專利名稱：一種利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域，具體涉及一種利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸的方法。
背景技術(shù)：
丁二酸，又名丁二酸，是一種常見的天然有機酸，作為重要的C4平臺化合物，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、香料、洗滌劑、精細化工產(chǎn)品、表面活性劑生物可降解材料等方面。丁二酸傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是以石油為原料用化學法進行煉制合成。目前，國內(nèi)外主要使用的是催化加氫法。而隨著石油資源日益枯竭，微 生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸以其環(huán)境友好性、可利用廢棄的生物質(zhì)資源、能夠固定溫室氣體CO2等優(yōu)點，成為研究的熱門課題。中國申請201110352084.1公開了一種利用蔗渣發(fā)酵制備丁二酸的方法，包括丁二酸生產(chǎn)菌的菌種活化、種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)丁二酸的步驟，發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)丁二酸的步驟如下:(1)超聲處理蔗渣，使其中糖分處于更有利水解的狀態(tài):將蔗渣與稀硫酸按照質(zhì)量體積比(w/v) 15 20%混合，超聲的時間為20 60min，超聲溫度為15 25°C，超聲頻率為80-150赫茲；(2)用稀酸水解方法制備多組分糖液:將步驟(I)得到的料液加熱至溫度120 130°C，水解150 180min后經(jīng)抽濾得到水解液，調(diào)節(jié)pH至6.0,115°C滅菌15min后作為碳源備用；(3)將備用碳源直接添加至不含碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入種子培養(yǎng)后得到的種子液；(4)向步驟(3)的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氮源:氮源的用量為原氮源需要量的O 80% ; (5)將丁二酸生產(chǎn)菌的種子培養(yǎng)液直接接種至步驟(4)的培養(yǎng)基中，發(fā)酵制備丁二酸。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能夠利用廣泛的碳源，包括葡萄糖、果糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、乳清等，目前文獻報道的發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸研究用培養(yǎng)基原料多為葡萄糖，很少有野生菌利用蔗糖的報道。蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物，是一種非還原性二糖，廣泛分布于植物體內(nèi)，特別是甜菜、甘蔗和水果中含量極高，而且蔗糖具有維持滲透壓的作用，能夠保護菌體，工業(yè)上被用來生產(chǎn)檸檬酸、乳酸、甘油等。利用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，以蔗糖作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，生產(chǎn)速率較利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)速率高。蔗糖濃度過高時也會對發(fā)酵過程產(chǎn)生抑制作用，因此，采用一種合適的補糖方法，提高蔗糖的利用率對于丁二酸生產(chǎn)有重大意義。中國專利ZL200610085415.9公開了一種產(chǎn)丁二酸的菌株及其篩選方法和應用，其中利用葡萄糖作為碳源，消耗93 g/L葡萄糖，45 h生產(chǎn)45g/L 丁二酸，其產(chǎn)率有待進一步提聞。此外，現(xiàn)有技術(shù)未見以蔗糖為碳源發(fā)酵制備丁二酸的技術(shù)方案。有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于高效利用蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸的方法，所述方法包括如下步驟:
(I)斜面培養(yǎng):將凍存菌種融化并在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在溫度為30 40°C的厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 72 h，活化好的單菌落用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存；
(2)種子培養(yǎng):向100mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基30 60 mL，115 121 °C滅菌15 25 min，冷卻后接入斜面培養(yǎng)菌株，通入C02 I 3 min，30 40 °C培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100 200 r/min，培養(yǎng)時間為10 16 h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；
(3)血清瓶培養(yǎng):100mL血清瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基20 50 mL，加入堿性中和劑，115 121°C滅菌15 25 min,冷卻后接入種子培養(yǎng)液,通入CO2 I 3min保證厭氧環(huán)境，接種完成后，培養(yǎng)溫度為30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速100 200 r/min，培養(yǎng)時間為24 72 h ；
(4)3L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):3L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為1.5 2 L，接種量為5 10%(v/v)，溫度為30 40 °C，發(fā)酵罐中持續(xù)通入CO2以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速100 300 rpm,發(fā)酵過程分別采用堿性中和劑控制pH在6.6 7.0,發(fā)酵時間為24 72h，即得。本發(fā)明所述的發(fā)酵微生物菌種制備丁二酸的方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中任意的厭氧發(fā)酵制備方法，包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸三步驟。作為優(yōu)選地:
其中，所述斜面培養(yǎng)基以IL計，含有:葡萄糖10g，酵提取物5g，玉米漿5g，NaHCO310g, NaH2PO4.2H20 9.6g, K2HPO4.3H20 15.5g,瓊脂 20g。所述種子培養(yǎng)基以IL計，含有:葡萄糖10 g，酵提取物5g，NaH2PO4.2Η20
9.6g, K2HPO4.3H20 15.5g, NaHCO3 10g，玉米漿 5g, pH 7.0。所述發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計，含有:糖類10 100 g，乙酸鈉1.36g，NaCl lg, CaCl20.2g, MgCl2 0.2g, Na2HPO4 0.31 g，NaH2PO4 1.6g，K2HP04g，酵母提取物 15g。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，糖類 可以選擇現(xiàn)有技術(shù)公開的多種技術(shù)方案，均在一定程度上可以實現(xiàn)丁二酸的發(fā)酵，但考慮到生產(chǎn)成本以及丁二酸的收率等，應當對糖類作進一步的研究與開發(fā)。本領域技術(shù)人員知道，廉價碳源如糖蜜等含有大量蔗糖，是蔗糖和葡萄糖的混合物，由于其來源廣泛，成本低廉，因此有必要研究蔗糖-葡萄糖的混合糖發(fā)酵。高糖濃度時，在總糖濃度不變的情況下，以蔗糖-葡萄糖混合糖代替部分純蔗糖發(fā)酵，糖抑制現(xiàn)象會得到緩解，同時蔗糖-葡萄糖的比例會影響到丁二酸的生產(chǎn)。本發(fā)明優(yōu)選利用蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖發(fā)酵制備丁二酸，利用蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖產(chǎn)丁二酸的高收率、高生產(chǎn)速率，并通過優(yōu)化調(diào)控方式進一步提高丁二酸的收率和生產(chǎn)速率。與利用葡萄糖生產(chǎn)丁二酸相比較，利用純蔗糖發(fā)酵時，單批發(fā)酵利用蔗糖速度快，丁二酸收率高、生產(chǎn)速率快，而利用補料單批發(fā)酵方式，能夠進一步縮短發(fā)酵時間，提高丁二酸生產(chǎn)速率；利用蔗糖-葡萄糖混合糖發(fā)酵時，在蔗糖-葡萄糖最佳比例范圍內(nèi)，先添加蔗糖作為碳源，待蔗糖耗至一定濃度時，添加蔗糖-葡萄糖的混合物，能夠很好的減低糖抑制作用。作為本發(fā)明最理想的技術(shù)方案，優(yōu)選所述糖類為蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖，具體在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，先加入蔗糖使其濃度為50g/L，當蔗糖濃度低于10g/L，添加蔗糖-葡萄糖混合糖至糖濃度為10g/L-40g/L，所述混合糖中二者的用量比為4:1。此外，本發(fā)明所述糖類也可以僅為濃度為50_100g/L的蔗糖，不加入蔗糖-葡萄糖混合糖。本發(fā)明所述菌株優(yōu)選為產(chǎn)琥拍酸放線桿菌tinobacillus succinogenesNJ113)。該菌已申請專利并獲得授權(quán)，專利授權(quán)公告號為CN100537744C。其中，所述步驟3中堿性中和劑為CaC03、Mg (OH) 2和/或堿式MgCO3,優(yōu)選Mg (OH)20堿性中和劑與蔗糖比例為0.6:1 1.2:1。其中，所述步驟4中堿性中和劑為氨水、NaOH、Na2CO3^ NaHC03、CaCO3> Mg(OH)2和/或 MgCO3.Mg (OH)2,優(yōu)選 Mg (OH) 2。具體地，本發(fā)明的技術(shù)目的通過下面的技術(shù)方案實現(xiàn):
利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸，包括斜面培養(yǎng)(即菌種活化)、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸三步驟，其特征在于在厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的步驟中利用碳源為蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖。本發(fā)明包括菌種活化、種子培養(yǎng)與發(fā)酵罐培養(yǎng)等步驟，可以采用與傳統(tǒng)方法基本相同的步驟，其主要區(qū)別是發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟中所采用的碳源為純蔗糖或者蔗糖與蔗糖-葡萄糖混合糖共用。本發(fā)明所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物為從特征厭氧環(huán)境中篩選出的丁二酸生產(chǎn)菌株產(chǎn)玻拍酸放線桿菌succinogenes NJ113 (CGMCC N0.1716)。此外，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明的有益效果在于:以蔗糖為碳源，所得丁二酸收率和生產(chǎn)速率均比利用葡萄糖發(fā)酵結(jié)果高，蔗糖濃度為100 g/L時，在血清瓶中厭氧培養(yǎng)能夠產(chǎn)生57.1 g/L 丁二酸，發(fā)酵罐中單批發(fā)酵產(chǎn)生57.5g/L 丁二酸，而采用補料單批發(fā)酵則能夠產(chǎn)生60.5 g/L 丁二酸，說明鹿糖能夠替代葡萄糖，作為產(chǎn)琥拍酸放線桿菌Xe tinobaciIlus succinogenesNJ113 (CGMCC N0.1716)的碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。


圖1為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113利用蔗糖補料分批發(fā)酵結(jié)果示意圖。圖2為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJl 13利用蔗糖-葡萄糖混合糖補料分批發(fā)酵結(jié)果示意圖。圖3為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123利用蔗糖發(fā)酵結(jié)果示意圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1 利用蔗糖作為碳源生產(chǎn)丁二酸，具體方法如下:
本發(fā)明所述的制備丁二酸的方法可以使用現(xiàn)有技術(shù)中任何厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的微生物菌種。本實施例所采用的產(chǎn)丁二酸的微生物菌種為:產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113(Actinobacillus succinogenes NJ113),該菌已申請專利并獲得授權(quán),專利授權(quán)公告號為CN100537744C。本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基可以使用現(xiàn)有技術(shù)中任何厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵培基。
本實施例所采用的斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 (分消)，酵提取物5，玉米漿5，
NaHCO3 10，NaH2PO4.2Η20 9.6, K2HPO4.3Η20 15.5，瓊脂 20。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 (分消)，酵提取物5，NaH2PO4.2H20 9.6,K2HPO4.3H20 15.5，NaHCO3 10，玉米漿 5，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖類10 100 g (分消)，乙酸鈉 1.36,NaCl LCaCl2 0.2,MgCl2 0.2，Na2HPO4 0.31，NaH2PO4 1.6，K2HPO4，酵母提取物 15。本實施的具體步驟為:
(1)菌種活化:將凍存于-80°C冰箱的菌種融化后在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在溫度為37°C的厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)48 h，活化好的單菌落用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存；
(2)種子培養(yǎng):向100mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基50 mL，121 °C滅菌15min，冷卻后接入斜面培養(yǎng)菌株，通入CO2 2 min, 37 °C培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間為12 h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；
(3)血清瓶培養(yǎng):100mL血清瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基30 mL，加入堿性中和劑CaC03、Mg (OH)2、堿式MgCO3等，堿性中和劑與蔗糖比例為1:1，121°C滅菌15min，冷卻后接入種子培養(yǎng)液，通入CO2 2min保證厭氧環(huán)境。接種完成后，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)時間為48h。(4)3L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為1.5 L，接種量為5 % (v/V)，溫度為37 °C，發(fā)酵罐中持續(xù)通入CO2以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速200 rpm，發(fā)酵過程采用20 % (WA)Na2CO3溶液作為堿性中和劑，控制pH在6.8，發(fā)酵時間為24 72 h。分析方法:
丁二酸等酸類代謝產(chǎn)物采用高效液相色譜法分析。采用儀器為德國DIONEXUltiMate3000高效液相色譜儀，檢測器為RI和紫外檢測器。其中，丁二酸，乙酸，甲酸等有機酸的測定使用 Aminex@HPX-87H 離子色譜柱(300 mmX 7.8 mm, 9 μ m ;Bio_Rad ChemicalDivision, Richmond, Calif.), 流動相 5 mM 硫酸；柱溫 55 °C;流速 0.6 ml/min;進樣量 20μ L0有機酸標準溶液(丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka))用重蒸水配制。根據(jù)峰面積與有機酸標準溶液的濃度關(guān)系制作標準曲線。樣品稀釋后檢測，根據(jù)峰面積計算各樣品含量。蔗糖含量的測定采用DNS法，過程如下:發(fā)酵液離心后，5 M H2S04調(diào)節(jié)pH至1.0，90 1:水浴酸解90 min, 10 M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，酸解后的發(fā)酵液稀釋至蔗糖濃度為0_1g/L，采用DNS法測定酸解液中還原糖的濃度，在540 nm處測定吸光值。利用葡萄糖((Tl.0g/L)制作標曲。利用標曲，根據(jù)測定的吸光值計算出還原糖濃度，再換算成蔗糖濃度。丁二酸生產(chǎn)速率定義為丁二酸質(zhì)量濃度(g -L-1)/發(fā)酵培養(yǎng)時間(h) ;丁二酸收率(%)定義為丁二酸質(zhì)量濃度(g.L-1)/消耗的糖濃度(g*L-l)。本實施例選用蔗糖作為碳源用于生物法生產(chǎn)丁二酸。利用4(T120 g/L的蔗糖進行厭氧發(fā)酵，48 h后發(fā)酵液離心取樣，測定有機酸和殘余蔗糖含量，結(jié)果如下:
表I利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)丁二酸結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (O斜面培養(yǎng):將凍存菌種融化并在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在溫度為30 40°C的厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 72 h，活化好的單菌落用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存； (2)種子培養(yǎng):向100mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基30 60 mL，115 121 °C滅菌15 25 min，冷卻后接入斜面培養(yǎng)菌株，通入CO2 I 3 min，30 40°C培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100 200 r/min，培養(yǎng)時間為10 16 h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種； (3)血清瓶培養(yǎng):100mL血清瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基20 50 mL，加入堿性中和劑，115 121°C滅菌15 25 min,冷卻后接入種子培養(yǎng)液,通入CO2 I 3min保證厭氧環(huán)境，接種完成后，培養(yǎng)溫度為30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速100 200 r/min，培養(yǎng)時間為24 72 h ； (4)3L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng):3L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為1.5 2 L，接種量為5 10%(v/v)，溫度為30 40 °C，發(fā)酵罐中持續(xù)通入CO2以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速100 300 rpm,發(fā)酵過程分別采用堿性中和劑控制pH在6.6 7.0,發(fā)酵時間為24 72h0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述斜面培養(yǎng)基以IL計，含有:葡萄糖10g，酵提取物 5g，玉米漿 5g，NaHCO3 10g, NaH2PO4.2H20 9.6g，K2HPO4.3H20 15.5g，瓊脂20g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基以IL計，含有:葡萄糖 10 g,酵提取物 5g，NaH2PO4. 2Η20 9.6g，K2HPO4.3Η20 15.5g, NaHCO3 10g，玉米漿 5g，pH 7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計，含有:糖類 10 100 g,乙酸鈉 1.36g, NaCl lg, CaCl2 0.2g, MgCl2 0.2g, Na2HPO4 0.31g, NaH2PO41.6g，K2HPO4g，酵母提取物 15g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述糖類為蔗糖-葡萄糖混合糖，發(fā)酵培養(yǎng)過程中，先加入蔗糖使其濃度為50 g/L，當蔗糖濃度低于10 g/L，添加蔗糖-葡萄糖混合糖至糖濃度為10 g/L-40 g/L，所述混合糖中二者的總用量比為4:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述糖類為濃度為50-100g/L的蔗糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述菌株為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(ActinobaciIlus succinogenes ) NJl 13。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)中堿性中和劑為氨水、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、CaCO3、Mg (OH) 2 和 / 或 MgCO3.Mg (OH) 2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸三步驟，并創(chuàng)造性地在厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的步驟中利用蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖為碳源。采用本發(fā)明的技術(shù)方案所得丁二酸收率和生產(chǎn)速率均比利用葡萄糖發(fā)酵結(jié)果高，蔗糖濃度為100g/L時，在血清瓶中厭氧培養(yǎng)能夠產(chǎn)生57.1g/L丁二酸，發(fā)酵罐中采用補料單批發(fā)酵則能夠產(chǎn)生60.5g/L丁二酸。蔗糖-葡萄糖混合糖中蔗糖和葡萄糖的最佳比例為4:1，此時丁二酸的濃度和收率達到最大，分別為61.6g/L，85.3%。
文檔編號C12P7/46GK103205468SQ20131014463
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者姜岷, 戴文宇, 奚永蘭, 徐蓉, 張九花, 陳可泉, 張敏 申請人:南京工業(yè)大學