一種重組表達(dá)木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌，所述工程菌攜帶有能表達(dá)斜臥青霉（Penicillium?decumbens）的木聚糖酶基因的表達(dá)載體。利用本發(fā)明的畢赤酵母工程菌高效表達(dá)的木聚糖酶，在酸性條件下具有很高的活性，且對底物專一性高。所述木聚糖酶可被廣泛用于低聚木糖的生產(chǎn)。
【專利說明】一種重組表達(dá)木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組表達(dá)木聚糖酶基因的畢赤酵母 工程菌及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 低聚木糖亦稱木寡糖（xylooligosaccharides)，是由2?10個D-木糖以 β-1，4-木糖苷鍵結(jié)合而成的非均一性多糖，是功能性低聚糖家族中的一個重要成員。低聚 木糖有明顯的雙歧桿菌增殖作用，而且除青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和長雙歧桿菌外，大 多數(shù)腸道菌對低聚木糖的利用都比較差，能抑制腸道有害菌的生長發(fā)育；低聚木糖不被消 化，與其他的低聚糖相比，木二糖在消化系統(tǒng)中最穩(wěn)定，不被消化酶水解，可滿足患有諸如 糖尿病、肥胖病和高血脂癥等特殊人群的需要；低聚木糖有抗齲齒，有利于口腔健康；低聚 木糖促進(jìn)人體對鈣的吸收，防止老化和骨質(zhì)疏松癥。低聚木糖已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健品、 乳品飲料、食品和詞料等。
[0003] 低聚木糖的生產(chǎn)通常是采用物理、化學(xué)及酶解等方法水解富含木聚糖的原料，然 后對產(chǎn)物進(jìn)行提取精制。制備低聚木糖的原料是木聚糖，它在玉米芯、甘蔗渣、棉籽殼和燕 麥、樺木等農(nóng)林產(chǎn)品中含量相對較高，平均可達(dá)30%左右。目前生產(chǎn)低聚木糖的主要方法是 酶法水解木聚糖。利用內(nèi)切木聚糖酶水解木聚糖底物得到的以木二糖、木三糖為主要成分 的混合物。而酶解法的關(guān)鍵在于木聚糖酶對應(yīng)底物的適應(yīng)性，即選擇合適的木聚糖酶。
[0004] 很多微生物如細(xì)菌、霉菌和放線菌等均能產(chǎn)生木聚糖酶。木聚糖酶來源不同，結(jié)構(gòu) 和性質(zhì)也不盡相同，其酶解木聚糖后釋放出的寡糖鏈長也不相同。而木二糖、木三糖和木四 糖是低聚木糖中功效較好的組分，因此這幾種組分在酶解產(chǎn)物中含量越高越好。目前人們 研究和應(yīng)用最多的是細(xì)菌和霉菌來源的木聚糖酶，其酶解木聚糖的產(chǎn)物中木二糖?木四糖 的含量比較低，而木糖及其他鏈長度組分含量較高。因此，現(xiàn)在急需開發(fā)出性能更好、專一 性更強(qiáng)的木聚糖酶，更廣泛的應(yīng)用于低聚木糖的生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種重組表達(dá)木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，即利用基因工程 技術(shù)手段，將斜臥青霉（Penicillium decumbens)的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，構(gòu)建 畢赤酵母工程菌株。該菌株能高效表達(dá)木聚糖酶，且生產(chǎn)的木聚糖酶在酸性條件下具有較 高的活性。該酶對底物的專一性強(qiáng)，利用其酶解作用生產(chǎn)的低聚木糖中二糖、三糖和四糖的 含量高，適用于高效生產(chǎn)低聚木糖。
[0006] 申請人:經(jīng)過大量的篩選后，發(fā)現(xiàn)將克隆自斜臥青霉的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵 母中，畢赤酵母表達(dá)的木聚糖酶對底物的專一性很強(qiáng)，從而促成本發(fā)明。
[0007] -方面，本發(fā)明提供了一種克隆自斜臥青霉的木聚糖酶，該木聚糖酶的最適pH 值為5.0,在pH4. 0-7.0的范圍內(nèi)能保持80%以上的活性；最適反應(yīng)溫度為60°C，在溫度 40-70°C的范圍內(nèi)，能保持50%以上的活性。
[0008] 本發(fā)明所述的斜臥青霉的木聚糖酶，其具有
[0009] 1) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；或者
[0010] 2)在SEQ ID NO: 1中取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸得到的具有斜臥青霉的 木聚糖酶活性的氨基酸序列。
[0011] 本發(fā)明所述的斜臥青霉的木聚糖酶的編碼基因?yàn)?br> [0012] 1)核苷酸序列SEQ ID N0:2所示的DNA分子；
[0013] 2)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:2所示核苷酸序列雜交且編碼具有木聚糖酶活性的 蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0014] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，上述的斜臥青霉的木聚糖酶的編碼基因具有 SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。
[0015] 本發(fā)明所述木聚糖酶能針對性的酶解木聚糖。酶解產(chǎn)物中低聚木二糖?低聚木七 糖的含量高于70%，低聚木二糖?低聚木四糖含量高于50%，單糖含量低于30%。
[0016] 因此，本發(fā)明另一方面提供了上述木聚糖酶在生產(chǎn)低聚木糖中的用途。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供了一種重組畢赤酵母工程菌，該工程菌攜帶有能表達(dá)所述 斜臥青霉木聚糖酶基因的表達(dá)載體。
[0018] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述的表達(dá)載體為pPIC9K，篩選標(biāo)記為遺傳霉素。
[0019] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，其中所述的畢赤酵母工程菌為畢赤酵母菌株GS115。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供了上述畢赤酵母工程菌在生產(chǎn)木聚糖酶中的用途。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供了用于克隆木聚糖酶編碼基因的引物對，其核苷酸序列 為
[0022] 引物 F :5' -GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG-3' (SEQ ID N0:3)
[0023] 引物 R :5' -TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA-3' (SEQ ID NO:4)
[0024] 另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)低聚木糖的方法，該方法包括：
[0025] (1)發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明所述的畢赤酵母工程菌，獲得本發(fā)明所述的木聚糖酶；
[0026] (2)用所述木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖產(chǎn)物。
[0027] 本發(fā)明所述的含木聚糖的原料包括但不限于玉米芯、甘蔗渣、棉籽殼和燕麥、樺木 等。
[0028] 在本發(fā)明的低聚木糖產(chǎn)物中，低聚木二糖?低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二 糖?低聚木四糖含量高于50%，單糖含量低于30%。
[0029] 發(fā)明優(yōu)點(diǎn)
[0030] 本發(fā)明構(gòu)建了高效表達(dá)斜臥青霉木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌，其生產(chǎn)的木聚 糖酶在酸性范圍內(nèi)具有較高的酶活性，最適pH值為5. 0,在PH4. 0-7. 0的范圍內(nèi)能保持80% 以上的活性；最適反應(yīng)溫度為60°C，在溫度40-70°C的范圍內(nèi)，能保持50%以上的活性。該 木聚糖酶具有很強(qiáng)的底物專一性，能針對性的酶解木聚糖。本發(fā)明的木聚糖酶可應(yīng)用于低 聚木糖的生產(chǎn)，產(chǎn)物中低聚木二糖?低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖?低聚木四糖 含量高于50%，單糖含量低于30%，應(yīng)用前景廣泛。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1、木聚糖酶基因XynQl的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0032] 圖2、構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPIC9K_XynQl示意圖。
[0033] 圖3、畢赤酵母工程菌發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳圖，箭頭所示為重組木聚糖酶 XYNQ1。
[0034] 圖4、重組木聚糖酶XYNQ1的發(fā)酵曲線。
[0035] 圖5、重組木聚糖酶XYNQ1的pH特性分析。
[0036] 圖6、重組木聚糖酶XYNQ1的反應(yīng)溫度分析。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。但實(shí)例僅限于說明，并不限于此。下 列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook) 等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域 相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要 求范圍不限于所提供的案例。
[0038] 實(shí)施例
[0039] 實(shí)施例1斜臥青霉木聚糖酶基因的克隆
[0040] 查閱GenBank中的基因序列，找到糖苷水解酶10家族中的一個木聚糖酶基因，該 基因來源于斜臥青霉（Penicillium decumbens)，GenBank號為HQ286638. 1。通過上海捷瑞 生物工程有限公司合成該木聚糖酶基因，命名為XynQl，并對合成基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化， 優(yōu)化后的基因序列為SEQ ID N0. 2,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0. 1。
[0041] 采用PCR反應(yīng)克隆木聚糖酶基因 XynQl片段，引物和反應(yīng)條件如下：
[0042] 引物 1(F) :5' -GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG-3,
[0043] 引物 2 (R) : 5 ' -TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA-3 '
[0044] 反應(yīng)條件為：94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸90s，30 個循環(huán)后，72°C保溫lOmin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所 示，XynQl基因?yàn)榇笮?167bp的片段。
[0045] 實(shí)施例2重組表達(dá)木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建
[0046] 2. 1、表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047] 將克隆得到的木聚糖酶基因 XynQl片段，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行 雙酶切，1〇〇μ 1酶切體系如下：木聚糖酶基因 XynQIPCR產(chǎn)物40μ 1、10XH bufferlOy 1、 10XBSA10yl、EcoR I5yl、Not Ι5μ1、(ΜΗ2030 μ1。37°C酶切 4h 后，瓊脂糖凝膠電泳回 收。
[0048] 將表達(dá)載體pPIC9K先用限制性內(nèi)切酶EcoR I進(jìn)行單酶切，100 μ 1酶切體系如下： 表達(dá)載體pPIC9K20y 1、10XH bufferlOy l、EcoR Ι5μ 1、(ΜΗ2065 μ 1。371：酶切4h后，瓊脂 糖凝膠電泳回收。將回收片段再用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn)行單酶切，100 μ 1酶切體系如下： PPIC9K回收片段20μ 1、10XH bufferlOy l、10XBSA10y l、10XTritonl0y l、Not Ι5μ 1、 ddH2045 μ 1。37 °C酶切4h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。
[0049] 將經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的XynQl片段與表達(dá)載體pPIC9K相連接，構(gòu)建表達(dá) 載體？？扣91(17成1，如圖2所示。連接體系如下：表達(dá)載體？？扣91(5以137成1片段3 4 1、 10XT4ligase bufferly 1、T4ligasely 1。22°C 連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5a，挑取轉(zhuǎn) 化子測序驗(yàn)證。測序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒，即 為重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-XynQl。
[0050] 2. 2、轉(zhuǎn)化與篩選
[0051] 將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-XynQl用Sal I進(jìn)行線性化，線性化片段用柱純化 試劑盒純化后，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,涂布MD平板。在MD平板上生長出的菌 落即為畢赤酵母工程菌株，然后涂布含不同濃度遺傳霉素的YH)平板上篩選多拷貝的轉(zhuǎn)化 子。
[0052] 2. 3、發(fā)酵驗(yàn)證
[0053] 挑取單個陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)Id后，再轉(zhuǎn)入 BMM培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)，每天添加0. 5%的甲醇。誘導(dǎo)表達(dá)4d后，離心去除 菌體，將上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測（圖3)。如圖3所示，箭頭所指處即為本發(fā)明的重 組表達(dá)木聚糖酶XYNQ1，分子量為40kDa左右。上清液中木聚糖酶活力測定結(jié)果顯示，搖瓶 水平下木聚糖酶XYNQ1的表達(dá)量達(dá)到160U/ml。將上述陽性轉(zhuǎn)化子命名為巴斯德畢赤酵母 XYN-Q1 (Pichia pastoris XYN-Ql)〇
[0054] 木聚糖酶酶活力檢測方法如下：
[0055] 取2ml濃度為1%的木聚糖底物（pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制)，加入到比色管 中，37°C平衡lOmin，再加入2ml經(jīng)pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋并經(jīng)37°C平衡好的 酸性木聚糖酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入5ml DNS試劑，混勻 以終止反應(yīng)。然后沸水浴煮沸5min，用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻后， 以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光值A(chǔ)E。
[0056] 酶活單位定義：在37°C、pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖 溶液中釋放1 μ mol還原糖所需要的酶量即為一個酶活力單位U。
[0057] 酶活計(jì)算公式：
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種木聚糖酶，其具有： 1. SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；或者 2) 在SEQ ID NO: 1中取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸得到的具有斜臥青霉的木聚 糖酶活性的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1所述的木聚糖酶，其編碼基因?yàn)?1) 核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的DNA分子；或者 2) 在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:2所示核苷酸序列雜交且編碼具有木聚糖酶活性的蛋白 質(zhì)的DNA分子。
3. -種木聚糖酶，其在pH4. 0-7. 0的范圍內(nèi)能保持80%以上的活性，在溫度40-70°C的 范圍內(nèi)，能保持50%以上的活性，最適pH值為5. 0,最適反應(yīng)溫度為60°C。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的木聚糖酶在生產(chǎn)低聚木糖中的用途。
5. -種重組畢赤酵母工程菌，其攜帶有含權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述木聚糖酶的編 碼基因的表達(dá)載體。
6. 權(quán)利要求5所述的重組畢赤酵母工程菌，其中所述的表達(dá)載體為pPIC9K。
7. 權(quán)利要求5或6所述的重組畢赤酵母工程菌，其中所述的畢赤酵母工程菌為畢赤酵 母菌株GS115。
8. 權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的重組畢赤酵母工程菌在在生產(chǎn)低聚木糖中的用途。
9. 一種生產(chǎn)低聚木糖的方法，該方法包括： (1) 發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的重組畢赤酵母工程菌，獲得木聚糖酶； (2) 用獲得的木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖產(chǎn)物。
10. 權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)低聚木糖的方法，其中所述的低聚木糖產(chǎn)物中低聚木二 糖?低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖?低聚木四糖含量高于50%，單糖含量低于 30%。
【文檔編號】C12N1/19GK104099311SQ201310129942
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月15日
【發(fā)明者】肖志壯, 徐曉東, 付娟, 王霽昀, 劉安邦, 王海, 劉魯民, 劉國棟, 陳梅, 曲音波 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司