熒光pcr技術(shù)檢測pds基因2168 a> g突變的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用熒光定量PCR技術(shù)檢測耳聾基因PDS2168A＞G突變的方法及試劑盒。針對PDS2168A＞G突變位點，設(shè)計特異性突變型探針和野生型探針并分別標記不同顏色的熒光，突變位點兩側(cè)設(shè)計擴增引物。對一個待測樣本用含野生型探針、突變型探針及擴增引物的PCR反應體系進行擴增，通過與質(zhì)控品比較熒光曲線模式判斷樣本是否存在PDS基因2168A＞G突變。本發(fā)明能為耳聾患者尤其是伴大前庭水管綜合征的病因診斷提供臨床參考，也能篩查新生兒、孕期夫婦是否為攜帶者，為耳聾的產(chǎn)前診斷、新生兒先天耳聾病因診斷提供幫助。試劑盒具有閉管高通量自動化操作及分析的特點，尤其適合臨床實驗室使用。
【專利說明】熒光PCR技術(shù)檢測PDS基因2168 A> G突變的方法及其試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種探針特異性的實時PCR技術(shù)檢測耳 聾基因 H)S 2168A > G突變的方法及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是造成語言交流障礙最常見的疾病，新生兒耳聾的發(fā)病率為0. 1 %?0. 3%。 我國聽力語言殘疾者甚眾，并以每年新生3萬聾兒的速度增長，我國累計約有30萬對生育 至少一個聾兒的育齡夫婦面臨再次生育的選擇。耳聾發(fā)生的原因、是否具有遺傳性、下一 次生育是否安全是耳聾家庭極為關(guān)心的問題。大前庭水管綜合征（Enlarge vestibular aqueduct syndrome. EVAS)是一種發(fā)病率較高的常染色體隱性遺傳性聽力障礙性疾病。影 像學檢查資料表明在兒童感音神經(jīng)性聾患者中，大前庭水管是最常見的一種內(nèi)耳畸形，在 遺傳性聾人群中發(fā)病率約為1%?1.3%，在某些地區(qū)甚至可達7%。SLC26A4基因定位于 7q31，其mRNA全長4930bp，共有21個外顯子.開放閱讀框架2343bp，貫穿于外顯子2和外 顯子21，編碼780個氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，屬于離 子轉(zhuǎn)運體家族，研究表明其功能主要與碘氯離子轉(zhuǎn)運有關(guān)突變的特點。2168A > G突變是 EVAS患者中最常見的SLC26A4基因突變位點之一，對中國人群進行2168A > G突變的普遍 篩查，可降低大前庭水管患兒的出生率。
[0003] 目前進行基因突變檢測的方法有數(shù)十種。金標準法為PCR產(chǎn)物直接測序法。PCR 產(chǎn)物直接測序法是目前應用最廣泛、較準確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設(shè)備 和專業(yè)的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣?；蛐酒ň哂锌焖俑咄康?優(yōu)點，但是操作上復雜，步驟多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP) 檢測基因突變的方法具有成本低廉的優(yōu)點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。公開的專 利201010599385. X，采用特異性引物及探針，通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù) 進行突變檢測，該方法操作上復雜，儀器昂貴，也不易普及推廣。
[0004] 本方法采用一種實時熒光聚合酶鏈反應技術(shù)（FQ-PCR)檢測PDS基因2168A > G 突變的方法，針對PDS基因2168A > G位點設(shè)計特異性野生型探針及突變型探針，野生型及 突變型探針分別被標記上不同顏色的熒光，同時在PDS基因2168位點兩側(cè)翼序列區(qū)設(shè)計特 異性擴增引物，對于檢測樣本，依據(jù)野生型與突變型探針在PCR擴增中產(chǎn)生的熒光顏色不 同來判斷樣本是否存在突變。該方法具有時間短、高通量、閉管自動化操作、結(jié)果分析簡單， 檢測單個位點突變需要1個PCR反應管實現(xiàn)的優(yōu)點。適合臨床實驗室使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種PDS基因 2168A > G突變的實時熒光PCR檢測方法和 試劑盒，可用于臨床樣本的檢測。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)路線為：
[0007] 1)PDS基因外顯子19區(qū)域（SEQ ID NO :5)的2168A > G位點處設(shè)計野生型探針及 突變型探針，其長度均為10_30bp之間的核苷酸序列。兩種探針均覆蓋PDS基因2168A > G位點，其中野生型探針（SEQ ID NO :3)針對PDS基因2168A > G野生型位點，突變型探針 (SEQ ID NO :4)針對PDS基因2168A > G突變位點。
[0008] 2)探針5'端標記熒光發(fā)生基團FAM或HEX等類似發(fā)光基團，3'端標記熒光淬滅基 團TAMRA或BHQ1等類似淬滅基團。探針序列并不局限于本說明書中的具體核苷酸序列，可 以是覆蓋PDS基因2168A > G位點的任意一段符合探針要求的核苷酸序列。探針5'端標 記的熒光發(fā)生基團及其相應的3'端熒光淬滅基團可以是目前本領(lǐng)域中任何可用的熒光基 團，如FAM，HEX可以由其他熒光基團或染料代替，如VIC，JOE，CY5等。可以使用目前常用的 Taqman探針，也可以是在普通Taqman探針基礎(chǔ)上經(jīng)過修飾的LNA-Taqman探針，MGB-Taqman 探針或現(xiàn)有技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)的在Taqman探針基礎(chǔ)上改良修飾的相關(guān)探針。
[0009] 3)PDS基因2168位點上游設(shè)計正向擴增引物，在下游設(shè)計反向擴增引物，其長度 均為10-30bp之間的核苷酸序列，能夠擴增出含有PDS基因2168位點的長度為50-700bp 的核苷酸片段，優(yōu)選地，正向引物（SEQ ID NO :1)及反向引物（SEQ ID NO :2)為能擴增出含 有PDS基因2168位點的60-150bp片段的特異性核苷酸序列。
[0010] 4)配制適宜于PCR擴增的反應體系。核酸擴增反應體系包括：耐熱DNA聚合酶、 dNTP、UNG酶、含有Mg離子的緩沖液，正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)， 野生型探針（SEQ ID NO :3)，突變型探針（SEQ ID NO :4)。
[0011] 5)從待測樣本中提取DNA，加入反應體系，進行熒光定量PCR反應。
[0012] 6)依據(jù)野生型、突變型探針標記的不同顏色顯示確定樣本的基因型。只有野生型 探針的顏色顯示時，樣本為野生型，反之為突變型，如果兩種顏色都存在，則樣本為雜合型。
[0013] 本發(fā)明提供的PDS基因2168A > G突變檢測試劑盒主要包括以下組分：PCR反應 液，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，DNA裂解液，紅細胞裂解液和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管 的包裝盒。
[0014] 本發(fā)明依據(jù)下述原理來實現(xiàn)，為了檢測roS(SEQ ID NO :5)基因2168A > G位點， 設(shè)計覆蓋2168A > G位點的突變型探針與野生型探針，野生型探針只能與野生型樣本模板 完全匹配，突變型探針只能與突變型樣本模板完全匹配，由于突變型探針與野生型探針5' 端標記的熒光報告基團不同，即二者發(fā)射波長不同的熒光，在熒光PCR儀上被分別記錄并 在分析軟件中以不同顏色或不同的標記反映出來。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，試劑盒中PCR反應液含有1XPCR Buffer、 dNTPs、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)，野生型 探針（SEQ ID NO :3)，突變型探針（SEQ ID NO :4)。
[0016] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' -CTTTGACGACAACATTAGAAAGG-3'
[0017] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -TTGACCCTCTTGAGATTTCACT-3'
[0018] 野生型熒光探針（SEQ ID NO :3) :5' FAM-TTTGACGGTCCATGATGCTATA-BHQ13'
[0019] 突變型熒光探針（SEQ ID NO :4) :5' FAM-TTTGACGGTCCGTGATGCTATA-BHQ13'
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中也可以僅加入突變型探針，當模板是 突變型時，則最終可檢測到突變型探針發(fā)射出的熒光，因而確定樣本含有突變位點，當模板 是野生型時，則最終不能檢測到突變型探針發(fā)射出的熒光，因而確定樣本不含有突變位點。 理論上，一個體系中可以僅加入突變型探針，但是當同時加入野生型探針時，可以起到反向 校正的雙保險作用，使結(jié)果更加準確可靠。僅加入突變型探針的試劑盒中PCR反應液含有 1XPCR Buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向引物（SEQIDN0:l)，反向引物（SEQID NO :2)，突變型探針（SEQ ID NO :4)。
[0021] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' CTTTGACGACAACATTAGAAAGG-3'
[0022] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -TTGACCCTCTTGAGATTTCACT-3'
[0023] 野生型熒光探針（SEQ ID NO :3) :5' FAM-TTTGACGGTCCATGATGCTATA-BHQ13'
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中的陽性質(zhì)控品為經(jīng)過測序檢驗結(jié)果為 PDS基因2168A > G純合突變型的組織、血液、或細胞系提取的DNA或相應的PCR產(chǎn)物或質(zhì) 粒載體；陰性質(zhì)控品為蒸餾水、純水、生理鹽水或鮭魚精子DNA，也可以為經(jīng)過測序檢驗結(jié) 果為PDS基因2168A > G野生型的組織、血液、或細胞系提取的DNA或相應的PCR產(chǎn)物或相 應的質(zhì)粒載體；
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中待檢測靶核酸樣品來自從各種途徑獲 取的被檢測者的血液、唾液、羊水細胞或其它人體組織等等。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中的DNA提取液主要包含Chelex-100。 也可以使用其它試劑盒或方法提取的DNA作為進行熒光PCR的模板。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中用于判定檢測方法有效性的標準是： 每次檢測都使用PCR反應液分別檢測陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，對于陽性質(zhì)控品，依據(jù)突 變型探針產(chǎn)生的顏色熒光曲線作為陽性質(zhì)量控制標準，陽性質(zhì)控品的Ct值應小于30。對 于以經(jīng)過測序檢驗結(jié)果為PDS基因2168A > G位點野生純合型的組織、血液、或細胞系提取 的DNA或相應的PCR產(chǎn)物或相應的質(zhì)粒載體陰性質(zhì)控品，依據(jù)野生型探針產(chǎn)生的顏色熒光 曲線作為陰性質(zhì)量控制標準，陰性質(zhì)控品的Ct值應小于30 ;對于以蒸餾水、純水、生理鹽水 或鮭魚精子DNA的陰性質(zhì)控品，野生型和突變型探針產(chǎn)生的顏色熒光曲線的Ct值均應大于 35。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以根據(jù)所擴增序列的特殊情況，在試劑盒的 PCR緩沖液中加入甲酰胺或二甲基亞砜等PCR反應添加劑減少高GC含量或二級結(jié)構(gòu)對PCR 反應的影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光 強度，'S'型曲線是突變型探針顏色熒光曲線，野生型探針顏色熒光曲線無擴增。
[0030] 圖2顯示陰性質(zhì)控品的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光強度， 'S'型曲線是野生型探針顏色熒光曲線，突變型探針顏色熒光曲線無擴增。該陰性質(zhì)控品為 經(jīng)過測序檢驗結(jié)果為PDS基因2168位點突變純合型的質(zhì)粒載體。
[0031] 圖3顯示陰性質(zhì)控品的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光強度， 野生型與突變型探針顏色熒光曲線Ct值均無擴增。該陰性質(zhì)控品為鮭魚精子DNA。
[0032] 圖4顯示試劑盒檢測PDS基因2168A > G純合突變型人外周血組織標本的擴增曲 線。結(jié)果同圖1。
[0033] 圖5顯示試劑盒檢測PDS基因2168A > G野生型人外周血組織標本的擴增曲線。 結(jié)果同圖2。
[0034] 圖6顯示試劑盒檢測PDS基因2168A > G雜合型人外周血組織標本的擴增曲線。 橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光強度，兩條'S'型曲線分別表示野生型與突變型探 針顏色熒光曲線，可見2條曲線的Ct值接近。
[0035] 圖7顯示DNA提取失敗的人外周血組織的擴增曲線，結(jié)果同圖3。野生型及突變型 探針顏色熒光曲線均無擴增，說明DNA提取失敗。

【具體實施方式】
[0036] 下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0037] 實施例1 :PDS基因2168A/G突變檢測試劑盒及其使用
[0038] 試劑盒的組成
[0039] PCR反應液1管（500ul)、陽性質(zhì)控品1管（20ul)，陰性質(zhì)控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，紅細胞裂解液1瓶（15ml)。
[0040] PCR反應液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID N0:1)、0. 2uM 反向引物（SEQ ID N0:2)、0. 2uM 野生型熒光探針（SEQ ID N0:3)，0. 2uM 突變型熒光探針（SEQ ID NO :4)。
[0041] 操作步驟：
[0042] 1)基因提?。喝OOul EDTA抗凝外周血，加入600ul紅細胞裂解液，室溫放置 5-10分鐘，期間混勻數(shù)次，5000rpm離心5分鐘，棄上清，然后加入DNA裂解液100ul，混勻， 99度10分鐘，離心，取上清作為DNA摸板進行后續(xù)工作。也可以使用商業(yè)化的DNA提取試 劑盒進行基因提取，提取過程按照相應的試劑盒說明進行。
[0043] 2)PCR檢測：取PCR反應液23ul置入PCR管中，加入2ul樣品DNA，混勻后置于熒 光定量PCR儀中。
[0044] 陽性質(zhì)控：分別取陽性質(zhì)控品2ul加入PCR反應液中，余同樣品操作。
[0045] 陰性質(zhì)控：分別取陰性質(zhì)控品2ul加入PCR反應液中，余同樣品操作。
[0046] PCR 擴增參數(shù)：50°C 2min，95°C 2min，然后進行 40 個循環(huán)：95°C 30sec -61°C 20sec，反應結(jié)束后將結(jié)果保存待進一步分析。
[0047] 3)結(jié)果分析：依據(jù)陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品熒光顏色曲線對樣本進行分析。如果 存在2條不同顏色的熒光曲線，則樣本為雜合型。
[0048] 實施例2 :PDS基因2168A/G突變檢測試劑盒及其使用
[0049] 試劑盒的組成
[0050] PCR反應液1管（500ul)、陽性質(zhì)控品1管（20ul)，陰性質(zhì)控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，紅細胞裂解液1瓶（15ml)。
[0051] PCR反應液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID NO :1)、0· 2uM 反向引物（SEQ ID NO :2)、0· 2uM 突變型熒光探針（SEQ ID NO :4)。
[0052] 操作步驟同實施例1。
[0053] 結(jié)果分析：依據(jù)陽性質(zhì)控品熒光顏色曲線對樣本進行分析。如果存在與陽性質(zhì)控 品熒光顏色相同的曲線，則樣本存在PDS基因2168A/G突變，不能區(qū)分雜合還是純合突變。 如果不存在熒光曲線，則樣本判定為野生型。
[0001] 序列表 <110〉王寶恒 <120〉熒光PCR技術(shù)檢測PDS基因 2168A〉G突變的方法及其試劑盒 <130> 0 <160> 5 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221> primer-bind <222> (1)..(23) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，用以作PCR擴增的引物 <400> 1 ctttgacgac aacattagaa agg 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> primer-bind <222> (1),. (22) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，用以作PCR擴增的引物 <400> 2 ttgaccctct tgagatttca ct 22 <210> 3 <211〉 22 <212> DNA
[0002] <213〉人工序列 <220> <221> probe-bind <222> (1)_. (22) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，用以作PCR擴增的探針 <400> 3 tttgacggtc catgatgcta ta 22 <210> 4 <211〉 22 <212〉 DNA <213>人丄序列 <220〉 <221> probe-bind <222〉 (1).. (22) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，用以作PCR擴增的探針 <400> 4 tttgacggtc cgtgatgcta ta 22 <210> 5 <211> 128 <212> DNA <213〉智人(Homo Sapiens) <220〉 <221> gene <222〉 (1).. (128) <223〉人PDS基因外顯子7至8之間的核酸序列 <400> 5 attatgtgat agaaaagctg gagcaatgcg ggttctttga cgacaacatt agaaaggaca 60 cattcttttt gacggtccat gatgctatac tctatctaca gaaccaagtg aaatctcaag 120 agggtcaa
【權(quán)利要求】
1. 一種采用實時熒光聚合酶鏈反應技術(shù)（FQ-PCR)檢測PDS基因2168A > G突變的方 法，其特征在于以PDS基因第19外顯子位點（2168A>G)設(shè)計特異性野生型探針及突變型 探針，野生型及突變型探針分別被標記上不同顏色的熒光，同時在PDS基因2168A > G堿基 兩側(cè)設(shè)計特異性擴增引物，對于檢測樣本，依據(jù)野生型與突變型探針在PCR擴增中產(chǎn)生的 熒光顏色不同來判斷樣本是否存在突變。
2. -種用實時熒光PCR方法檢測PDS基因2168A > G突變的試劑盒，其特征在于試劑 盒主要包括：PCR反應液，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PDS基因2168A > G堿基上 游設(shè)計正向擴增引物，在下游設(shè)計反向擴增引物，其長度均為10_30bp之間的核苷酸序列， 能夠擴增出含有PDS基因2168A > G區(qū)域的長度為50-700bp的核苷酸片段，優(yōu)選地，正向 引物（SEQ ID N0:1)及反向引物（SEQ ID N0:2)為能擴增出含有PDS基因第19外顯子位 點（2168A > G)區(qū)域60-150bp片段的特異性核苷酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PDS基因2168A > G區(qū)域設(shè) 計野生型探針及突變型探針，其長度均為10_30bp之間的核苷酸序列。兩種探針均覆蓋ros 基因2168區(qū)域，其中野生型探針（SEQ ID NO :3)針對PDS基因2168A > G野生型位點，突 變型探針（SEQ ID NO :4)針對PDS基因2168A > G突變位點。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PCR反應液中包含熒光 檢測物質(zhì)。熒光檢測物質(zhì)為熒光探針，其中探針5'端標記熒光發(fā)生基團，3'端標記熒光淬 滅基團。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述的方法和試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括下列內(nèi) 容：PCR反應液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向型引物、反向型引物、 野生型熒光探針、突變型熒光探針。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及權(quán)利6所述的試劑盒，其特征在于待檢測靶核酸樣 品來自被檢測者的血液、唾液、羊水細胞或其它人體組織；陽性質(zhì)控品為經(jīng)過測序檢驗結(jié)果 為PDS基因2168A > G純合突變型的組織、血液、或細胞系提取的DNA或含有相應序列的 PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒載體；陰性質(zhì)控品為蒸餾水、純水、生理鹽水、鮭魚精子DNA ;陰性質(zhì)控品也 可以為經(jīng)過測序檢驗結(jié)果為PDS基因2168A > G野生型的組織、血液、或細胞系提取的DNA 或含有相應序列的PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒載體。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120166SQ201310142789
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】王寶恒, 史桂芝 申請人:王寶恒