專利名稱：一種飼用地衣芽孢桿菌菌劑制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種飼用益生菌劑，尤其涉及一種有效微生物為地衣芽孢桿菌的飼料添加劑。
背景技術(shù)：
飼用抗生素曾被認為是20世紀(jì)畜牧業(yè)生產(chǎn)中最偉大的生物技術(shù)，自從1946年首次報道了鏈霉素可刺激雛雞生長，1950年美國食品與藥物管理局(FDA)首次批準(zhǔn)抗生素用作飼料添加劑后，抗生素在大量用作治療和預(yù)防細菌性疾病的同時，還作為飼料添加劑被大范圍推廣和應(yīng)用，對控制畜禽感染性疾病、保障現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展發(fā)揮了極其重要的作用，但隨著抗生素過度濫用，其種種弊端也逐漸被人們所認識。同時，抗生素也越來越嚴(yán)重的危害著人們生命健康，長期攝入具有抗生素殘留的食物，慢慢會使人們的身體處于亞中毒狀態(tài)，集聚到一定程度，會誘發(fā)各種疾病，甚至危及生命。尤其是近年來，由飼料安全問題引發(fā)的事件越來越多，引起全世界越來越多人的關(guān)注，抗生素在飼料中的添加也越來越成為世界性的食品恐慌癥的根源?？股卦陲暳现械奶砑右彩艿皆絹碓蕉嗫茖W(xué)家、畜牧工作者的反對。因此，研究開發(fā)無殘留無毒副作用的替代飼用抗生素的產(chǎn)品成為世界各國專家備受關(guān)注的課題。益生菌劑是在微生態(tài)理論指導(dǎo)下，由有益微生物或微生物菌群、經(jīng)特殊發(fā)酵工藝研制而成的含有活菌及其代謝產(chǎn)物的微生物制劑，在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進機體免疫、提高飼料消化率、改善畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)性能等方面有顯著效果，被認為是無毒、無害、無副作用的綠色飼料添加劑，作為抗生素替代品具有潛在的應(yīng)用價值。目前國內(nèi)益生菌劑生產(chǎn)廠家數(shù)量眾多，生產(chǎn)工藝多采用固體發(fā)酵，生產(chǎn)過程易于污染雜菌，菌體含量不易控制，產(chǎn)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)菌株退化現(xiàn)象嚴(yán)重，在畜禽養(yǎng)殖中實際效果不明顯，造成飼用微生態(tài)菌劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述飼用微生態(tài)行業(yè)存在的問題，篩選得到一株地衣芽孢桿菌，能在畜禽腸道中迅速定殖，分泌的桿菌肽在畜禽腸道中具有廣譜抗菌作用，可以直接殺死病原菌，無任何毒素殘留；該菌還可以分泌高活性的蛋白酶，提高飼料的消化利用率。本發(fā)明涉及的飼用地衣芽孢桿菌菌劑是地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis) BLBY-7經(jīng)液態(tài)發(fā)酵增殖培養(yǎng)后經(jīng)真空冷凍干燥而成。所述的地衣芽孢桿菌(Baclicus lincheniformis)BLBY_7,篩選自牛的瘤胃，能在畜禽腸道中快速定植，并分泌桿菌肽和蛋白酶。所述的飼用地衣芽孢桿菌菌劑的制備方法如下:
(I)種子培養(yǎng)
將地衣芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化16 24 h后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)16 24 h,作為種子培 養(yǎng)液；(2)增殖培養(yǎng)
將上述種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3 10%的接種量轉(zhuǎn)接到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)16 24 h后，有效活菌數(shù)可達到IO8 101° CFU/mL ；
(3)離心分離
在4°C條件下將上述發(fā)酵液離心15 20min，取下層沉淀備用；
(4)真空冷凍干燥
將沉淀與凍干保護劑充分混合，在真空度6 Pa，冷凍溫度-40°C，凍干時間為疒10 h的條件下凍干即可得地衣芽孢桿菌菌劑，其中凍干保護劑的用量為發(fā)酵液體積的1/1(Γ /4 ；所述的種子培養(yǎng)基配方為:酵母膏0.5%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1.2%，磷酸氫二鉀0.3%，硫酸鎂0.02%,硫酸錳0.05%,調(diào)節(jié)ρΗ7.0。所述的液態(tài)增殖發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:玉米粉2.5%，豆柏粉2.0%，麩皮1.5%，硫酸銨
0.5%，硫酸鎂0.05%,磷酸氫二鈉0.5%，硫酸錳0.05%,發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)ρΗ7.0。所述的凍干 保護劑配方為:脫脂奶粉10%，甘油1%，乳糖1%，胱氨酸0.15%，維生素
0.3%。本發(fā)明制得的地衣芽孢桿菌菌劑有效活菌數(shù)為8 23X 101° CFU/g。本發(fā)明制得的地衣芽孢桿菌菌劑主要用于畜禽養(yǎng)殖，可在常規(guī)飼料中添加
0.0I 0.05%。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
本發(fā)明得到的飼用益生菌劑有效微生物為地衣芽孢桿菌，該微生物能分泌桿菌肽和蛋白酶，可在畜禽腸道中快速定殖，殺死腸道中的病原菌；所分泌的蛋白酶有助于提高飼料的消化利用率；另外菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，也能產(chǎn)生桿菌肽和蛋白酶，采用真空冷凍干燥工藝，不但保證了菌種的成活率，也能使桿菌肽和蛋白酶的活性得到最大限度的保持，提高了菌劑的綜合效能；該菌劑活菌數(shù)目高，活化簡單，使用成本低，與抗生素相比，顯著降低養(yǎng)殖成本。
具體實施例方式實施例1:地衣芽孢桿菌菌劑的制備
(1)一級種子培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化16 24h后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)16 h，作為種子培養(yǎng)液；
(2)液態(tài)發(fā)酵增殖培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的7%的接種量轉(zhuǎn)接到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)20 h后，有效活菌數(shù)可達到3.4X IO9 CFU/g ；
(3)離心分離:在4°C條件下將上述發(fā)酵液離心15min，取下層沉淀備用；
(4)添加凍干保護劑真空冷凍干燥:在沉淀中加入發(fā)酵液體積的10%凍干保護劑，充分混合后，在真空度6 Pa，冷凍溫度-40°C，凍干時間為8 h制得地衣芽孢桿菌菌劑，有效活菌數(shù)為 12 X 101° CFU/g ；
實施例2:地衣芽孢桿菌菌劑的制備
(1)一級種子培養(yǎng):將地衣芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化16 24h后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)20 h，作為種子培養(yǎng)液；
(2)液態(tài)發(fā)酵增殖培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3%的接種量轉(zhuǎn)接到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)24 h后，有效活菌數(shù)可達到5.6 X IO9 CFU/mL ；
(3)離心分離:在4°C條件下將上述發(fā)酵液離心20min，取下層沉淀備用；
(4)添加凍干保護劑真空冷凍干燥:在沉淀中加入發(fā)酵液體積的20%凍干保護劑，充分混合后，在真空度6 Pa，冷凍溫度-40°C，凍干時間為10 h制得地衣芽孢桿菌菌劑，有效活菌數(shù)為 18 X 101° CFU/g ；
實施例3:地衣芽孢桿菌菌劑的應(yīng)用
選取100頭30日齡斷奶、平均體重7.20±0.30 kg的三元(杜洛克X長白X大白)雜交仔豬，根據(jù)平均體重，隨機分成2組，一組只使用常規(guī)飼料配方，不添加抗生素和本發(fā)明菌劑產(chǎn)品，另一種在常規(guī)飼料中添加本發(fā)明產(chǎn)品0.03%，按常規(guī)方法進行驅(qū)蟲、免疫和飼料管理，連續(xù)飼養(yǎng)I個月，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)飼料中添加本發(fā)明地衣芽孢桿菌菌劑的一組比另一組腹瀉率降低62%，蛋白消化率提 高6.3%，料肉比降低3.4%。
權(quán)利要求
1.一種飼用地衣芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于將地衣芽孢桿菌經(jīng)液態(tài)發(fā)酵增殖培養(yǎng)后真空冷凍干燥而成。
2.如權(quán)利要求1所述的飼用地衣芽孢桿菌菌劑，其特征在于，所述地衣芽孢桿菌(Baclicus lincheniformis) BLBY-7,篩選自牛的瘤胃，能在畜禽腸道中快速定植，并分泌桿囷妝和蛋白酶。
3.如權(quán)利要求1所述的飼用地衣芽孢桿菌菌劑，其特征在于，所述菌劑是通過以下步驟制得的: (1)種子培養(yǎng) 將地衣芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化16 24 h后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)16 24 h,作為種子培養(yǎng)液； (2)增殖培養(yǎng) 將上述種子培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3 10%的接種量轉(zhuǎn)接到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)16 24 h后，有效活菌數(shù)可達到IO8 101° CFU/mL ； (3)離心分離 在4°C條件下將上述發(fā)酵液離心15 20 min，取下層沉淀備用； (4)真空冷凍干燥將沉淀與凍干保護劑充分混合，在真空度6 Pa，冷凍溫度-40°C，凍干時間為疒10 h的條件下凍干即可得地衣芽孢桿菌菌劑，其中凍干保護劑的用量為發(fā)酵液體積的1/1(Γ /4 ；其中，所述的種子培養(yǎng)基配方為:酵母膏0.5%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1.2%，磷酸氫二鉀0.3%，硫酸鎂0.02%,硫酸錳0.05%,調(diào)節(jié)ρΗ7.0 ； 所述的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:玉米粉2.5%，豆柏粉2.0%，麩皮1.5%，硫酸銨0.5%，硫酸鎂0.05%,磷酸氫二鈉0.5%，硫酸錳0.05%,發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)ρΗ7.0 ； 所述的凍干保護劑配方為:脫脂奶粉10%，甘油1%，乳糖1%，胱氨酸0.15%，維生素0.3%。
4.如權(quán)利要求1所述的飼用地衣芽孢桿菌菌劑，其特征在于，所述地衣芽孢桿菌菌劑主要應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域，添加量為0.0Γ0.05%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種飼用地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)菌劑的制備方法及應(yīng)用，屬于飼料添加劑領(lǐng)域。所述地衣芽孢桿菌BLBY-7，篩選自牛的瘤胃，能分泌桿菌肽，在畜禽腸道中具有廣譜抗菌作用，可以直接殺死病原菌，無任何毒素殘留，還可以分泌高活性的蛋白酶，從而能提高飼料的消化利用率；所述菌劑中含地衣芽孢桿菌8~23×1010CFU/g以上，在畜禽常規(guī)飼料中按重量百分比0.01~0.05%添加使用，可有效提高畜禽對常規(guī)疾病的抵抗能力，減少抗生素的使用量。
文檔編號C12R1/10GK103232959SQ20131014100
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者劉宗利, 王乃強, 胥九兵, 劉海玉, 李克文, 孔健, 施安輝, 季明杰, 李方華 申請人:保齡寶生物股份有限公司