乙型肝炎病毒p區(qū)變異及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒P區(qū)變異及其用途。本發(fā)明首次揭示了乙型肝炎病毒P區(qū)多個(gè)位點(diǎn)上的堿基突變與肝癌的發(fā)生密切相關(guān),可將這些位點(diǎn)的變異作為肝癌易感性標(biāo)志。本發(fā)明還提供了可特異性檢測(cè)所述突變位點(diǎn)的試劑或試劑盒。
【專利說(shuō)明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】;具體地說(shuō),本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒P區(qū)變異;基于這 些變異情況,本發(fā)明提供了可用于肝癌預(yù)測(cè)以及早期(輔助性)診斷的檢測(cè)試劑或試劑盒。 乙型肝炎病毒P區(qū)變異及其用途 【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一,已占居民腫瘤死亡的第二位。乙型 肝炎病毒(HBV)慢性感染是導(dǎo)致我國(guó)肝癌發(fā)生的首要原因。我國(guó)約有HBV表面抗原(HBsAg) 攜帶者1. 2億,他們中相當(dāng)部分的慢性肝炎患者,經(jīng)10?20年的發(fā)展會(huì)進(jìn)入肝硬化狀態(tài), 而肝硬化患者中每十年即有30?50%的人將演變成肝癌。近年來(lái),隨著乙肝疫苗的普遍應(yīng) 用,我國(guó)兒童中肝炎的發(fā)病得到了很好的控制。但在那些已經(jīng)感染了乙肝病毒的人群中,肝 癌的發(fā)病率和死亡率卻仍然呈上升趨勢(shì)。
[0003] 乙型肝炎病毒屬于嗜肝性DNA病毒科,其基因組為部分環(huán)狀雙鏈DNA,約3200bp, 由正鏈和負(fù)鏈構(gòu)成(圖1)。負(fù)鏈含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框(Open Reading Frame, 0RF):前S/ S區(qū)、X區(qū)、P區(qū)(聚合酶)以及P區(qū)(precore/core,pre-C/C);除此之外還有多個(gè)基因表 達(dá)調(diào)控序列,包括2個(gè)直接重復(fù)序列(DRI、DRII)、2個(gè)增強(qiáng)子(ENI、ENII)和4個(gè)啟動(dòng)子 (SP1、SP2、XP和CP)。HBV前S/S區(qū)包括前S1基因、前S2基因和S基因,分別編碼病毒包 膜大蛋白(400aa)、中蛋白(271aa)和小蛋白(226aa) ;X區(qū)編碼HBV X蛋白;HBV的前C基 因及C基因則共享另一個(gè)開(kāi)放讀碼框P區(qū),根據(jù)不同的起始密碼子,分別編碼病毒核心抗原 (Hepatitis B Core Antigen,HBcAg)和 e 抗原(Hepatitis B e Antigen,HBeAg), P 區(qū)編 碼DNA聚合酶。
[0004] P基因是最長(zhǎng)的開(kāi)放讀框,與C、S與X基因重疊,具體的堿基相對(duì)位置見(jiàn)圖2。P基 因主要編碼HBV聚合酶。HBV聚合酶是乙肝病毒復(fù)制的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)功能的不同,HBV聚 合酶從氨基端開(kāi)始分為四個(gè)區(qū),分別為末端蛋白區(qū)(TP)、間隔區(qū)(SD)、逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT)和 RNase Η區(qū)。其中逆轉(zhuǎn)錄酶RT區(qū)是HBVDNA聚合酶的主要功能區(qū),同時(shí)具有反轉(zhuǎn)錄酶及DNA 聚合酶活性,作用是將前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈HBV DNA,并以此負(fù)鏈DNA為模板合成正 鏈DNA。HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)可進(jìn)一步分為五個(gè)主要的功能域,Α區(qū)(421?436氨基酸)、Β區(qū) (506?528氨基酸)、C區(qū)(546?550氨基酸)、D區(qū)(576?589氨基酸)及Ε區(qū)(592? 600氨基酸)。這五個(gè)區(qū)域的氨基酸高度保守,為維持反轉(zhuǎn)錄酶活性所必須,其中A、C、D區(qū) 為聚合酶與三磷酸核苷結(jié)合的結(jié)合域,B、E區(qū)為RNA模板和引物定位域。目前臨床應(yīng)用的 擬核苷類藥物主要的靶位點(diǎn)位于逆轉(zhuǎn)錄酶RT區(qū)的B及C區(qū),HBV多聚酶的催化域即位于C 區(qū)的YMDD基序。也是拉米夫定等抗病毒藥物治療時(shí)HBV最常出現(xiàn)變異的區(qū)域。P基因變 異主要見(jiàn)于P0L/RT基因片段(349?692aa,即rtl?rt344)。在拉米夫定的抗病毒治療 中,最常見(jiàn)的是酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)變異,即由YMDD變異為 YIDD (rtM204I)或YVDD (rtM204V),并常伴有rtL180M變異,且受藥物選擇而逐漸成為對(duì)拉 米夫定耐藥的優(yōu)勢(shì)株。較早的研究報(bào)道,多為P基因與拉米夫定等核苷酸耐藥有關(guān)系,P基 因與肝癌的發(fā)生關(guān)系至今仍很少報(bào)道。
[0005] 目前常用的基因突變檢測(cè)方法包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP),單鏈構(gòu)象多態(tài) 性(PCR-SSCP),基因芯片及DNA序列測(cè)定技術(shù)。PCR-SSCP用于檢測(cè)基因突變操作繁瑣、檢 測(cè)通量低,而且不能判斷特異性位點(diǎn)的突變形式。而RFLP是使用核酸內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增后的靶 序列特異性位點(diǎn)的切割,然后通過(guò)電泳檢測(cè)判斷不同的基因型,但是由于HBV基因組分子 進(jìn)化速度較快、變異頻繁,因此結(jié)果分析準(zhǔn)確率較低。近年來(lái),基因芯片技術(shù)已成功應(yīng)用于 核酸分析,對(duì)檢測(cè)HBV基因組多態(tài)性具有很大的優(yōu)勢(shì),但因其檢測(cè)費(fèi)用昂貴而限制了該技 術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室的推廣和應(yīng)用。因此,本領(lǐng)域有必要開(kāi)發(fā)優(yōu)化的且切實(shí)可推廣應(yīng)用的臨床 檢測(cè)技術(shù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供乙型肝炎病毒P區(qū)變異及其用途。
[0007] 本發(fā)明的目的還在于提供用于肝癌預(yù)測(cè)以及早期(輔助性)診斷的檢測(cè)試劑或試 劑盒。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面,提供一種檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒P區(qū)變異 的試劑盒,它包括:
[0009] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位堿基序列的引物;和/或
[0010] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
[0011] 在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0012] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第987位堿基序列的引物;和/或
[0013] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第987位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針。
[0014] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0015] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第799位堿基序列的引物;和/或
[0016] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第799位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針。
[0017] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0018] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第904位堿基序列的引物;和/或
[〇〇19] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第904位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針。
[0020] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0021] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第955位堿基序列的引物;和/或
[0022] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第955位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針。
[0023] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0024] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第1229位堿基序列的引物;和/或
[0025] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第1229位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
[0026] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0027] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第1230位堿基序列的引物;和/或
[0028] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第1230位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針。
[0029] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0030] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位堿基序列的引物;和/或
[0031] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
[0032] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0033] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第294位堿基序列的引物;和/或
[〇〇34] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第294位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
[0035] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還包括:
[0036] 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第895位堿基序列的引物;和/或
[0037] 與乙型肝炎病毒P區(qū)第895位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
[0038] 在另一優(yōu)選例中,所述的引物包括:
[0039] SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:25所示序列的引物對(duì),用于擴(kuò)增含有 乙型肝炎病毒P區(qū)第799、895、904、955、987、1055、1229或1230位堿基的序列;和/或
[0040] SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28所示序列的引物對(duì),用于擴(kuò)增含有 乙型肝炎病毒P區(qū)第294位堿基的序列;和/或
[0041] SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:31所示序列的引物對(duì),用于擴(kuò)增含有 乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位堿基的序列。
[0042] 在另一優(yōu)選例中,所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位為堿基"A"的序列結(jié)合的 探針的序列如SEQ ID N0:12 ;
[0043] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第987位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:10 ;
[0044] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第799位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:2 ;
[0045] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第904位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:6 ;
[0046] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第955位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:8 ;
[0047] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第1229位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 ;
[0048] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第1230位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16 ;
[0049] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:20 ;
[0050] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第294位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO: 18 ;或
[0051] 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第895位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID N0:4。
[0052] 在另一優(yōu)選例中,所述的探針連接有可檢測(cè)信號(hào);或所述的試劑盒中還包括陽(yáng)性 控制探針;所述的陽(yáng)性控制探針是與乙型肝炎病毒P區(qū)保守性序列結(jié)合的探針,待測(cè)樣品 中有乙型肝炎病毒的DNA存在時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性。
[0053] 在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒中還包括可檢測(cè)信號(hào)控制探針。
[0054] 在本發(fā)明的另一方面,提供一種體外檢測(cè)(優(yōu)選非診斷性地)乙型肝炎病毒P區(qū) 變異的方法,所述的方法包括以下步驟:
[0055] 檢測(cè)該核酸樣品的乙型肝炎病毒P區(qū),并與野生型的乙型肝炎病毒P區(qū)比較,存在 選自以下變異形式就表明該個(gè)體乙型肝炎病毒P區(qū)存在核苷酸變異:
[0056] 乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位,T -A ;和/或
[0057] 乙型肝炎病毒P區(qū)第987位,A - G;和/或
[0058] 乙型肝炎病毒P區(qū)第799位,A - G;和/或
[0059] 乙型肝炎病毒P區(qū)第904位,A - T;和/或
[0060] 乙型肝炎病毒P區(qū)第955位,C - T ;和/或
[0061] 乙型肝炎病毒P區(qū)第1229位,G -A ;和/或
[0062] 乙型肝炎病毒P區(qū)第1230位,C - G ;和/或
[0063] 乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位,G -A ;和/或
[0064] 乙型肝炎病毒P區(qū)第294位,C -A ;和/或
[0065] 乙型肝炎病毒P區(qū)第895位,T - A。
[〇〇66] 在本發(fā)明的另一方面,提供了一種乙型肝炎病毒P區(qū)核苷酸序列的用途,用于制 備肝癌預(yù)測(cè)或肝癌早期輔助診斷的試劑或試劑盒。
[〇〇67] 在本發(fā)明的另一方面,提供了一種SEQ ID N0:1-31所述的引物和/或探針或其組 合的用途,它(或它們)被用作肝癌預(yù)測(cè)或肝癌早期輔助診斷的試劑;或者用于制備肝癌預(yù) 測(cè)或肝癌早期輔助診斷的試劑盒。
[〇〇68] 在另一優(yōu)選例中,上述任一試劑盒中,包括了①容器,以及裝于所述容器的特異性 擴(kuò)增的引物;和②容器,以及裝于所述容器的與含突變位點(diǎn)的序列結(jié)合的探針。
[0069] 在另一優(yōu)選例中,所述的乙型肝炎病毒P區(qū)核苷酸位置編號(hào)基于GenBank登錄號(hào) ⑶434374乙型肝炎病毒基因序列。
[0070] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容,對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描 述的各技術(shù)特征可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在此不再一一 累述。 【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0071] 圖1、乙肝病毒分子結(jié)構(gòu)模式圖。
[0072] 圖2、P基因區(qū)與其他開(kāi)放讀碼框的相對(duì)堿基位置。
[0073] 圖 3A、nt. 799,nt. 895,nt. 904,nt. 955,nt. 987,nt. 1055,nt. 1229,nt. 1230, nt. 294, nt. 2489 全野生型。
[0074] 圖3B、799位點(diǎn)突變(A - G),其余位點(diǎn)野生。
[0075] 圖3C、895位點(diǎn)突變(T - A),其余位點(diǎn)野生。
[0076] 圖3D、904位點(diǎn)突變(A - T),其余位點(diǎn)野生。
[0077] 圖3E、955位點(diǎn)突變(C - T),其余位點(diǎn)野生。
[0078] 圖3F、987位點(diǎn)突變(A - G),其余位點(diǎn)野生。
[0079] 圖3G、1055位點(diǎn)突變(T - A),其余位點(diǎn)野生。
[0080] 圖3H、1229位點(diǎn)突變(G - A),其余位點(diǎn)野生。
[0081] 圖31、1230位點(diǎn)突變(C - G),其余位點(diǎn)野生。
[0082] 圖3J、1229和1230位點(diǎn)同時(shí)突變,其余位點(diǎn)野生。
[0083] 圖3K、294位點(diǎn)突變(C - A),其余位點(diǎn)野生。
[0084] 圖3L、2489位點(diǎn)突變(G - A),其余位點(diǎn)野生(因2489位點(diǎn)的序列是用反向引物 測(cè)得的,所以看到的序列圖為C - T)。 【具體實(shí)施方式】
[0085] 為探索肝癌高發(fā)地區(qū)HBV變異位點(diǎn)與肝癌發(fā)生關(guān)系,本發(fā)明人通過(guò)對(duì)肝癌患者血 清HBV P基因的測(cè)序分析,篩選出了新的與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的突變位點(diǎn),為肝癌的高危 篩選、預(yù)防和干預(yù)提供新的分子標(biāo)志物。因此,在本發(fā)明中首次揭示了乙型肝炎病毒(HBV) P 區(qū)第 1055、987、799、904、955、1229、1230、2489、294 和 / 或 895 位堿基的突變(HBV P 區(qū) 1055位T - A突變、987位A - G突變、799位A - G突變、904位A - T突變、955位C - T 突變、1229位G - A突變、1230位C - G突變、2489位G - A突變、294位C - A突變、895 位T -A突變)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)??蓪⒃撨@些位點(diǎn)的變異作為肝癌易感性標(biāo)志,從 而設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)所述突變位點(diǎn)的試劑或試劑盒。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0086] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"乙型肝炎病毒P區(qū)"指乙型肝炎病毒P區(qū),野生型核苷酸序列 為 GenBank 登錄號(hào)⑶434374(SEQ ID N0:32)所示。
[0087] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"肝癌相關(guān)的乙型肝炎病毒P區(qū)變異"指乙型肝炎病毒P區(qū)第 1055、987、799、904、955、1229、1230、2489、294 和 / 或 895 位堿基突變,尤其是第 1055 位 T -A(簡(jiǎn)寫為 T1055A)、987 位 A -G 突變(簡(jiǎn)寫為 A987G)、799 位 A -G(簡(jiǎn)寫為 A799G)、 904位A - T突變(簡(jiǎn)寫為A904T)、955位C - T突變(簡(jiǎn)寫為C955T)、1229位G -A突 變(簡(jiǎn)寫為G1229A)、1230位C -G突變(簡(jiǎn)寫為C1230G)、2489位G -A突變(簡(jiǎn)寫為 G2489A)、294位C - A突變(簡(jiǎn)寫為C294A)、895位T - A突變(簡(jiǎn)寫為T895A)。應(yīng)理解, 所述的變異可以是一個(gè)位點(diǎn)的突變,也可以是2、3或4個(gè)位點(diǎn)的突變的組合。
[0088] 基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn),可以將乙型肝炎病毒P區(qū)第1055、987、799、904、955、 1229、1230、2489、294和/或895位堿基的相關(guān)突變作為標(biāo)志,從而:從乙型肝炎病毒陽(yáng)性 的人群中分離出對(duì)于肝癌易感性的人群,或作為肝癌疾病的鑒別診斷、和/或易感性分析 的輔助性工具;早期評(píng)估相關(guān)人群肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)。
[0089] 例如,可從乙型肝炎病毒陽(yáng)性患者人群中分離出乙型肝炎病毒P區(qū)第1055、987、 799、904、955、1229、1230、2489、294和/或895位堿基發(fā)生突變的人群,作為肝癌的高發(fā)人 群,從而達(dá)到早期監(jiān)測(cè)早期預(yù)防的目的。
[0090] 此外,還可通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)乙型肝炎病毒P區(qū)其它位點(diǎn)的突變情況來(lái)評(píng)估肝癌 易感性。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn),乙型肝炎病毒P區(qū)第1055、987、799、904、955、1229、1230、 2489、294和/或895位堿基的突變結(jié)合可提高肝癌發(fā)生的可能性。所述突變?cè)诟伟┗颊咧?的發(fā)生比例顯著高于慢性肝炎患者中的比例。
[0091] 基于本發(fā)明人的上述發(fā)現(xiàn),可采用各種技術(shù)來(lái)檢測(cè)乙型肝炎病毒P區(qū)第1055、 987、799、904、955、1229、1230、2489、294和/或895位堿基的突變情況,這些技術(shù)均包含在 本發(fā)明中。例如,對(duì)相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行序列測(cè)定,從而判斷是否發(fā)生變異。
[0092] 在檢測(cè)相關(guān)位點(diǎn)的變異時(shí),檢測(cè)可以針對(duì)cDNA,也可針對(duì)基因組DNA??捎靡延械?技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外,突變有可能影響 蛋白的表達(dá),因此可用例如Western印跡法間接判斷基因有無(wú)突變。
[0093] 此外,可用相關(guān)位點(diǎn)特異的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)進(jìn)行體外鑒定;或者 可根據(jù)相關(guān)位點(diǎn)設(shè)計(jì)可特異性結(jié)合的探針來(lái)進(jìn)行體外鑒定;或者可利用特異性的限制性內(nèi) 切酶來(lái)進(jìn)行體外鑒定。
[0094] 作為一種可選的方式,還可采用基于PCR技術(shù)的單堿基延伸技術(shù)來(lái)檢測(cè)變異位 點(diǎn),其原理是設(shè)計(jì)一條引物,位于待測(cè)變異位點(diǎn)的上游,并且該引物的3'端距離變異位點(diǎn) 一個(gè)堿基。加入不同熒光標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行反應(yīng),只有當(dāng)加入的ddNTP與變異位點(diǎn)堿基互 補(bǔ)時(shí),引物才得以延伸。可通過(guò)檢測(cè)延伸堿基所發(fā)出的熒光來(lái)判斷變異的類型。
[0095] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,可結(jié)合已知的PCR-斑點(diǎn)印跡雜交技術(shù),建立一種能在較 短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)和分析HBV基因組P區(qū)基因突變的方法。
[〇〇96] 本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)是否含有所述變異位點(diǎn)的試劑。所述的試劑 例如是:對(duì)相關(guān)突變位點(diǎn)特異的引物;對(duì)相關(guān)突變位點(diǎn)特異的探針;或?qū)ο嚓P(guān)突變位點(diǎn)特 異的限制性內(nèi)切酶。
[0097] 本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)是否含有所述變異位點(diǎn)的試劑盒,該試劑盒 包括:
[0098] 裝在適當(dāng)容器中的、用于擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第799、895、904、955、987、 1055、1229、1230位、294位、2489位堿基序列的引物。
[〇〇99] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,當(dāng)應(yīng)用探針進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可以在探針上設(shè)置可檢測(cè)信號(hào), 從而便于進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的識(shí)別,所述的可檢測(cè)信號(hào)例如是熒光信號(hào)、染料信號(hào)、顯色劑信 號(hào)。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式,所述的可檢測(cè)信號(hào)是生物素,基于生物素作為顯色標(biāo)記的 原位雜交技術(shù)已經(jīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。
[〇1〇〇] 當(dāng)所述試劑盒中含有針對(duì)多于一個(gè)位點(diǎn)變異情況的檢測(cè)試劑時(shí),檢測(cè)或評(píng)估的準(zhǔn) 確性可能提1?。
[〇1〇1] 作為本發(fā)明的可選擇的方式,所述的試劑盒中可包括:特異性與乙型肝炎病毒P 區(qū)發(fā)生 T1055A、A987G、A799G、A904T、C955T、G1229A、C1230G、G2489A、C294A、T895A 的基因 產(chǎn)物結(jié)合且不結(jié)合于相關(guān)位點(diǎn)未突變的基因產(chǎn)物的抗體。更優(yōu)選的,所述試劑盒中還包括 常規(guī)的可用于檢測(cè)抗原抗體結(jié)合狀況的試劑。
[0102] 此外,所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑, 包括但不限于:抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液、抗體等。
[0103] 此外,所述的試劑盒中還可包括使用說(shuō)明書和/或芯片圖像分析軟件等。
[0104] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0105] (1)通過(guò)大規(guī)模地對(duì)乙型肝炎或肝癌發(fā)病人群進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)并證實(shí)肝癌發(fā)生相 關(guān)的新的變異位點(diǎn),研究病例多,準(zhǔn)確性高。
[0106] (2)首次針對(duì)新的變異位點(diǎn),設(shè)計(jì)出特異性的檢測(cè)試劑和試劑盒,為早期評(píng)估相關(guān) 人群肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)提供了新的途徑。
[0107] (3)基于早期檢測(cè)結(jié)果,對(duì)于攜帶新的變異位點(diǎn)的乙型肝炎病毒攜帶者個(gè)體,可采 取加強(qiáng)隨訪和復(fù)查等手段,以便能夠盡早確診和治療。并開(kāi)發(fā)新的可用于肝癌預(yù)測(cè)以及早 期(輔助性)診斷的檢測(cè)試劑或試劑盒。
[0108] 下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南,第三版,科學(xué)出版社,2002中所述的條件, 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明,否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0109] 實(shí)施例1、HBV P基因突變與肝癌相關(guān)性分析
[0110] 1、研究對(duì)象
[0111] 研究對(duì)象來(lái)自江蘇啟東腫瘤醫(yī)院和啟東市人民醫(yī)院收治的病人,其中肝癌202 例,肝炎202例,肝癌患者平均年齡為51. 1±9. 2歲,男女性別比165:37 ;肝炎患者平均年 齡為50. 7±9. 5歲,男女性別比165:37。所有病例HBsAg及HBVDNA均為陽(yáng)性。肝炎的診 斷符合2000年全國(guó)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)。 肝癌的診斷符合2001中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)修訂的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分 期標(biāo)準(zhǔn)》,其中含病理診斷242例,臨床診斷162例。所有病例均已排除肝硬化患者且無(wú)合 并丙型肝炎病毒(hepatitis C viruS,HCV)感染。所有肝炎患者并沒(méi)有接受抗病毒藥物治 療,血清分離后于-70°C冰箱凍存至檢測(cè)。
[0112] 2、血清DNA抽提
[0113] 取 50ul 的血清,加 10ul 的裂解液(1 Ommol /1 的 Tis-HCl,lmmol/1 的EDTA,15mmol/ 1 的 NaCl,0. 5%SDS,PH8. 0),混勻,煮沸 lOmin,5000xg 離心 5min,取上清液備用。
[0114] 3、HBV DNA P 基因擴(kuò)增
[0115] (1)引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增
[0116] 根據(jù)HBV DNA的結(jié)構(gòu)和HBV P基因序列多重比較結(jié)果,設(shè)計(jì)巢式PCR引物。引物 由上海Invitrogen公司合成,見(jiàn)表1。
[0117] 通過(guò)兩輪巢式PCR進(jìn)行HBV P基因擴(kuò)增,擴(kuò)增所用引物見(jiàn)表1。
[0118] 表1、HBV P區(qū)PCR擴(kuò)增引物核苷酸序列及位置
[0119]
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒P區(qū)變異的試劑盒,其特征在于,它包 括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 1055位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第987位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 987位為喊基"G"的序列結(jié)合的探針。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第799位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 799位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第904位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 904位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第955位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 955位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針。
6. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第1229位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 1229位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
7. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第1230位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 1230位為喊基"G"的序列結(jié)合的探針。
8. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 2489位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
9. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第294位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 294位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
10. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,還包括: 擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第895位堿基序列的引物;和/或與乙型肝炎病毒P區(qū)第 895位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針。
11. 如權(quán)利要求1-10任一所述的試劑盒,其特征在于,所述的引物包括: SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示序列的引物對(duì),用于擴(kuò)增含有乙型 肝炎病毒P區(qū)第799、895、904、955、987、1055、1229或1230位堿基的序列;和/或 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示序列的引物對(duì),用于擴(kuò)增含有乙型 肝炎病毒P區(qū)第294位堿基的序列;和/或 SEQ ID NO:29、SEQ ID N0:30和SEQ ID NO:31所示序列的引物對(duì),用于擴(kuò)增含有乙型 肝炎病毒P區(qū)第2489位堿基的序列。
12. 如權(quán)利要求1-10任一所述的試劑盒,其特征在于, 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:12 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第987位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:10 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第799位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:2 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第904位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:6 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第955位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:8 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第1229位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第1230位為堿基"G"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:20 ; 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第294位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO:18 ;或 所述的與乙型肝炎病毒P區(qū)第895位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針的序列如SEQ ID N0:4。
13. 如權(quán)利要求1-10任一所述的試劑盒,其特征在于,所述的探針連接有可檢測(cè)信號(hào); 或 所述的試劑盒中還包括陽(yáng)性控制探針;所述的陽(yáng)性控制探針是與乙型肝炎病毒P區(qū)保 守性序列結(jié)合的探針,待測(cè)樣品中有乙型肝炎病毒的DNA存在時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性。
14. 一種體外檢測(cè)乙型肝炎病毒P區(qū)變異的方法,其特征在于,所述的方法包括以下步 驟: 檢測(cè)該核酸樣品的乙型肝炎病毒P區(qū),并與野生型的乙型肝炎病毒P區(qū)比較,存在選自 以下變異形式就表明該個(gè)體乙型肝炎病毒P區(qū)存在核苷酸變異: 乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位,T - A ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第987位,A - G ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第799位,A - G ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第904位,A - T ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第955位,C - T ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第1229位,G - A ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第1230位,C - G ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第2489位,G - A ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第294位,C - A ;和/或 乙型肝炎病毒P區(qū)第895位,T - A。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104109720SQ201310139142
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月19日
【發(fā)明者】屠紅, 趙芝梅, 金晏, 高付敏, 陳陶陽(yáng), 吳燕, 甘愉 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所