專利名稱：用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術領域，涉及一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉。
背景技術：
隨著我國石油石化工業(yè)的飛速發(fā)展，脆弱的生態(tài)環(huán)境也面臨著越來越嚴峻的考驗。其中，石油烴污染物往往通過意外泄露等多種途徑進入土壤和水體等環(huán)境，造成環(huán)境污染。特別是石油烴污染物中大量的多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)難以自然降解，對環(huán)境造成了持續(xù)性地嚴重威脅。并且由于其具有致癌致畸致突變的“三致”效應，嚴重威脅人體健康和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定，被多個國家列入優(yōu)先控制污染物黑名單。采用生物治理，特別是真菌降解石油污染物中的多環(huán)芳烴是控制乃至消除環(huán)境中多環(huán)芳烴污染的有效措施，因而受到了國內外研究人員的廣泛重視，一系列專利被我國和國際的相關組織機構授權。例如:中國專利(200810228377.7)公開了一種由毛霉、小克銀漢、鐮刀菌和產黃青霉等組成的用于多環(huán)芳烴污染土壤修復的微生物菌劑；中國專利(200910234389.5)公開了一種采用摩西球囊霉等叢枝菌根修復多環(huán)芳烴污染土壤的方法；美國專利(US20040023362A1)公開了一種米用微紫青霉菌penicillium janthinellum等降解多環(huán)芳烴的方法；美國專利(7118906B2)公開了一種采用淺黃囊孔菌Flavodonflavus治理多環(huán)芳烴污染廢水的方法。多環(huán)芳烴降解真菌的分離主要遵循傳統(tǒng)的富集培養(yǎng)-平板涂布分離方法。但是，多環(huán)芳烴降解真菌培養(yǎng)基的傳統(tǒng)制備流程相當復雜、耗時較長，并且由于要保證多環(huán)芳烴顆粒的分布均勻，操作過程需要大量劇毒的有機溶劑，既增加了試劑成本又對環(huán)境造成污染。同時，由于缺乏細菌生長抑制劑，常造成雜菌生長過于旺盛，以至于目標多環(huán)芳烴降解真菌的分離效率低、分離效果較差。這些缺陷嚴重限制了多環(huán)芳烴降解真菌的分離乃至進一步的石油污染環(huán)境治理 進程。如何創(chuàng)新多環(huán)芳烴降解真菌的培養(yǎng)基的制備流程，成為亟待解決的關鍵任務。采用速溶預混干粉制備技術是解決這一問題的有效策略。例如:中國專利(200710121709.7)公開了一種用于動物細胞培養(yǎng)的干粉混合物及其制備方法；中國專利(200610078090.1)公開了一種用于植物育種、組織培養(yǎng)和分子生物學研究的干粉式培養(yǎng)基及其制備方法；美國專利(US20120276630A1)公開了一種用于細胞培養(yǎng)的干粉培養(yǎng)基。但是，國內外至今仍沒有針對多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉制備的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術存在的針對目前多環(huán)芳烴降解真菌分離培養(yǎng)速度慢、分離效果差等問題，提供一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉。本發(fā)明的技術方案概述如下:一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，按重量比為0.1 0.5:0.01 0.05:2 5:10 30的比例由超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂組成。所述超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂的質量比優(yōu)選為
0.2:0.03:4:20。所述超微多環(huán)芳烴顆粒為顆粒直徑低于150 μ m的質量比為1:0.01 10的菲和
花組成。所述菲和花的質量比優(yōu)選為1:0.1。所述細菌生長抑制劑優(yōu)選為孟加拉紅或利福平。所述可溶性無機鹽由質量比為0.5 2:0.5 2:0.5 2:0.5 2:0.1
0.5:0.01 0.05:0.02 0.1 的 K2HPO4、KH2PO4、NH4NO3、NaCl、MgSO4、CaCl2 和 FeCl3 組成。所述K2HPO4' KH2PO4' NH4NO3' NaCl、MgSO4' CaCl2 和 FeCl3 的質量比優(yōu)選為1: 1: 1: 1:0.2:0.02:0.05。本發(fā)明具有以下優(yōu)點:①使用簡便，耗時極短；②無需使用有機溶劑溶解多環(huán)芳烴，大幅降低對實驗人員和環(huán)境的毒害；③雜菌生長少、 分離效率高、分離效果好。
具體實施例方式以下通過具體實施例闡述本發(fā)明，目的在于使本領域的技術人員能更好地理解本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。實施例1一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，按重量比為0.2:0.03:4:20的比例由超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂組成。超微多環(huán)芳烴顆粒為顆粒直徑低于150μπι的質量比為1:0.1的菲和芘組成。細菌生長抑制劑為孟加拉紅?？扇苄詿o機鹽由質量比為1:1:1:1: 0.2:0.02:0.05 的 K2HPO4、KH2PO4、NH4NO3、NaC1、MgSO4' CaCl2 和 FeCl3 組成。實施例2一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，按重量比為0.1:0.05:3:10由超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂組成。超微多環(huán)芳烴顆粒為顆粒直徑低于150μπι的質量比為1:0.01的菲和芘組成。細菌生長抑制劑為孟加拉紅?？扇苄詿o機鹽由質量比為0.5:2:1:0.5:0.5:0.03:0.02 的 K2HPO4、KH2PO4、NH4NO3、NaCl、MgSO4、CaCl2 和 FeCl3 組成。實施例3一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，按重量比為0.3:0.01:5:20由超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂組成。超微多環(huán)芳烴顆粒為顆粒直徑低于150 μ m的質量比為1:1的菲和芘組成。細菌生長抑制劑為孟加拉紅。
可溶性無機鹽由質量比為1:0.5:2:1:0.1:0.05:0.08 的 K2HPO4' KH2PO4' NH4NO3'NaCl、MgSO4、CaCl2 和 FeCl3 組成。實施例4一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，按重量比為0.5:0.03:2:30由超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂組成。超微多環(huán)芳烴顆粒為顆粒直徑低于150 μ m的質量比為1:10的菲和芘組成。細菌生長抑制劑為利福平?？扇苄詿o機鹽由質量比為2:1:0.5:2:0.3:0.01:0.1 的 K2HPO4' KH2PO4' NH4NO3'NaCl、MgSO4、CaCl2 和 FeCl3 組成。實施例5一種用于分離多環(huán)芳烴 降解真菌的速溶預混干粉的制備:按實施例1、2、3或4的比例，將多環(huán)芳烴菲和芘顆粒研磨至顆粒直徑低于150 μ m,混合，得到混合的超微多環(huán)芳烴顆粒；將K2HP04、KH2PO4, NH4NO3> NaCUMgSO4, CaCl2 和 FeCl3 按照實施例 1、2、3 或 4 的比
例混合，得到混合可溶性無機鹽；將超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂按比例混合，分別得到一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉。本發(fā)明以環(huán)境微生物學為理論依據，綜合環(huán)境科學的相關理論知識，針對多環(huán)芳烴降解真菌培養(yǎng)基的制備問題，在傳統(tǒng)培養(yǎng)基的基礎上，補加超微多環(huán)芳烴顆粒和細菌生長抑制劑，并采用機械研磨方式制備速溶預混干粉。實施例6稱取實施例1的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉2.5g，添加IOOml蒸餾水，充分混合后，121°C高溫滅菌20分鐘，制備固體平板。共耗費1.3小時，比傳統(tǒng)方法時間減少44.3%，效率提高79.4%。采用梯度稀釋法將石油污染土壤樣品1#涂布至固體平板上，28°C恒溫培養(yǎng)7天。共得到7個多環(huán)芳烴降解真菌菌落，經鑒定均為毛霉。多環(huán)芳烴降解真菌占總菌落數的17.4%，比傳統(tǒng)方法高15.1%。實施例7稱取實施例2的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉30g，添加IOOOml蒸餾水，充分混合后，121°C高溫滅菌20分鐘，制備固體平板。共耗費1.4小時，比傳統(tǒng)方法時間減少47.5%，效率提高90.5%。采用梯度稀釋法將石油污染土壤樣品2#涂布至固體平板上，28°C恒溫培養(yǎng)10天。共得到38個多環(huán)芳烴降解真菌菌落，經鑒定為毛霉和青霉。多環(huán)芳烴降解真菌占總菌落數的26.6%，比傳統(tǒng)方法高26.0%。實施例8稱取實施例3的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉50g，添加2000ml蒸餾水，充分混合后，121°C高溫滅菌20分鐘，制備固體平板。共耗費1.3小時，比傳統(tǒng)方法時間減少51.9%，效率提高107.7%。采用梯度稀釋法將石油污染土壤樣品3#涂布至固體平板上，28°C恒溫培養(yǎng)10天。共得到19個多環(huán)芳烴降解真菌菌落。多環(huán)芳烴降解真菌占總菌落數的28.8%，比傳統(tǒng)方法高26.3%。實施例9
稱取實施例4的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉60g，添加2000ml蒸餾水，充分混合后，121°C高溫滅菌20分鐘，制備固體平板。共耗費1.4小時，比傳統(tǒng)方法時間減少53.3%，效率提高114.3%。采用梯度稀釋法將石油污染土壤樣品4#涂布至固體平板上，28°C恒溫培養(yǎng)10天。共得到28個多環(huán)芳烴降解真菌菌落。多環(huán)芳烴降解真菌占總菌落數的44.1%，比 傳統(tǒng)方法高38.9%。
權利要求
1.一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，其特征是按重量比為0.1 0.5:0.0l 0.05:2 5:10 30的比例由超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂組成。
2.根據權利要求1所述的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，其特征是所述超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂的質量比為0.2:0.03:4:20。
3.根據權利要求1或2所述的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，其特征是所述超微多環(huán)芳烴顆粒為顆粒直徑低于150 μ m的質量比為1:0.01 10的菲和芘組成。
4.根據權利要求3所述的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，其特征是所述菲和芘的質量比為1:0.1。
5.根據權利要求1或2所述的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，其特征是所述細菌生長抑制劑為孟加拉紅或利福平。
6.根據權利要求1或2所述的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，其特征是所述可溶性無機鹽由質量比為0.5 2:0.5 2:0.5 2:0.5 2:0.1 0.5:0.01 0.05:0.02 0.1 的 K2HPO4'KH2PO4'NH4NO3'NaCl、MgS04、CaCl2 和 FeCl3 組成。
7.根據權利要求6所述的一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，其特征是所述K2HP04、KH2P04、NH 4N03、NaCl ,MgSO4XaCl2 和 FeCl3 的質量比為 1:1:1:1: 0.2:0.02:0.05。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于分離多環(huán)芳烴降解真菌的速溶預混干粉，按重量比為0.1～0.5:0.01～0.05:2～5:10～30的比例由超微多環(huán)芳烴顆粒、細菌生長抑制劑、可溶性無機鹽和瓊脂組成。本發(fā)明具有使用簡便，耗時極短；無需使用有機溶劑溶解多環(huán)芳烴，大幅降低對實驗人員和環(huán)境的毒害；雜菌生長少、分離效率高、分離效果好。
文檔編號C12N1/14GK103232943SQ201310143989
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權日2013年4月23日
發(fā)明者王新新, 吳亮, 楊勇, 安偉, 牛志剛, 丁東華 申請人:中國海洋石油總公司, 中海油能源發(fā)展股份有限公司, 中海石油環(huán)保服務(天津)有限公司