專利名稱：乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。特別是一種乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
氮的利用在農(nóng)作物生產(chǎn)中占非常重要的地位，植物氮代謝及其調(diào)控一直備受全世界關(guān)注，氮肥利用率低及過量施用氮肥造成水環(huán)境污染的問題也是世界性難題。隨著對(duì)植物氮同化過程中關(guān)鍵酶生理功能的研究日益深入，通過基因工程的方法來提高植物氮素利用率將成為必然的趨勢(shì)，這對(duì)挖掘作物自身潛力以及高效利用土壤氮素養(yǎng)分資源，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中，無機(jī)氮必須同化為谷氨酰胺形式的有機(jī)氮才能被生物體所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是生物體內(nèi)氮同化路徑上的關(guān)鍵酶，它和谷氨酸合成酶聯(lián)合作用，催化NH4+同化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，將其酰胺轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸上，從而生成兩分子的谷氨酸。谷氨酰胺合成酶在生物體氮同化過程中起到了十分重要的作用。構(gòu)建基因工程氮高效利用植物，優(yōu)良的備選基因是關(guān)鍵的材料儲(chǔ)備之一。細(xì)菌的谷氨酰胺合成酶涵蓋了目前所發(fā)現(xiàn)的三大類谷氨酰胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有種類多和容易克隆的優(yōu)越性。乳球菌(L3Ci0C0CCMsp.)是一種常見的革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能分析對(duì)新氮高效基因的鑒定并應(yīng)用于改善逆境下農(nóng)作物的生理性狀有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供了一種谷氨酰胺合成酶基因。本發(fā)明的目的之二在于提供了該基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之三在于提供該基因的克隆方法。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明通過下述方案實(shí)現(xiàn):
一種乳球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的堿基序列?！N根據(jù)上述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ ID N0.2所不的氨基酸序列。一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述的重組載體。

一種克隆上述的乳球菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的乳球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了兼并引物，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增得到不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物為:LactocF: 5，-ATGACAATCACAGCAGCAGA-3，和 LactocR:5’ -TTARTAAAGTTCTAARTART-3’。上述的PCR擴(kuò)增的條件為:94°C 5分鐘；94°C 50秒，45°C 50秒，72°C I分30秒，25個(gè)循環(huán)；72°C 8分鐘。本發(fā)明的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了谷氨酰胺合成酶基因L3CiW所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，能恢復(fù)大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時(shí)也預(yù)示了它在其他生物氮高效利用方面的應(yīng)用價(jià)值。


圖1和2為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)圖，表明該編碼蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性很大；
圖3為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白的進(jìn)化分析圖，表明該編碼蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族；
圖4為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補(bǔ)分析圖。培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入的菌株均可以正常生長(zhǎng)；
圖5為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補(bǔ)分析圖。培養(yǎng)基中未添加谷氨酰胺，只有轉(zhuǎn)入的菌株可以正常生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述`本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一 -.Lactol基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的克隆與分析:
通過參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的乳球菌屬(ZaciococcM spp.)細(xì)菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了兼并引物，該引物為:LactocF: 5’ -ATGACAATCACAGCAGCAGA-3’ 和 LactocR:5’ -TTARTAAAGTTCTAARTART-3’，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增出了一個(gè)谷氨酰胺合成酶基因，命名為L(zhǎng)ac tol。將該基因插入克隆載體pMD 18-T，挑選相應(yīng)的陽(yáng)性克隆，對(duì)該基因進(jìn)行了全長(zhǎng)DNA測(cè)序，獲得了含有該基因完整ORF的DNA序列。測(cè)序結(jié)果表明'Lactol的ORF全長(zhǎng)1341bp。DNAstar軟件的分析結(jié)果顯示:該基因編碼一個(gè)含446個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小約為50kDa，等電點(diǎn)為4.96。利用Cell-PLoc網(wǎng)站的Gpos-PLoc 2.0以及Softberry網(wǎng)站的ProtComp Version 9.0軟件對(duì)基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)顯示該蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性很大，參見圖1和2，這與其它物種中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。進(jìn)化分析表明，L3CiW基因編碼的蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族，參見圖3。實(shí)施例二 -.Lactol在大腸桿菌突變體中的功能分析通過DNA測(cè)序分析，挑選Zac ο7基因ORF轉(zhuǎn)錄方向與載體pMD 18-Τ上乳糖啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄方向一致的克隆,抽提該克隆的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169,flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL150 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。請(qǐng)參見文獻(xiàn):Merida, A., Flores E.,Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetaseactivity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing theAnabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriolj 1992，174(2):650-654.。該突變體由于缺失編碼谷氨酰胺合成酶的基因，所以在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中無法正常生長(zhǎng)。該菌株購(gòu)買于E.coli Genetic Stock Center, Yale University。由圖4和圖5說明Lactol能夠互補(bǔ)大腸桿菌突變體ET6017的谷氨酰胺合成酶缺失表型。Lactol的表達(dá)，使得大腸桿菌突變體ET6017在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。該互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中驗(yàn)證了基因L3CiW所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復(fù)大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時(shí)也預(yù)示了它在其他生物氮高效利用方面的應(yīng)用價(jià)值。

盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種乳球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的堿基序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
3.—種重組表達(dá)載體，該重組載體含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因。
4.一種宿主細(xì)胞,該宿主細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.一種克隆根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳球菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的乳球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了兼并引物，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增得到不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物為=LactocF: 5，-ATGACAATCACAGCAGCAGA-3，和 LactocR:5’ -TTARTAAAGTTCTAARTART-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的條件為:94°C5分鐘；94°C 50 秒，45°C 50 秒，72 °C I 分 30 秒，25 個(gè)循環(huán)；72°C 8 分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。本發(fā)明的基因來源于乳球菌屬細(xì)菌，為SEQIDNO1所示的堿基序列。該基因編碼谷氨酰胺合成酶，能夠顯著提高模式生物大腸桿菌合成谷氨酰胺的能力。這預(yù)示了所公開的全長(zhǎng)基因及氨基酸序列，在提高生物體的氮利用效率和增加生物體氮元素含量的基因工程方面具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103205441SQ20131013049
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者朱晨光, 沈春磊, 王偉, 邢瑩瑩, 徐騰蛟, 唐遠(yuǎn)平, 梅冰, 宋任濤 申請(qǐng)人:上海大學(xué)