致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性的鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的目的是提供一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性的試劑盒及檢測(cè)方法。試劑盒包含PCR擴(kuò)增所需要的兩對(duì)專一性引物對(duì)和Mix，其中，兩對(duì)引物對(duì)分別為：InDel-F：5'-GTGGGTTCGAGTCCCACTAA-3'，InDel-R：5'-CTCACCCGTTCGCTATGTTT-3'，和RSU-F：5'-ACGGAATTATCGGAAGATTT-3'，RSU-R：5'-AAATCCCTTTTATACTGTAATTTGAT-3'。檢測(cè)過程如下：提取致病疫霉菌株的基因組DNA；利用兩對(duì)專一性引物和試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果；條帶的觀察與條帶模式的命名；線粒體基因型的確定；線粒體異質(zhì)性的判定。該試劑盒可用于國(guó)家動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)外來(lái)致病疫霉和農(nóng)業(yè)部門對(duì)不同區(qū)域致病疫霉群體的監(jiān)測(cè)，也可用于各大種薯生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于基地致病疫霉特征確定和動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)。
【專利說(shuō)明】致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病原卵菌線粒體基因型和異質(zhì)性檢測(cè)的【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯上最具毀滅性的晚疫病由致病疫霉引起，該病曾于19世紀(jì)40年代中期在 歐洲大流行，引起國(guó)際知名的"愛爾蘭大饑荒"，對(duì)該病的研究開創(chuàng)了植物病理學(xué)的開端。當(dāng) 今，該病仍是馬鈴薯上第一大病害，每年全球造成經(jīng)濟(jì)損失為67億美元，不包括使用農(nóng)藥 的費(fèi)用。對(duì)于病原菌多樣性的分子檢測(cè)對(duì)于病害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和防控具有重要意義，而線粒體 由于是母系遺傳，對(duì)其基因型的測(cè)定可作為致病疫霉群體監(jiān)測(cè)的可靠方法，目前國(guó)際上已 報(bào)道了 2種致病疫霉線粒體基因型的測(cè)定方法，而國(guó)際上未有致病疫霉線粒體異質(zhì)性的檢 測(cè)的方法。Carter在1990年首次提出了致病疫霉線粒體基因型的RFLP方法，通過分離、 純化致病疫霉線粒體基因組DNA，再用多種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切電泳，發(fā)現(xiàn)了 4種線粒體 基因組的多態(tài)性，并將其分別命名為Ia，Ib，Ila和lib等四種線粒體基因型，也稱為線粒 體單倍型。但該方法的缺點(diǎn)是需要分離和純化粒體基因組DNA，操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，并且實(shí)驗(yàn) 成本很高，測(cè)定效率極低。隨后，當(dāng)致病疫霉lb基因型的線粒體基因組序列被公布后，1998 年Griffith等在基因組上定位了 Carter等酶切線粒體基因組的位置，在酶切位點(diǎn)的兩側(cè) 保守區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物，對(duì)該段基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而后進(jìn)行酶切，從而建立了簡(jiǎn)便、高 效的PCR-RFLP的線粒體基因組基因型的檢測(cè)方法，。但由于1998年Griffith的PCR-RFLP 方法未考慮致病疫霉I型和II型本質(zhì)的差別在于2kb的插入缺失，從而導(dǎo)致使用PCR-RFLP 方法的檢測(cè)結(jié)果有時(shí)與Carter提出的RFLP方法檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不一致。此外，以上兩種方法 所檢測(cè)的線粒體基因組基因型的數(shù)目有限僅4種，且未能對(duì)其異質(zhì)性進(jìn)行檢測(cè)。因此，本發(fā) 明在對(duì)4個(gè)致病疫霉線粒體基因組序列分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)高度變異區(qū)可用于區(qū)分 4種線粒體基因型，對(duì)2個(gè)高變區(qū)分別設(shè)計(jì)了對(duì)特異性引物對(duì)，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)， 發(fā)明了致病疫霉線粒體基因型檢測(cè)試劑盒；同時(shí)，通過2個(gè)高變區(qū)擴(kuò)增子條帶數(shù)目可確定 其是否具異質(zhì)性。該方法建立用于國(guó)家檢疫部門對(duì)外來(lái)致病疫霉和農(nóng)業(yè)部門對(duì)不同區(qū)域病 原菌群體的監(jiān)測(cè)，也可用于各大種薯生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于基地致病疫霉動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種兼致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性檢測(cè)于一體的檢測(cè) 試劑盒，包括2對(duì)PCR引物和Mix，以及檢測(cè)方法。
[0004] 1.本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 從GenBank中下載已經(jīng)完成測(cè)序的Carter的4種線粒體基因型（la, lb, Ila和lib) 的基因組序列。首先，用ClustalX對(duì)這4個(gè)線粒體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，用BioEdit和MEGA 軟件對(duì)基因組序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)線粒體基因型基因組存在2種核苷酸多態(tài)性，一種是 由單核苷酸替代或缺失造成的單核苷酸多態(tài)性（SNP)，另外一種是在線粒體基因組的2個(gè) 高變區(qū)存在由大片段插入或缺失引起的長(zhǎng)度多態(tài)性。在這2個(gè)高變區(qū)的兩側(cè)保守序列中， 利用NCBI中的Primer-BLAST分別設(shè)計(jì)2對(duì)專一性的PCR引物，分別為引物對(duì)InDel-F和 InDel-R，以及引物對(duì)RSU-F和RSU-R。分別利用該2對(duì)特異性引物對(duì)致病疫霉基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度多態(tài)性，通過2個(gè)高變區(qū)不同擴(kuò)增子 的長(zhǎng)度多態(tài)性組合來(lái)確定致病疫霉線粒體基因型，并根據(jù)不同組合，提出一套用于確定不 同致病疫霉線粒體基因型的命名方式；同時(shí)，根據(jù)每個(gè)高變區(qū)的條帶數(shù)目判斷致病疫霉線 粒體是否具有異質(zhì)性。
[0005] 2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)鑒別致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性的新方法是采用 以下步驟： (1) 致病疫霉基因組DNA的提??； (2) 擴(kuò)增DNA片段，即進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的2對(duì)引物的DNA序 列為： InDel-F :5'-GTGGGTTCGAGTCCCACTAA-3' InDel-R :5'-CTCACCCGTTCGCTATGTTT-3' RSU-F :5'-ACGGAATTATCGGAAGATTT-3' RSU-R :5'-AAATCCCTTTTATACTGTAATTTGAT-3' (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析； (4) 鑒定結(jié)果的判斷。線粒體基因型由2對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增條帶模式組合來(lái)判定，具體如 下； A. 利用InDel-F和InDel-R引物可擴(kuò)增出2條長(zhǎng)度不同的條帶，其大小分別為3 kb 和1 kb，將其分別命名為L(zhǎng)和S，不同線粒體基因型的菌株經(jīng)擴(kuò)增后會(huì)出現(xiàn)3種條帶模式： L，S 和 LS ; B. 利用RSU-F和RSU-R引物對(duì)可擴(kuò)增出3種長(zhǎng)度不同條帶，其長(zhǎng)度分別為192 bp、228 bp和264 bp，分別將其命名為Vi、V2和V3，不同線粒體基因型的菌株經(jīng)擴(kuò)增后會(huì)出現(xiàn)7種條 帶及其組合模式，即％，V 2，V3，VJ2，V%，V2V3， C. 綜合以上2個(gè)擴(kuò)增結(jié)果的組合，擴(kuò)增結(jié)果有21種情況，即相應(yīng)的線粒體基因型有 21 種，分別為：1^，LV2，LV3，LVJ2，LV%，LV2V 3，LVJA，SV1; SV2，SV3，SVJ2，SV%， SV2V3，SW3，LSV" LSV2，LSV3，LSVJ2，LS'%，LSV2V 3，lsw3; D. 致病疫霉線粒體異質(zhì)性的基因型為：!Λν2，lvj3，lv2v 3，lvj2v3，SVJ2，SVJ3， SV2V3, SVJA, LSV" LSV2, LSV3, LSVA, LSVJs, LSV2V3 和 LSVJA 等 15 種； 本發(fā)明的效果是：（1)首次提出了利用PCR方法發(fā)現(xiàn)致病疫霉線粒體異質(zhì)性的方法； (2)所建立的致病疫霉線粒體基因型檢測(cè)試劑盒，大大增加了基因型的檢測(cè)數(shù)目，由原來(lái)方 法所能檢測(cè)到4種增加至該方法能最終確定21種線粒體基因型；（3)該試劑盒簡(jiǎn)便、高效、 準(zhǔn)確，從而克服了前人致病疫霉線粒體基因型檢測(cè)方法復(fù)雜、花費(fèi)高和效率低等諸多問題。
[0006] 3.【具體實(shí)施方式】為： (1) 試劑盒成分包括：引物 AsF 和 AsR (各 10 μΜ)、Μ?χ [Taq 酶（0·1-0·2υ/μυ、 dATP (0· 06-0. 10 mM)、dTTP (0· 06-0. 10 mM)、dGTP(0. 06-0. 10 mM)、dCTP(0. 06-0. 10 mM)、 MgCl2 (0.8-1. 3 mM)、KCl (130-160 mM)、Tris-HCl (25-30 mM, pH 9. 0-9.3)、1% Triton X-100 及穩(wěn)定劑]、ddH20 ; (2) DNA的提?。喊凑粘Ｒ?guī)的CTAB法提取致病疫霉菌絲的DNA ;
【權(quán)利要求】
1. 一種兼致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性檢測(cè)于一體的試劑盒，其特征在于：試劑盒 包含一對(duì)特異性引物DNA序列和Mix。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性的試劑盒，其特征在 于：試劑盒包含2對(duì)PCR專一性引物對(duì)，分別為：InDel-F :5' -GTGGGTTCGAGTCCCACTAA-3'， InDel-R:5'-CTC ACC CGT TCG CTA TGT TT-3'，RSU-F:5'-ACG GAA TTA TCG GAA GAT TT-3'，RSU-R :5' -AAA TCC CTT TTA TAC TGT AAT TTG AT-3'。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)致病疫霉線粒體基因型和異質(zhì)性的試劑盒，其特征在于： 試劑盒 Mix 的成分為 Taq 酶（0· 1-0. 2 U/ μ L)、dATP (0· 06-0. 10 mM)、dTTP (0· 06-0. 10 mM)、dGTP(0. 06-0. 10 mM)、dCTP(0. 06-0. 10 mM)、MgCl2(0. 8-1. 3 mM)、KC1 (130-160 mM)、 Tris-HCl (25-30 mM, pH 9. 0-9.3)、1% Triton X-100 及穩(wěn)定劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：試劑盒的檢測(cè)方法為，以致病疫霉的基因 組DNA為模板，利用自行設(shè)計(jì)的2對(duì)專一性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)2次PCR的擴(kuò)增 的條帶模式及組合，判斷致病疫霉的線粒體基因型和線粒體是否具有異質(zhì)性。
5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒檢測(cè)方法，其特征在于：致病疫霉的基因組DNA的提取 使用CTAB法，用去離子水將DNA濃度調(diào)節(jié)至5-10 ng/μ 1。
6. 如權(quán)利要求4所述的試劑檢測(cè)方法，其特征在于：PCR所用的引物中，InDel-F與 InDel-R配對(duì)進(jìn)行PCR，RSU-F與RSU-R配對(duì)進(jìn)行PCR。
7. 如權(quán)利要求4和6所述的試劑盒檢測(cè)方法，其特征在于：利用InDel-F和InDel-R專 一性引物對(duì)進(jìn)行PCR時(shí)，可擴(kuò)增出2條長(zhǎng)度不同的條帶，其大小分別為3 kb和1 kb，將其分 別命名為L(zhǎng)和S，不同線粒體基因型的菌株經(jīng)擴(kuò)增后會(huì)出現(xiàn)3種線粒體基因型組合方式：L， S 和 LS。
8. 如權(quán)利要求4和6所述的檢測(cè)方法，其特征在于：利用RSU-F和RSU-R專一性引物 進(jìn)行PCR時(shí)，可擴(kuò)增出3條大小不同的條帶，其長(zhǎng)度分別為192 bp、228 bp和264 bp，分別 命名為￥1、^和％，不同線粒體基因型的菌株經(jīng)擴(kuò)增后會(huì)出現(xiàn)7種條帶模式即：Vi，V 2，V3， \\，\\，W
9. 如權(quán)利要求7和8所述的檢測(cè)方法，其特征在于：2次PCR擴(kuò)增結(jié)果的條帶模式組合 共計(jì)有21種，也即相對(duì)應(yīng)致病疫霉線粒體基因型有21種，其分別為：LVu LV2，LV3，LVJ2， 県，LV2V 3，LW3，SV" SV2，SV3，SVJ2，SVJ3，SV 2V3，SW3，LSV" lsv2，lsv3， LSVJ2，LSV%，LSV2V3，LSVJA。
10. 如權(quán)利要求1和7所述的檢測(cè)方法，其特征在于：致病疫霉異質(zhì)性的基因型有 LVJ2，県，LV2V3，LVJA SVJ2，SVJ3, SV2V3, LSV" LSV2，LSV3，LSVJ2， LSVJs, LSV2V3 和 LSVJ%。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104120169SQ201310145528
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】楊志輝, 朱杰華, 徐進(jìn), 齊明星, 秦宇軒, 桂秀梅, 陶晡, 許小虎, 張福光, 楊毅清 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)