專利名稱：基于新型懸浮芯片技術(shù)的13種呼吸道病毒高通量非診斷性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于新型懸浮芯片技術(shù)的13種呼吸道病毒高通量非診斷性檢測方法。
背景技術(shù)：
SARS、H1N1甲型流感、新型冠狀病毒感染和人感染H7N9禽流感疫情的相繼爆發(fā)與流行，呼吸道感染的流行及造成的危害一直是公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)。引起人類呼吸道感染的病毒種類繁多，目前至少包括7個(gè)科30余種病毒及其亞型。由于一種(型)病毒可引起多種臨床癥狀，同一臨床癥狀又可由多種(型)病毒所引起，傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法不能快速準(zhǔn)確地確定病原體。病原體的快速準(zhǔn)確檢出是及時(shí)、準(zhǔn)確預(yù)測、預(yù)報(bào)和預(yù)警的關(guān)鍵。當(dāng)傳染源得到及時(shí)隔離、并切斷傳播途徑時(shí)，就避免了呼吸道感染在人群中的擴(kuò)散，進(jìn)一步縮小疫情范圍甚至預(yù)防疫情的出現(xiàn)。因此，建立對多種呼吸道病毒快速篩查方法，對快速查明呼吸道傳染病疫情的病原體具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)快速檢測十三種/型呼吸道病毒及其亞型的模型，為及時(shí)應(yīng)對呼吸道感染疫情提供重要信息的基于新型懸浮芯片技術(shù)的13種/型呼吸道病毒高通量非診斷性檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明基于新型懸浮芯片技術(shù)的13種/型呼吸道病毒高通量非診斷性檢測方法，具體為:1)根據(jù)解鏈溫度、擴(kuò)增片段大小、病毒種類，將13種呼吸道病毒及其亞型分為四組:第 I 組包括 PIV3、SARS, Inf B、RSVA,第 2 組包括 Inf A、NL63，第 3 組包括 AdB, hMPV、HRV, H 4 組包括 RSVB、AdE、PIVUEnV ；2)多重PCR引物、探針設(shè)計(jì)，上下游引物上分別標(biāo)記有X-TAG和熒光素；3 )進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR產(chǎn)物TSPE延伸；4)將PCR產(chǎn)物結(jié)合物分別與相應(yīng)的編碼微球雜交；5)磁性編碼微球上分別偶聯(lián)有ant1-TAG，編碼微球上的Ant1-Tag在一定的條件下特異性捕獲PCR產(chǎn)物上的Tag序列；6)加入鏈霉親和素一藻紅蛋白，與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，利用懸浮芯片LUMINAX系統(tǒng)進(jìn)行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應(yīng)結(jié)合上的藻紅蛋白，對待檢測物進(jìn)行定性和定量分析；7)多重檢測體系的建立及結(jié)果判讀:以組為單位，混合編碼微球，組成多重檢測體系；Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI值，以對待檢測物進(jìn)行定性分析；其中，所涉及的引物探針序列為:
權(quán)利要求
1.基于新型懸浮芯片技術(shù)的13種/型呼吸道病毒高通量非診斷性檢測方法，其特征在于，該非診斷性檢測方法具體為: 1)根據(jù)解鏈溫度、擴(kuò)增片段大小、病毒種類，將13種呼吸道病毒及其亞型分為四組:第I 組包括 PIV3、SARS, Inf B、RSVA,第 2 組包括 Inf A、NL63，第 3 組包括 AdB, hMPV、HRV，第4組包括 RSVB、AdE、PIVUEnV ； 2)多重PCR引物、探針設(shè)計(jì)與標(biāo)記，上下游引物上分別標(biāo)記有X-TAG和熒光素； 3)進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR產(chǎn)物TSPE延伸； 4)將PCR產(chǎn)物結(jié)合物分別與相應(yīng)的編碼微球雜交； 5)磁性編碼微球上分別偶聯(lián)有ant1-TAG，編碼微球上的Ant1-Tag在一定的條件下特異性捕獲PCR產(chǎn)物上的Tag序列； 6)加入鏈霉親和素一藻紅蛋白，與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，利用懸浮芯片LUMINAX系統(tǒng)進(jìn)行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應(yīng)結(jié)合上的藻紅蛋白，對待檢測物進(jìn)行定性和定量分析； 7)多重檢測體系的建立及結(jié)果判讀:以組為單位，混合編碼微球，組成多重檢測體系；Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI值，以對待檢測物進(jìn)行分析。 其中，所涉及的引物探針序列為:
2.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，選擇AdB和AdE的Hexon基因、Cov-229E、Cov-NL63、SARS-Cov 的 nucleocapsid 基因、EnV 和 HRV 的 5’ NCR 基因、hMPV的 L-polymerase 基因、InfA 和 InfB 的 matrix 基因、RSVA 和 RSVB 的 fusion 基因、PIV 的hemagglutinin-neuraminidase基因，通過引物設(shè)計(jì)軟件分析各引物Tm值以及各引物間二聚體的形成，確定所述引物序列。
3.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述步驟3)中進(jìn)行核酸外切酶處理PCR產(chǎn)物，其過程為:7.5 ill的各組PCR產(chǎn)物分別加入3.0 ill的Exo置于PCR儀器中 37°C,30min,80°C, 15min0
4.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述雜交過程為: I)將Iml包裝中的編碼微球震蕩20s，超聲20s，直至編碼微球分散；.2)每種編碼微球各取10ill至200 ill EP管，8000rmp3min，小心吸出上清，留10 yl于管內(nèi)； . 3)編碼微球重懸于35ill I X Tm雜交液中； .4)加5ill TSPE產(chǎn)物，輕輕吹打混勻； . 5)96°C,90s,37°C,30min ； . 6)向抽濾板各孔加100ill I X Tm雜交液，預(yù)潤； .7)現(xiàn)制一定濃度的SAPE溶液，避光保存； .8)配制洗脫所需的IXTm雜交液，至于37°C放置； .9 )第5 )步完成后，輕輕抽濾第6 )步中的I X Tm雜交液，不可全部抽濾完，將第5 )步的產(chǎn)物全部移至抽濾板相應(yīng)孔中，輕輕抽濾； .10)各孔加入100ii IlXTm雜交液,輕輕抽濾；此步重復(fù)I次； .11)每孔加入75u I 一定濃度的SAPE溶液，輕輕吹打混勻； . 12)37°C，避光孵育 15min-20min ； .13)用液相芯片系統(tǒng)讀取各孔熒光值。
5.如權(quán)利要求1所述的非 診斷性檢測方法，其特征在于，所述編碼微球?yàn)榘挥衋nt1-TAG的編碼微球。
6.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述TSPE的反應(yīng)條件為:.960C，IOmin ；94°C 90s, 55°C 90s, 74°C 2min，40 個(gè)循環(huán)。
7.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述非診斷性檢測方法采用的儀器和試劑為:懸浮芯片系統(tǒng)Bio-PlexlOO或200，Bio-Rad ;編碼微球；ExoSAP_IT試劑盒；Platinum Tsp DNA polymerase, ASPEIOXBuffer, 50mM MgCl2, dNTPs, Biotin-14-dCTPInvitrogen ；Triton X-100。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于新型懸浮芯片技術(shù)的13種呼吸道病毒高通量非診斷性檢測方法，針對流感病毒A、B型，副流感病毒1、3型，冠狀病毒SARS-CoV、CoV-NL63、呼吸道合胞病毒A、B型，腺病毒B、E型，鼻病毒、人偏肺病毒、腸道病毒共十三種/型呼吸道病毒的特異性基因序列設(shè)計(jì)13對引物和相應(yīng)的特異性探針，經(jīng)多重PCR擴(kuò)增及TSPE反應(yīng)，X-TAG核酸片段、生物素分別標(biāo)記相應(yīng)基因片段，標(biāo)記的片段與相應(yīng)編碼微球結(jié)合，懸浮芯片掃描儀檢測。能正確檢測13種呼吸道病毒及其亞型，各探針間無交叉反應(yīng)，特異性好、靈敏度高。建立了高通量、快速、準(zhǔn)確的可同時(shí)檢測多種呼吸道病原的技術(shù)平臺，為突發(fā)呼吸道傳染病的病原體檢測提供技術(shù)儲備，有利于為應(yīng)對傳染病疫情爆發(fā)及時(shí)提供信息。
文檔編號C12Q1/68GK103205509SQ201310143230
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者王靜, 楊宇, 張建明, 楊永莉, 王旺, 高博, 劉健 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院