(6)步驟(5)中螯合反應(yīng)完畢后采用EDTA法測(cè)游離鈣含量，根據(jù)溶液中剩余游離鈣的濃度，加入與螯合液中剩余的游離鈣離子完全反應(yīng)的碳酸鈉，在常溫下攪拌15min，使用碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應(yīng)形成碳酸鈣沉淀，采用板框過(guò)濾去除碳酸鈣沉淀，并用濃度在l_3mol/L的鹽酸將反應(yīng)完畢后螯合液的pH調(diào)為中性；(7)將步驟(6)中過(guò)濾后且pH為中性的螯合液采用截留分子量為250Da的納濾膜納濾5遍脫鹽，使產(chǎn)品中氯化鈉的含量達(dá)到產(chǎn)品要求，脫鹽后的蛋白短肽螯合鈣液在115°C條件下高溫殺菌6秒，并冷卻到50°C，后再-0.1Mpa真空條件下濃縮，使固形物含量達(dá)到35 %，冷凍干燥，控制產(chǎn)品中的水分在10 %以?xún)?nèi)，即得到蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品。實(shí)施例三(I)將食品級(jí)蛋清蛋白粉與水按重量比1: 12混合，并將混合物送入膠體磨微細(xì)化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質(zhì)濃度為8%原料液，并在110°C的條件下高溫殺菌5秒之后冷卻到50°C，再加入中性蛋白酶進(jìn)行第一次水解，第一次水解的條件為:溫度50 V，pH7，時(shí)間6小時(shí)，中性蛋白酶與原料蛋白的質(zhì)量比為4% ;(2)將步驟(I)中第一次水解后的水解液經(jīng)過(guò)臥螺離心機(jī)-管式離心機(jī)離心兩次連續(xù)離心，板框過(guò)濾分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，并將其分別收集起來(lái)；然后將收集的水解液液相部分采用截留分子量 為5000Da超濾膜進(jìn)行超濾，將超濾膜非透過(guò)的大分子肽液和透過(guò)的小分子低聚肽液分別收集起來(lái)；
(3)將步驟(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超濾后收集的非透過(guò)的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，測(cè)定混合原料物中的蛋白質(zhì)含量，再定量加水控制二次水解原料液中蛋白質(zhì)濃度在7.5%左右，同時(shí)計(jì)入中性蛋白酶、胃蛋白酶進(jìn)行第二次水解，第二次水解的條件為 溫度45°C，pH7，時(shí)間4小時(shí)，中性蛋白酶和胃蛋白酶的質(zhì)量比為1: 1，兩種酶混合后的量與二次水解原料液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1% 10% ；(4)將步驟(3)中二次水解后的水解液經(jīng)過(guò)采用沉降離心，板框過(guò)濾后采用截留分子量為5000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過(guò)的小分子低聚肽液收集起來(lái)并與步驟(2)中第一次水解液超濾后的透過(guò)的小分子低聚肽液一起依次經(jīng)過(guò)納濾脫鹽、活性炭脫色，得到分子量小的蛋白質(zhì)短肽水解液；(5)在步驟⑷中得到的蛋白質(zhì)短肽水解液加入氯化鈣在溫度為40°C、pH 5的條件下螯合30min，其中CaCl2與蛋白質(zhì)短肽的質(zhì)量比為1: 2.0;(6)步驟(5)中螯合反應(yīng)完畢后的螯合液采用EDTA法測(cè)游離鈣含量，根據(jù)溶液中剩余游離鈣的濃度，加入與螯合液中剩余的游離鈣離子完全反應(yīng)的碳酸鈉，在常溫下反應(yīng)5min，使碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應(yīng)形成碳酸鈣沉淀，通過(guò)板框過(guò)濾法去除碳酸鈣沉淀，并用濃度在l-3mol/L的鹽酸將反應(yīng)液的pH調(diào)為中性，之后采用截留分子量為200Da的納濾膜納濾5遍脫鹽，使產(chǎn)品中氯化鈉的含量達(dá)到產(chǎn)品要求，脫鹽后的螯合液在110°C的條件下高溫殺菌15秒殺菌，并冷卻到50°C后在-0.1Mpa真空條件下濃縮，使固形物含量達(dá)到30%，噴霧干燥，控制產(chǎn)品中的水分在10%以?xún)?nèi)，即得到蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品。采用以上實(shí)施例分子量在580Da以下的短肽的比例可以達(dá)到60% _70%，明顯提高了蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品 的水溶 解性。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于具體步驟如下: (1)將原料蛋白經(jīng)過(guò)清洗、破碎后與水按重量比1: 5 20混合，并將混合物送入膠體磨微細(xì)化處理使原料蛋白充分分散均勻形成蛋白質(zhì)濃度為2% 10%原料液，并對(duì)其進(jìn)行殺菌后加入蛋白水解酶進(jìn)行第一次水解，第一次水解的條件為:溫度30 60°C,pH2 10，時(shí)間1.0 6小時(shí)，蛋白水解酶與原料蛋白的質(zhì)量比為1% 10% ； (2)將步驟(I)中第一次水解后的水解液經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾后分離出未水解的固相部分和水解液液相部分，并將其分別收集起來(lái)；然后將收集的水解液液相部分采用截留分子量為1000 6000Da超濾膜進(jìn)行超濾，將超濾膜非透過(guò)的大分子肽液和透過(guò)的小分子低聚肽液分別收集起來(lái)； (3)將步驟(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超濾后收集的非透過(guò)的大分子肽液均勻混合形成第二次水解原料液，并加水控制第二次水解原料液中蛋白質(zhì)濃度在1% 10%之間，然后加入蛋 白水解酶進(jìn)行第二次水解，第二次水解的條件為:溫度30 60°C, pH2-10，時(shí)間I 5小時(shí)，蛋白水解酶與二次水解原料液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1% 10% ； (4)將步驟(3)中第二次水解后的水解液經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾后采用截留分子量為1000 6000Da的超濾膜超濾，將超濾膜透過(guò)的小分子低聚肽液收集起來(lái)并與步驟(2)中第一次水解液超濾后的透過(guò)的小分子低聚肽液一起依次經(jīng)過(guò)純化，得到分子量小的蛋白質(zhì)短肽水解液； (5)在步驟(4)中得到的蛋白質(zhì)短肽水解液加入氫氧化鈣或氯化鈣在溫度為20-70°C、pH 4.0-9.0的條件下螯合20-60min ； (6)測(cè)量出步驟(5)中螯合反應(yīng)完畢后的螯合液中剩余游離鈣離子的濃度，根據(jù)螯合液中剩余游離鈣離子的濃度加入與螯合液中剩余的游離鈣離子完全反應(yīng)量的碳酸鈉，在室溫下充分?jǐn)嚢?-15分鐘，使碳酸鈉與氯化鈣或氫氧化鈣充分反應(yīng)形成碳酸鈣沉淀，并過(guò)濾去除碳酸鈣沉淀沉淀，之后調(diào)整反應(yīng)完畢的螯合液的PH呈中性； (7)將步驟(6)中去除碳酸鈣沉淀沉淀且pH為中性的螯合液依次采用納濾膜脫鹽、殺菌、濃縮、干燥后得到蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所用的原料蛋白包括食品級(jí)的動(dòng)物蛋白、植物蛋白或微生物蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:在步驟(I)和步驟(3)中所用的蛋白水解酶，包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一種或任意兩種的混合物，任意兩種混合的比例為I 3: 3 I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，經(jīng)膠體磨分散均勻的原料液體在70 100°C，10秒-15分鐘時(shí)間的條件下采用常壓殺菌法殺菌，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時(shí)殺菌法進(jìn)行殺菌，然后采用板式冷卻器冷卻到30 60°C后再加入蛋白水解酶進(jìn)行第一次水解。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:步驟(2)和步驟(4)中的離心采用臥螺離心或沉降離心，管式離心機(jī)分離出水解的蛋白肽液，再經(jīng)板框式或?yàn)V袋式或?yàn)V芯式或陶瓷膜方式的過(guò)濾法進(jìn)行過(guò)濾，得到透明度良好的蛋白質(zhì)短肽溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:在步驟(5)中，螯合時(shí)使用的可溶性鈣原料為氯化鈣時(shí)，氯化鈣與螯合液中蛋白質(zhì)短肽的質(zhì)量比為1:1-1: 3;螯合中使用的可溶性鈣原料為氫氧化鈣時(shí)，氫氧化鈣與蛋白質(zhì)短肽的質(zhì)量比為1: 1-1: 2,完全反應(yīng)后,并用濃度在l-3mol/L的鹽酸將反應(yīng)液的pH調(diào)為中性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:在步驟(5)采用EDTA滴定法測(cè)定反應(yīng)完畢的螯合液中游離鈣的含量，根據(jù)螯合液中存在的游離鈣含量，在螯合反應(yīng)液中定量加入碳酸鈉，使氯化韓或氫氧化韓與碳酸鈉反應(yīng)生成碳酸韓沉淀，并使用鹽酸調(diào)節(jié)其PH為中性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:在步驟(7)中，納濾脫鹽中采用納濾膜截留分子量在100-300Da，納濾一遍或多遍，使產(chǎn)品中氯化鈉的含量達(dá)到產(chǎn)品要求為止。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法，其特征在于:在步驟(7)中的殺菌采用在70 100°C，10秒-15分鐘時(shí)間的條件下常壓殺菌法，或在105-121°C，2秒-30秒的條件下超高溫短時(shí)殺菌法，然后采用板式冷卻器冷卻到40 60°C，之后采用真空濃縮，溫度30 70°C，-0.1Mpa -0.05Mpa，使?jié)饪s液中固形物含量在20_40%，濃縮好的蛋白質(zhì)短肽螯合鈣液，采用噴霧干燥或冷凍干燥或真空干燥，控制產(chǎn)品中的水分在10 %以?xún)?nèi)。`
全文摘要
本發(fā)明提高一種蛋白質(zhì)短肽螯合鈣的制備方法。所述方法為將原料蛋白與水混合細(xì)化處理并殺菌后，加入蛋白水解酶進(jìn)行第一次水解，將第一次水解后分離的液體部分采用截留分子量為1000～6000Da超濾膜進(jìn)行超濾，并將超濾膜非透過(guò)的大分子肽液和第一次水解分離的固相部分混合后加入蛋白水解酶進(jìn)行第二次水解，并將兩次水解超濾后的小分子低聚肽液經(jīng)純化后加入氫氧化鈣或氯化鈣螯合，完畢后定量的碳酸鈉在pH為中性時(shí)完全反應(yīng)，過(guò)濾除去沉淀，再依次經(jīng)過(guò)納濾膜脫鹽、殺菌、濃縮、干燥后得到蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品。本發(fā)明大大提高了蛋白質(zhì)短肽的得率和原料蛋白的利用率，降低生產(chǎn)成本，所得到的蛋白質(zhì)短肽螯合鈣產(chǎn)品質(zhì)量好，生產(chǎn)安全性高。
文檔編號(hào)A23L1/304GK103230020SQ20131012865
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者劉良忠, 劉閃, 王夢(mèng)穎 申請(qǐng)人:武漢工業(yè)學(xué)院