專(zhuān)利名稱(chēng)：一種地衣芽孢桿菌7172及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地衣芽孢桿菌7172及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蘭素(vanillin)，學(xué)名4_羥基_3_甲氧基苯甲醛，分子式C8H8O3，相對(duì)分子量152.15。香蘭素的純品通常為白色或微黃色針狀結(jié)晶，具有香莢蘭豆特有的芳香味。微溶于水，易溶于乙醇、氯仿、乙醚、冰醋酸、吡啶等有機(jī)溶劑和強(qiáng)堿溶液中。香蘭素的化學(xué)性質(zhì)不太穩(wěn)定，易受光的影響，在空氣中逐漸氧化為香草酸，在堿性溶液中易變色。無(wú)毒，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害，對(duì)皮膚和粘膜有局部的刺激。香蘭素是一種世界上產(chǎn)量最大、用途最多的廣譜型高檔香料，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個(gè)行業(yè)中。在食品方面，因其具有特殊的香型，被譽(yù)為“食品香料之王”，廣泛用作咖啡、名酒等高檔食品的調(diào)香原料。在醫(yī)藥方面，香蘭素是合成許多藥物及其藥物中間體的重要原料。在工業(yè)方面，香蘭素被廣泛的應(yīng)用于牙膏、香水及化妝品的制備中；香蘭素用作電鍍添加劑，可加快電鍍速度，增加鍍件表面的光澤。在農(nóng)業(yè)方面，香蘭素可作為農(nóng)作物的增產(chǎn)劑、催熟劑等。香蘭素目前主要由化學(xué)方法制備，但用化學(xué)合成法制得的香蘭素不是天然香料。天然香蘭素可以從香子蘭的花莢中提取，但這樣得到的香蘭素量少而價(jià)高，不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求，從而促使研究人員去尋找生產(chǎn)天然香蘭素的替代方法。國(guó)外(例如歐洲)的立法機(jī)構(gòu)認(rèn)為采用生物活細(xì)胞或其中的組成部分(例如酶)等生物資源所生產(chǎn)的物質(zhì)均屬于天然產(chǎn)物。因此利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素是很有前途的替代方法之一。目前，利用微生物轉(zhuǎn) 化法生產(chǎn)香蘭素所選用的天然底物主要有阿魏酸、丁香酚、異丁香酚、芳香族氨基酸、香草酸等。阿魏酸因其對(duì)微生物的毒性作用小，并且在自然界廣泛分布，被認(rèn)為是一種較好的底物。迄今為止，以阿魏酸為底物生產(chǎn)香蘭素的微生物種類(lèi)很多，在細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌中都有發(fā)現(xiàn)。但大多數(shù)微生物轉(zhuǎn)化得到的香蘭素的產(chǎn)量很低，或者是香蘭素很快轉(zhuǎn)化成其它的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致香蘭素在培養(yǎng)液中很難積累下來(lái)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種地衣芽孢桿菌7172及其應(yīng)用。技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種地衣芽孢桿菌，分類(lèi)命名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 7172,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7172，保藏日期2013年I月18日，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。地衣芽孢桿菌7172的生理學(xué)特征是:革蘭氏陽(yáng)性，好氧，產(chǎn)芽孢，平坦，不透明，可利用麥芽糖、淀粉、葡萄糖。
取地衣芽抱桿菌7172 的 16S rRNA 序列與 Bacillus licheniformis 的 16S rRNA序列比對(duì)，相似性達(dá)到100%,因此鑒定為地衣芽孢桿菌licheniformis.、
所述的地衣芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟:
(1)斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌7172接種到斜面培養(yǎng)基上，在50°C、pH7條件下，靜置培養(yǎng)24h ；
(2)制備種子培養(yǎng)液:用步驟(I)所得到的斜面培養(yǎng)物，接種到種子液培養(yǎng)基中，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 3次，制得種子培養(yǎng)液；
(3)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)20h ；
(4)菌體的收集:將步驟(3)所得到的發(fā)酵液在6000rpm的條件下離心，棄上清，得到沉淀物，即菌體；
(5)菌體的轉(zhuǎn)化:將步 驟(4)所得的菌體用磷酸鹽緩沖液沖洗三次，再用相同的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，同時(shí)加入8g/L的阿魏酸鈉溶液，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)5d，
獲得天然香蘭素。所述斜面培養(yǎng)基配方為:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化鈉5g/L,瓊脂18g/L。所述種子液培養(yǎng)基配方為:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化鈉5g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化鈉5g/L;pH調(diào)至7。所述磷酸鹽緩沖液的成份為:4.2mM Na2HPO4, 2.2mM KH2PO4,0.9mM NaCl, 1.9mMNH4Cl, pH 為 7。所述的阿魏酸鈉溶液是將阿魏酸溶于磷酸鹽緩沖液中，再用NaOH調(diào)節(jié)pH至7。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的地衣芽孢桿菌7172及其應(yīng)用，使用地衣芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素是在高溫條件下進(jìn)行的，可以有效控制雜菌的生長(zhǎng)，有利于工業(yè)生產(chǎn)。同時(shí)采用該方法環(huán)境污染小，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品環(huán)境友好，安全可靠，克服了長(zhǎng)期以來(lái)采用化學(xué)合成法生產(chǎn)香蘭素的弊端，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1是地衣芽孢桿菌7172在平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng) 圖2是地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化阿魏酸生成的代謝產(chǎn)物的薄層層析圖；圖中，I為阿魏酸標(biāo)樣,2為香蘭素標(biāo)樣，3為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚標(biāo)樣，4為培養(yǎng)IOh的發(fā)酵液，5為培養(yǎng)2d的發(fā)酵液；
圖3是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物結(jié)果 圖4是地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的過(guò)程中阿魏酸和香蘭素的變化曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1取蘑菇種植地中的堆肥樣品，稱(chēng)取6g，剪碎，加入60mL蒸餾水，混勻制成懸濁液，于30°C條件下震蕩培養(yǎng)30min。取上述制得的懸濁液轉(zhuǎn)接到阿魏酸的濃度分別為0.1%，0.2%，
0.3%，0.4%，0.5%的基本培養(yǎng)基中，將三角瓶置于50°C水浴搖床中振蕩培養(yǎng)，并觀察其生長(zhǎng)狀況。將上述初篩的阿魏酸濃度為0.1%-0.5%的培養(yǎng)液各取lmL，轉(zhuǎn)接到新配置的阿魏酸濃度為0.4%，0.5%，0.6%, 0.7%, 0.8%的復(fù)篩培養(yǎng)基中，進(jìn)一步提高阿魏酸的濃度，將三角瓶置于50°C水浴搖床中振蕩培養(yǎng)。從上述阿魏酸濃度為0.1%-0.8%的培養(yǎng)液中各取IOML菌液，并用無(wú)菌蒸餾水適當(dāng)稀釋后涂板，50°C高溫水浴搖床培養(yǎng)l-3d，然后從板上挑取形態(tài)不同的單個(gè)菌落，采用平板劃線(xiàn)法進(jìn)行純化，連續(xù)純化3次，以確保得到單一菌落。將長(zhǎng)出的單菌落分別接種到含5g/L阿魏酸的基本培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，篩選出能夠轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素菌株，最終獲得一株降解能力較好、能大量積累香蘭素的菌株。采用菌落PCR法獲得該菌株的16SrDNA，具體如下:
1)16sRNA擴(kuò)增引物使用細(xì)菌16sRNA通用引物，
正向引物 F27:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物 R1492:5’ -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3
2)PCR體系(25ML):2.5ML IOXbuffer (Mg2+ Free)，2ML dNTP，1.5ML MgCl2，0.3ML 正向引物F27，0.3ML反向引物R1492，5ML模板(單菌落)，0.3ML T aq DNA酶，13.1ML無(wú)菌蒸餾水；
3)反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min;95°C變性30S ;55°C退火Imin ;72°C延伸2min ；30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸IOmin ;4°C保存。將PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，并由南京思普金生物科技公司完成測(cè)序?！だ肂LAST (http://wwwncb1.nlm.nih.gov/blast)將所測(cè)定菌株的 16SrDNA 序列，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16SrDNA/rRNA序列進(jìn)行比較鑒定，最終測(cè)得該菌株與地衣芽孢桿菌的同源性達(dá)到100%。因此命名為地衣芽孢桿菌licheniformis)7172。該菌株于2013年I月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，編號(hào)為 CGMCC N0.7172。如圖1所示，該菌株的菌落平坦，不透明，呈乳白色，好氧，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性，可利用麥芽糖、淀粉，葡萄糖。在上述篩選轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的菌株的方法中，使用的基本培養(yǎng)基配方為:硫酸銨1.3g/L，氯化鐵0.02g/L，硫酸鎂0.125g/L，酵母提取物0.lg/L，磷酸氫二鉀
0.37g/L，氯化鈣0.0525g/L，調(diào)節(jié)pH至7，121°C條件下滅菌20min。在上述篩選轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的菌株的方法中，使用的固體培養(yǎng)基配方為:酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L。121°C條件下滅菌20min。實(shí)施例2
地衣芽孢桿菌菌體在種子培養(yǎng)24h后，以體積百分比1%接種量接入LB培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)20h后收集菌體，加入含5g/L阿魏酸的磷酸鹽緩沖液中，在50°C條件下160轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，取樣，通過(guò)TLC對(duì)阿魏酸的降解、香蘭素的生成進(jìn)行快速的鑒定，本實(shí)施例的地衣芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下:
(I)斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌7172接種到LB固體培養(yǎng)基上，在50°C、pH7條件下，靜置培養(yǎng)24h ；
(2)制備種子培養(yǎng)液:用步驟(1)所得到的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基中，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接1 3次，制得種子培養(yǎng)液；
(3)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，在50°C條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)20h ；
(4)菌體的收集:將步驟(3)所得到的發(fā)酵液在6000rpm的條件下離心，棄上清，得到沉淀物，即菌體；
(5)菌體的轉(zhuǎn)化:將步驟(4)所得的菌體用磷酸鹽緩沖液(4.2mM Na2HPO4, 2.2mMKH2PO4,0.9mM NaCl, 1.9mM NH4Cl, pH為7)沖洗三次，再用相同的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，同時(shí)加入5g/L的阿魏酸鈉溶液，在50°C條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)IOh和2d時(shí)取樣；
(6)薄層層析(TLC)快速鑒定:將阿魏酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香蘭素標(biāo)樣溶于甲醇溶液，將發(fā)酵液在13000rpm條件下離心5min,去沉淀,得上清,點(diǎn)樣。薄層層析使用的展開(kāi)劑的體積比為:氯仿:環(huán)已烷:甲醇:甲酸(15:15:5:0.2);顯色劑:5%濃H2SO4溶于無(wú)水乙醇。結(jié)果如圖2所示，圖中，1為阿魏酸標(biāo)樣，2為香蘭素標(biāo)樣，3為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚標(biāo)樣，4為培養(yǎng)IOh的發(fā)酵液，5為培養(yǎng)2d的發(fā)酵液；可見(jiàn)，發(fā)酵液中存在香蘭素，且量逐漸增加，阿魏酸的量逐漸減少。實(shí)施例3
地衣芽孢桿菌菌體在種子培養(yǎng)24h后以體積百分比1%接種量接入LB培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)20h后收集菌體，加入含5g/L阿魏酸的磷酸鹽緩沖液中，在50°C條件下160rpm振蕩培養(yǎng)兩天取樣，通 過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。本實(shí)施例的地衣芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下:
(1)斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌7172接種到LB固體培養(yǎng)基上，在50°C、pH7條件下，靜置培養(yǎng)24h ；
(2)制備種子培養(yǎng)液:用步驟(1)所得到的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基中，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接1 3次，制得種子培養(yǎng)液；
(3)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，在50°C條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)20h ；
(4)菌體的收集:將步驟(3)所得到的發(fā)酵液在6000rpm的條件下離心，棄上清，得到沉淀物，即菌體；
(5)菌體的轉(zhuǎn)化:將步驟(4)所得的菌體用磷酸鹽緩沖液沖洗三次，再用相同的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，同時(shí)加入5g/L的阿魏酸鈉溶液，在50°C條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)2d，取樣；
(6)代謝產(chǎn)物的鑒定:取得的轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)氯仿抽提后，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測(cè)發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物。GC-MS的參數(shù)設(shè)置為:初始溫度為50°C (保持lmin)，50-260°C每分鐘上升10°C ;然后260°C的條件下保持5min ;載氣N2:lml/min ;入口溫度為250°C。結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)，代謝產(chǎn)物中主要含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香蘭素等。實(shí)施例4
地衣芽孢桿菌菌體在種子培養(yǎng)24h后以體積百分比1%接種量接入LB培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)20h后收集菌體，加入含5g/L阿魏酸的磷酸鹽緩沖液中，在50°C條件下160rpm振蕩培養(yǎng)。每隔一天取樣，并用HPLC測(cè)定阿魏酸和香蘭素的濃度。本實(shí)施例的地衣芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下:
(1)斜面培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌7172接種到LB固體培養(yǎng)基上，在50°C、pH7條件下，靜置培養(yǎng)24h ；
(2)制備種子培養(yǎng)液:用步驟(I)所得到的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基中，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 3次，制得種子培養(yǎng)液；
(3)菌體的發(fā)酵培養(yǎng):使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，在50°C條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)20h ；
(4)菌體的收集:將步驟(3)所得到的發(fā)酵液在6000rpm的條件下離心，棄上清，得到沉淀物，即菌體；
(5)菌體的轉(zhuǎn)化:將步驟(4)所得的菌體用磷酸鹽緩沖液沖洗三次，再用相同的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，同時(shí)加入5g/L的阿魏酸鈉溶液，在50°C條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)7d,
每隔一天取一次樣；
(6)香蘭素和阿魏酸濃度的測(cè)定:每天取得到的轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸乙酯萃取后使用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)發(fā)酵液中香蘭素和阿魏酸的濃度。高效液相色譜的色譜條件為:流動(dòng)相為甲醇:7jC:冰醋酸(體積比為35:65:0.05);流速為0.80ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm和280nm ;柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20ML ;等梯度洗脫。以保留時(shí)間定性，以峰面積定量。結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)，阿 魏酸的量逐漸減少，香蘭素的量先增加后減少。
權(quán)利要求
1.一種地衣芽孢桿菌，其分類(lèi)命名為地衣芽孢桿菌licheniformis') 7172,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 7172，保藏日期2013年I月18日，保藏地址中國(guó)北京。
2.權(quán)利要求I所述的地衣芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟 (1)斜面培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌7172接種到斜面培養(yǎng)基上，在50°C、pH7條件下，靜置培養(yǎng)24h ； (2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(I)所得到的斜面培養(yǎng)物，接種到種子液培養(yǎng)基中，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 3次，制得種子培養(yǎng)液； (3)菌體的發(fā)酵培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)20h ； (4)菌體的收集將步驟(3)所得到的發(fā)酵液在6000rpm的條件下離心，棄上清，得到沉淀物，即菌體； (5)菌體的轉(zhuǎn)化將步驟(4)所得的菌體用磷酸鹽緩沖液沖洗三次，再用相同的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，同時(shí)加入8g/L的阿魏酸鈉溶液，在50°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)5d，獲得天然香蘭素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基配方為酵母提取物5g/I,Tryptone 10g/L,氯化鈉 5g/L,瓊脂 18g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述種子液培養(yǎng)基配方為酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化鈉 5g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化鈉 5g/L;pH 調(diào)至 7。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的成份為4.2mMNa2HPO4, 2. 2mM KH2PO4,0. 9mM NaCl, I. 9mM NH4Cl, pH 為 7。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的阿魏酸鈉溶液是將阿魏酸溶于磷酸鹽緩沖液中，再用NaOH調(diào)節(jié)pH至7。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種地衣芽孢桿菌，其分類(lèi)命名為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)7172，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.7172，保藏日期2013年1月18日，保藏地址中國(guó)北京。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌7172及其應(yīng)用，使用地衣芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素是在高溫條件下進(jìn)行的，可以有效控制雜菌的生長(zhǎng)，有利于工業(yè)生產(chǎn)。同時(shí)采用該方法環(huán)境污染小，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品環(huán)境友好，安全可靠，克服了長(zhǎng)期以來(lái)采用化學(xué)合成法生產(chǎn)香蘭素的弊端，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/10GK103255084SQ201310140820
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者丁少軍, 保華榮, 胡宏飛 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)