一種針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法，包括以下步驟：（1）根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含修復(fù)位點(diǎn)的正、反向引物；（2）以含有突變基因的質(zhì)粒為模板，加入正、反向引物，在高保真DNA聚合酶的作用下進(jìn)行環(huán)狀延伸PCR；（3）采用DpnI酶將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的步驟（2）產(chǎn)物進(jìn)行酶切，去除質(zhì)粒模板得到具有修復(fù)位點(diǎn)的帶有缺刻的開環(huán)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子測序驗(yàn)證。本發(fā)明的方法正向引物、反向引物設(shè)計(jì)簡便，擴(kuò)增效率高；引物與模板的結(jié)合效率高，目的條帶易得；修復(fù)成功率高。不需膠回收、無需連接與篩選，是一種簡便可行、成功率高、節(jié)約時間、降低成本的針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法。
【專利說明】一種針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 基因突變是指DNA分子上核苷酸序列或數(shù)目發(fā)生改變。由一個或一對堿基發(fā)生改 變引起的核苷酸序列改變所致的突變，稱為定點(diǎn)突變。定點(diǎn)突變的方式包括堿基的替換、插 入和缺失。
[0003] 堿基替換改變了密碼子的組成，可能會出現(xiàn)四種不同的生物學(xué)效應(yīng)：同義突變、錯 義突變、無義突變和終止密碼突變。
[0004] 在DNA編碼序列中插入或缺失一個或幾個堿基對（3個或3的倍數(shù)除外)，從而使 插入或缺失點(diǎn)以后的DNA編碼框架全部改變，這種基因突變稱為移碼突變。其結(jié)果導(dǎo)致插 入或缺失以后部分翻譯出的氨基酸的種類和順序也發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)或酶的生物 功能。
[0005] 隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，對異源基因優(yōu)化與合成的需求不斷增加。在人工 合成基因的過程中，由于單鏈寡核苷酸精度與純度的限制（Ai-Sheng Xiong，Quan-Hong Yao，Ri_He Peng，et al.Nature Protocols.2006, 1(2):791_797·)，以及基因序列的復(fù)雜 性，如：重復(fù)序列、GC含量分布不均、二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜等，導(dǎo)致基因突變。如若從頭合成，則面 臨著成功率低、時間與資源浪費(fèi)的雙重風(fēng)險(xiǎn)，這些客觀因素導(dǎo)致的基因突變是常規(guī)基因合 成無法避免的，基因突變修復(fù)顯然是更簡便可行、成功率高、節(jié)約時間、降低成本的一種方 法。
[0006] 基因突變修復(fù)可以采用商業(yè)化的定點(diǎn)突變試劑盒，但該試劑盒價格昂貴，在針 對合成基因突變的多種復(fù)雜情況時，效率較低。而較常用的基因突變修復(fù)技術(shù)搭橋PCR (Yue-Hua Xiao，Meng_Hui Yin，Lei Hou，et al.Biotechnol Lett. 2007, 29:925-930)，雖然 成本較低，但是需要經(jīng)過兩輪PCR，兩步膠回收，需要連接與篩選，步驟稍顯繁瑣，周期略長。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡便可行、成功率高、節(jié)約時 間、降低成本的針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0009] -種針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法，包括以下步驟：
[〇〇1〇] 一種針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法，包括以下步驟：
[〇〇11] (1)根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含修復(fù)位點(diǎn)的正向引物和反向引物；
[0012] (2)以含有突變基因的質(zhì)粒為模板，加入步驟（1)合成的正向引物和反向引物，在 高保真DNA聚合酶的作用下進(jìn)行環(huán)狀延伸PCR ;
[0013] (3)采用Dpnl酶將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的步驟（2)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，去除質(zhì)粒 模板得到具有修復(fù)位點(diǎn)的帶有缺刻的開環(huán)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子測 序驗(yàn)證。
[0014] 步驟（1)所述突變?yōu)橐粋€堿基對的替換、一個堿基對的插入或一個堿基對的缺失。
[0015] 正向引物長度優(yōu)選為50?80個堿基，反向引物長度優(yōu)選為50?80個堿基，在正 向引物、反向引物的5'端優(yōu)選具有15?45個堿基的重疊區(qū)，修復(fù)位點(diǎn)位于重疊區(qū)。
[0016] 正向引物為SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 3或SEQ ID N0. 5所示的序列；反向引物為 SEQIDN0·2、SEQIDN0·4或SEQIDN0·6所示的序列，其中SEQIDN0·1和SEQIDN0·2 成對；SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 成對；SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 成對。
[0017] 正向引物、反向引物的5'端最好是具有23?40個堿基的重疊區(qū)，修復(fù)位點(diǎn)位于 重疊區(qū)。
[0018] 步驟（2) PCR的程序?yàn)闇囟忍荻萈CR或降落PCR。
[〇〇19] 溫度梯度PCR的反應(yīng)條件為：
[0020] 95°C 預(yù)變性 2min ?5min ;
[0021] 95°C 變性 20s ?30s ;51°C ?66°C 退火 30s ;72°C 延伸，延伸時間 lmin/2kb ? lmin/4kb ;25 ?35 個循環(huán)；
[0022] 72? 延伸 5min ?10min。
[0023] 降落PCR的反應(yīng)條件為：
[0024] 95°C 預(yù)變性 2min ?5min ;
[0025] 95°C 變性 20s ?30s ;50°C ?69°C 退火 30s ;72°C 延伸，延伸時間 lmin/2kb ? lmin/4kb ;25?35個循環(huán)，其中每個循環(huán)的退火溫度比前一循環(huán)降低0. 3°C?0. 5°C ;
[0026] 72? 延伸 5min ?10min。
[0027] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提出了一種在人工合成基因突變率較高的情況下，對已有 的基因定點(diǎn)突變進(jìn)行修復(fù)的方法。本發(fā)明的方法正向引物、反向引物設(shè)計(jì)簡便，提高了擴(kuò)增 的效率；PCR程序提供了溫度梯度PCR和降落PCR兩種可選的優(yōu)化程序，提高了引物與模板 的結(jié)合效率，使得目的條帶更易獲得；目的條帶無需純化、允許非特異條帶的存在，酶切反 應(yīng)后，無需將酶滅活即可進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)化子無需菌落PCR或提 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，即可擴(kuò)大培養(yǎng)后直接測序驗(yàn)證，而且，修復(fù)成功率很高。不需膠回收、無需連 接與篩選，是一種簡便可行、成功率高、節(jié)約時間、降低成本的針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù) 的方法。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的F214-1的常規(guī)引物PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；
[0029] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的Q213-8的常規(guī)引物PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；
[0030] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的Q213-8的本發(fā)明的引物PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測 圖；
[0031] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3的H407-14的本發(fā)明的引物PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測 圖；
[0032] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例4的K401-6的本發(fā)明的引物PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測 圖。 【具體實(shí)施方式】
[0033] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0034] 大腸桿菌T0P10等宿主細(xì)胞具有甲基化酶基因，能夠?qū)Ⅲw內(nèi)質(zhì)粒甲基化。因此，從 大腸桿菌T0P10細(xì)胞提取的含有突變基因的質(zhì)粒上有被甲基化的位點(diǎn)。而Dpnl酶能夠識 別甲基化的GATC位點(diǎn)。
[0035] 實(shí)施例1 :基因片段F214 (SEQ ID N0. 11)的定點(diǎn)突變修復(fù)
[0036] (1)與正確DNA序列相比，定點(diǎn)突變菌株F214-1 (宿主菌是大腸桿菌T0P10菌株） 在DNA序列的439位堿基缺失，突變位點(diǎn)處有連續(xù)的5個T，在基因合成時易發(fā)生插入或缺 失突變；
[0037] 根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含修復(fù)位點(diǎn)的常規(guī)正向引物、反向引物(修 復(fù)位點(diǎn)加下劃線、字體加粗表示）；常規(guī)正向引物為SEQ ID N0. 7所示的序列，反向引物為 SEQ ID N0. 8所示的序列；
[0038] (2)以含有突變基因的質(zhì)粒為模板，加入SEQ ID N0. 7所示常規(guī)正向引物、SEQ ID NO. 8所示常規(guī)反向引物，在TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金）的作用下進(jìn)行環(huán)狀 延伸PCR ;PCR程序?yàn)闇囟忍荻萈CR ;
[0039] (3)采用Dpnl酶將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的步驟（2)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，去除質(zhì)粒 模板得到具有修復(fù)位點(diǎn)的帶有缺刻的開環(huán)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子測 序驗(yàn)證。
[0040] 常規(guī)正向引物為：SEQ ID NO. 7:5 ' -GGTATGGCGGGITTIlCGAITTGGAAG-3 '（ Tm 值 64. 8°C，Vector NTI AdvancelO 計(jì)算）
[0041] 常規(guī)反向引物為：SEQ ID NO. 8:5'-GAAAAACCCGCCATACCTGTTCAAATTTACC-3'（Tm 值 64.7°C，Vector NTI AdvancelO 計(jì)算）
[0042] PCR反應(yīng)體系：
[0043] 5XPCR 緩沖液 5μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ)1μ 1，反向引物（10μΜ) 1 μ 1，模板質(zhì)粒（100 ?200ng)0. 25 μ 1，TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金)0· 25 μ 1， 加水補(bǔ)足至25 μ 1。
[0044] 同樣的反應(yīng)體系做4個溫度梯度平行。
[0045] 溫度梯度PCR反應(yīng)條件：
[0046] 95°C 預(yù)變性 5min ;
[0047] 95°C變性30s ;51°C?66°C溫度梯度（Bio-Rad PCR儀，A-H8個通道的溫度分別 為 66. 0°C、64. 8°C、63. 0°C、60. 1°C、56. 5°C、53. 9°C、52. 0°C、51. 0°C)，根據(jù)常規(guī)引物的退 火溫度選用ABCD四個溫度，退火30s ;72°C延伸2min20s (質(zhì)粒長度為733bp，TransStart FastPfu DNA聚合酶的延伸速率為15s/kb?30s/kb) ;30個循環(huán)；
[0048] 72? 延伸 10min。
[0049] 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μ 1 PCR產(chǎn)物，如圖1所示，Μ為1Kb DNA Ladder，ABCD 為從高溫到低溫的四個平行PCR產(chǎn)物，檢測出目的條帶。
[0050] 選用A通道的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0051] Dpnl酶切去除甲基化的模板質(zhì)粒：
[0052] 酶切反應(yīng)體系：10 X酶切緩沖液1 μ 1，PCR產(chǎn)物8. 5 μ 1，Dpnl酶0. 5 μ 1，總體積 10 μ 1〇
[0053] 反應(yīng)條件：37°C，lh。
[0054] 取5 μ 1酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μ 1大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，37°C過夜培養(yǎng)。
[0055] 挑取單菌落，在含終濃度50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220r/min過 夜培養(yǎng)。
[0056] 測序驗(yàn)證。
[0057] 測序結(jié)果：送測的五個克隆全部修復(fù)成功。
[0058] 實(shí)施例2 :基因片段Q213 (SEQ ID N0. 12)的定點(diǎn)突變修復(fù)
[0059] 對于突變位點(diǎn)附近DNA序列環(huán)境較為簡單的定點(diǎn)突變，以常規(guī)引物利用本發(fā)明優(yōu) 化的PCR程序即可達(dá)到修復(fù)效果，但是對于突變位點(diǎn)附近DNA序列環(huán)境相對復(fù)雜的定點(diǎn)突 變，常規(guī)引物很難擴(kuò)增出目的條帶，而本發(fā)明的引物能擴(kuò)增出目的條帶。
[0060] (1)與正確DNA序列相比，定點(diǎn)突變菌株Q213-8 (宿主菌是大腸桿菌T0P10菌株） 在DNA序列的433位堿基C突變?yōu)門，突變位點(diǎn)附近有TATAA等重復(fù)序列，容易在基因合成 時發(fā)生突變，對基因合成及突變修復(fù)都提出了較高的要求；
[0061] 根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含修復(fù)位點(diǎn)的正向引物、反向引物(修復(fù)位 點(diǎn)加下劃線、字體加粗表示）；正向引物為SEQ ID NO. 1所示的序列，反向引物為SEQ ID NO. 2所示的序列；設(shè)計(jì)了由SEQ ID NO. 9所示的常規(guī)正向引物和SEQ ID NO. 10所示的常 規(guī)反向引物作為對照實(shí)驗(yàn)；
[0062] (2)以含有突變基因的質(zhì)粒為模板，加入SEQ ID NO. 1所示正向引物、SEQ ID N0. 2 所示反向引物，或加入SEQ ID NO. 9所示常規(guī)正向引物、SEQ ID NO. 10所示常規(guī)反向引物， 在TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金）的作用下進(jìn)行環(huán)狀延伸PCR;PCR程序?yàn)闇囟?梯度PCR ;
[0063] (3)采用Dpnl酶將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的步驟（2)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，去除質(zhì)粒 模板得到具有修復(fù)位點(diǎn)的帶有缺刻的開環(huán)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn) 化子測序驗(yàn)證。
[0064] 常規(guī)正向引物為：SEQ ID NO. 9:5' -GACTAGTTTATAACTT￡GTATAATGTACATTATACG-3' (Tm 值 51.8°C，Vector NTI AdvancelO 計(jì)算）
[0065] 常規(guī)反向引物為：SEQ ID Ν0· 10:5' -￡AAGTTATAAACTAGTCACTTGAATCGG-3'（Tm 值 51. 5°C，Vector NTI AdvancelO 計(jì)算）
[0066] 正、反向引物在5'端存在40個堿基的重疊區(qū)，正、反向引物分別為：
[0067] SEQ ID NO. 1:5, -TTTATAACTTCGTATAATGTACATTATACGAAGTTATTTGTATACTTTTTTAAT GAAGATGACATTGCTCC-3 '
[0068] SEQ ID NO. 2:5, -CAAATAACTTCGTATAATGTACATTATACGAAGTTATAAACTAGTCACTTGAAT CGGTAATACCTTTTTCACCAAT-3 '
[0069] PCR反應(yīng)體系：
[0070] 5XPCR 緩沖液 5μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ)1μ 1，反向引物（10μΜ) 1 μ 1，模板質(zhì)粒（100 ?200ng)0. 25 μ 1，TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金)0· 25 μ 1， 加水補(bǔ)足至25 μ 1。
[0071] 同樣的反應(yīng)體系做4個溫度梯度平行。
[0072] 溫度梯度PCR反應(yīng)條件：
[0073] 95Γ 預(yù)變性 2min;
[0074] 95°C變性20s ;51°C?66°C溫度梯度（Bio-Rad PCR儀，A-H8個通道的溫度依次 為 66. 0°C、64. 8°C、63. 0°C、60. 1°C、56. 5°C、53. 9°C、52. 0°C、51. 0°C)，根據(jù)常規(guī)引物的退火 溫度選用EFGH四個溫度，退火30s ;72°C延伸2min20s (質(zhì)粒長度為4419bp，TransStart FastPfu DNA聚合酶的延伸速率為15s/kb?30s/kb) ;25個循環(huán)；
[0075] 72? 延伸 5min。
[0076] 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μ 1 PCR產(chǎn)物，如圖2所示，Μ為1Kb DNA Ladder，1、2、 3、4為常規(guī)引物PCR產(chǎn)物，未檢測出目的條帶，平行實(shí)驗(yàn)即本發(fā)明的引物PCR產(chǎn)物檢測出目 的條帶，如圖3所示，EFGH為從高溫到低溫的四個平行PCR產(chǎn)物。
[0077] 選用本發(fā)明的引物E通道的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0078] 其余操作步驟參照實(shí)施例1。
[〇〇79] 測序結(jié)果：送測的五個克隆全部修復(fù)成功。
[0080] 實(shí)驗(yàn)證明，溫度梯度PCR反應(yīng)條件還可以是：
[0081] 95°C 預(yù)變性 5min ;
[0082] 95°C變性30s ;51°C?66°C溫度梯度（Bio-Rad PCR儀，A-H8個通道的溫度依次 為 66. 0°C、64. 8°C、63. 0°C、60. 1°C、56. 5°C、53. 9°C、52. 0°C、51. 0°C)，根據(jù)常規(guī)引物的退火 溫度選用EFGH四個溫度，退火30s ;72°C延伸2min20s (質(zhì)粒長度為4419bp，TransStart FastPfuDNA聚合酶的延伸速率為15s/kb?30s/kb) ;35個循環(huán)；
[0083] 72°C延伸lOmin。其它同本實(shí)施例，也可以對基因片段Q213的定點(diǎn)突變進(jìn)行修復(fù)。
[0084] 實(shí)施例3 :基因片段H407 (SEQ ID N0. 13)的定點(diǎn)突變修復(fù)
[0085] (1)與正確DNA序列相比，定點(diǎn)突變菌株H407-14(宿主菌是大腸桿菌T0P10菌株） 在DNA序列的213位后插入堿基T，常規(guī)引物未擴(kuò)增出目的條帶；
[〇〇86] 根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含修復(fù)位點(diǎn)的正向引物和反向引物(修復(fù) 位點(diǎn)加下劃線、字體加粗表示）；正向引物為SEQ ID N0. 3所示的序列，反向引物為SEQ ID NO. 4所示的序列；
[0087] (2)以含有突變基因的質(zhì)粒為模板，加入SEQ ID N0. 3所示正向引物、SEQ ID N0. 4 所示反向引物，在TransStart FastPfu DNA聚合酶的作用下進(jìn)行環(huán)狀延伸PCR ;PCR程序?yàn)?降落PCR ;
[0088] (3)采用Dpnl酶將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的步驟（2)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，去除質(zhì)粒 模板得到具有修復(fù)位點(diǎn)的帶有缺刻的開環(huán)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn) 化子測序驗(yàn)證。
[0089] 正向引物、反向引物在5'端存在45個堿基的重疊區(qū)，正、反向引物分別為：
[0090] SEQ ID NO. 3:5, -GCATTATTTCTGTTTAGTTGATAAATTTTGATTTCTAGTCTGTTGAAAGCCTAA TGCATGCAGATGACATA-3 ?
[0091] SEQ ID NO. 4:5, -CAACAGACTAGAAATCAAAATTTATCAACTAAACAGAAATAATGCAACGTCTCA TAAAGTATTTACTGG-3'
[0092] PCR反應(yīng)體系：
[0093] 5XPCR 緩沖液 5μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ)1μ 1，反向引物（ΙΟμΜ) 1 μ 1，模板質(zhì)粒（100 ?200ng)0. 25μ l，TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金)0· 25μ 1， 加水補(bǔ)足至25 μ 1。
[0094] 降落PCR的反應(yīng)條件為：
[0095] 95°C 預(yù)變性 5min ;
[0096] 95°C變性 30s ;69°C，退火 30s ;72°C延伸 2min20s (質(zhì)粒長度 4512bp);35 個循環(huán)， 每個循環(huán)的退火溫度比前一循環(huán)降低〇. 3°C ;
[0097] 72°C 延伸 7min。
[0098] 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μ 1 PCR產(chǎn)物，如圖4所示，Μ為1Kb DNA Ladder，S1為 PCR產(chǎn)物，檢測出目的條帶。
[0099] 其余操作步驟參照實(shí)施例1。
[0100] 測序結(jié)果：送測的五個克隆修復(fù)成功兩個。
[0101] 實(shí)施例4 :基因片段K401 (SEQ ID N0. 14)的定點(diǎn)突變修復(fù)
[0102] (1)與正確DNA序列相比，定點(diǎn)突變菌株K401-6 (宿主菌是大腸桿菌T0P10菌株） 在DNA序列的464位堿基缺失，常規(guī)引物未擴(kuò)增出目的條帶；
[0103] 根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含修復(fù)位點(diǎn)的正向引物和反向引物(修復(fù) 位點(diǎn)加下劃線、字體加粗表示）；正向引物為SEQ ID N0. 5所示的序列，反向引物為SEQ ID NO. 6所示的序列；
[0104] (2)以含有突變基因的質(zhì)粒為模板，加入SEQ ID N0. 5所示正向引物、SEQ ID N0. 6 所示反向引物，在TransStart FastPfu DNA聚合酶的作用下進(jìn)行環(huán)狀延伸PCR ;PCR程序?yàn)?降落PCR ;
[0105] (3)采用Dpnl酶將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的步驟（2)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，去除質(zhì)粒 模板得到具有修復(fù)位點(diǎn)的帶有缺刻的開環(huán)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn) 化子測序驗(yàn)證。
[0106] 正向引物和反向引物在5'端存在23個堿基的重疊區(qū)，正、反向引物分別為：
[0107] SEQ ID NO. 5:5, -TACAGCTGCCGCTATTGCGTATGGGCTGGACAAGAAATCGCAGAAGGAGCACAA CGTC-3 ,
[0108] SEQ ID NO. 6:5, -CATACGCAATAGCGGCAGCTGTAGGTTCATTAATGATACGAAGAACGTTCAAGC CCGCGA-3 ,
[0109] PCR 反應(yīng)體系：5XPCR 緩沖液 5μ l，2.5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ) 1μ 1，反 向弓丨物（10 μ Μ) 1 μ 1，模板質(zhì)粒（100 ?200ng) 0· 25 μ 1，TransStart FastPfu DNA 聚合酶 (全式金）0. 25 μ 1，加水補(bǔ)足至25 μ 1。
[0110] 降落PCR反應(yīng)條件：
[0111] 95°C 預(yù)變性 5min ;
[0112] 95°C變性 30s ;69°C，退火 30s ;72°C延伸 2min20s (質(zhì)粒長度 4599bp);30 個循環(huán)， 每個循環(huán)的退火溫度比前一循環(huán)降低〇. 5°C ;
[0113] 72°C 延伸 5min。
[0114] 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μ 1 PCR產(chǎn)物，如圖5所示，Μ為1Kb DNA Ladder，S2為 PCR產(chǎn)物，檢測出目的條帶。
[0115] 其余操作步驟參照實(shí)施例1。
[0116] 測序結(jié)果：送測的五個克隆修復(fù)成功三個。
[0117] 實(shí)驗(yàn)證明，降落PCR反應(yīng)條件還可以選用：
[0118] 95°C 預(yù)變性 2min ;
[0119] 95°C變性 20s ;69°C，退火 30s ;72°C延伸 2min20s (質(zhì)粒長度 4599bp);25 個循環(huán)， 每個循環(huán)的退火溫度比前一循環(huán)降低〇. 5°C ;
[0120] 72°C延伸lOmin。其它同本實(shí)施例，也可以對基因片段K401的定點(diǎn)突變進(jìn)行修復(fù)。
[0121] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0001]
【權(quán)利要求】
1. 一種針對合成基因定點(diǎn)突變修復(fù)的方法，其特征在于包括以下步驟： (1)根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含修復(fù)位點(diǎn)的正向引物和反向引物； (2 )以含有突變基因的質(zhì)粒為模板，加入步驟（1)合成的正向引物和反向引物，在高保 真DNA聚合酶的作用下進(jìn)行環(huán)狀延伸PCR ; (3)采用Dpnl酶將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的步驟（2)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，去除質(zhì)粒模板 得到具有修復(fù)位點(diǎn)的帶有缺刻的開環(huán)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子測序驗(yàn) 證。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)所述突變?yōu)橐粋€堿基對的替 換、一個堿基對的插入或一個堿基對的缺失。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于正向引物長度為50?80個堿基，反向引物 長度為50?80個堿基，在正向引物、反向引物的5'端具有15?45個堿基的重疊區(qū)，修復(fù) 位點(diǎn)位于重疊區(qū)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于所述正向引物為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 5所示的序列；所述反向引物為SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6 所示的序列，其中 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 成對；SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 成 對；SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 成對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述正向引物、反向引物的5'端具有23? 40個堿基的重疊區(qū)，修復(fù)位點(diǎn)位于重疊區(qū)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2) PCR的程序?yàn)闇囟忍荻萈CR或降 落 PCR。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述溫度梯度PCR的反應(yīng)條件為： 95°C 預(yù)變性 2min ?5min ; 95 °C變性20s?30s ;51 °C?66 °C退火30s ;72 °C延伸，延伸時間lmin/2kb? lmin/4kb ;25 ?35 個循環(huán)； 72°C延伸 5min ?10min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述降落PCR的反應(yīng)條件為： 95°C 預(yù)變性 2min ?5min ; 95 °C變性20s?30s ;50 °C?69 °C退火30s ;72 °C延伸，延伸時間lmin/2kb? lmin/4kb ;25?35個循環(huán)，其中每個循環(huán)的退火溫度比前一循環(huán)降低0. 3°C?0. 5°C ; 72°C延伸 5min ?10min。
【文檔編號】C12N15/10GK104109665SQ201310141220
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月22日
【發(fā)明者】李炳志, 王霞, 趙鵑, 元英進(jìn) 申請人:天津大學(xué)