專利名稱：一種sbr中活性污泥樣品dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA的提取領(lǐng)域，特別涉及一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
活性污泥中細菌總DNA提取的不同方法得到的DNA純度不同，分析DNA的純度，用于了解微生物的群落結(jié)構(gòu)，對鑒定和分離處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌很重要。力求通過這多方面的研究來提高生物處理染料廢水處理能力。DNA提取是分子學(xué)技術(shù)的前提條件。只有提取出了足夠的并且純度適宜的DNA，才能進行后續(xù)的實驗和研究，所以DNA的提取可以說是分子生物學(xué)的關(guān)鍵所在。關(guān)于活性污泥中細菌總DNA提取方法:提取活性污泥DNA時，對樣品進行預(yù)處理是非常必需的?；钚晕勰嘀泻写罅康母乘?、褐菌素和重金屬離子等雜質(zhì)，還有一些胞外游離的DNA，它們都極大地影響DNA提取以及后續(xù)工作，采用TENP和PBS緩沖液對污泥樣品進行預(yù)處理，可以去除污泥樣品中的腐殖酸、各種離子、無機物及有機物等雜質(zhì)，減少胞外游離DNA的污染。細胞裂解是破壞細胞壁和細胞·膜的過程。常用的裂解方法有化學(xué)、酶和機械裂解。本實驗采用化學(xué)裂解法直接從廢水樣品中提取基因組DNA。蛋白的去除使用的是傳統(tǒng)的苯酚氯仿抽提法。核酸的沉淀一般選擇在乙醇、異丙醇等溶劑中進行，使用異丙醇可以得到較高產(chǎn)量的DNA并且腐殖酸的含量較低，故本實驗中選用異丙醇來沉淀DNA。沉淀得到的DNA通常會含有腐殖酸和酚類化合物等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會影響到后續(xù)的分析，特別是PCR擴增。低量的腐殖酸會抑制PCR反應(yīng)，使其得不到任何產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，該方法具有快速，高效的特點，可以高效提取印染廢水或相同的水質(zhì)情況廢水的活性污泥基因組DNA，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，包括:(I)活性污泥樣樣品在處理前首先混勻，使其中的懸浮物質(zhì)分布均勻；采用TENP、PBS溶液和玻璃珠震蕩法對樣品進行預(yù)處理；將經(jīng)預(yù)處理的污泥樣品采用凍融法破碎，冷藏、沸水煮，再加入質(zhì)量百分比濃度2% 10%的SDS緩沖液去除蛋白質(zhì)；(2)加入0.6倍樣品體積的異丙醇，顛倒混勻，進行沉淀；離心，倒掉上清液；自然風(fēng)干，用TE緩沖液懸浮樣品，溶解沉淀，即得基因組DNA粗提液；加入RNase A，35 40°C溫浴15-20min消化RNA，然后采用DNA膠回收試劑盒，按照操作說明進行純化；(3)用紫外分光光度計測定上述純化DNA樣品在波長230、260、280nm處的吸光光度值；將上述純化DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。所述步驟(I)中的TENP溶液體積和PBS溶液體積為污水樣品的3 5倍；玻璃珠直徑為I 2mm, 3000 5000rpm離心10 30min。所述步驟(I)中的冷藏、沸水煮具體為:置于-25 _15°C冰箱中冷藏I 2h，沸水煮10 20min，重復(fù)一次。所述步驟(I)中冷藏、沸水煮后,加入2 4ml Extraction buffer, I 5粒玻璃珠，鏇潤5 IOmin0所述步驟(I)中的SDS緩沖液的質(zhì)量百分比濃度為2%。所述步驟(2)中的沉淀具體為放入冰箱內(nèi)沉淀I 2h或過夜沉淀。所述步驟(2)中的TE緩沖液的用量為100 μ L。所述步驟(2)中的RNase A的濃度為10mg/mL，用量為4 μ L。所述步驟(3)中的瓊脂糖凝膠質(zhì)量百分比濃度為1%，電壓為100 110V，電泳
0.5 1h0采用加2%SDS緩沖液和加10%SDS緩沖液作對比，并根據(jù)上面結(jié)果結(jié)合凍融法對經(jīng)預(yù)處理方法處理后的樣品進行分析比較，加2%SDS的提取效果要好于10%SDS。本發(fā)明以印染廢水SBR系統(tǒng)為研究對象，對從反應(yīng)器內(nèi)提取的活性污泥樣品經(jīng)過或未經(jīng)預(yù)處理兩種情況下的污泥樣品，采用玻璃珠震蕩法和凍融法兩種細胞裂解方法，t匕較各自DNA提取效果的影響，以期建立一種快速、高效且適用于分子生物學(xué)后續(xù)分析的活性污泥基因組DNA提取 新方法。通過吸光度和瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果表明:活性污泥經(jīng)TENP和PBS預(yù)處理后采用凍融法加2%SDS裂解細胞的DNA提取操作，可以得到數(shù)量多、純度高的活性污泥DNA樣品。有益.效果本發(fā)明具有快速，聞效的特點，可以聞效提取印染廢水或相同的水質(zhì)情況廢水的活性污泥基因組DNA，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是實施例1不同提取方法獲得的DNA電泳圖；其中，Marker: λ DNA-Hind III ；1:預(yù)處理+玻璃珠震蕩；2:預(yù)處理+凍融；3:未處理+玻璃珠震蕩；4:未處理+凍融；圖2是實施例1不同細胞裂解法提取的DNA電泳圖；其中，Marker: λ DNA-HindIII ；
5、6:凍融法+2%SDS緩沖液;7、8:凍融法+10%SDS緩沖液；圖3是實施例1活性污泥總DNA提取結(jié)果；其中，1、2、3分別為缺氧段時間為2h前、中、后期樣品；4、5、6分別為缺氧段時間為3h前、中、后期樣品；7、8、9分別為缺氧段時間為 4h 前、中、后期樣品；Marker: λ DNA-Hind III。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1一、活性污泥樣品的來源和預(yù)處理方法
1、來源SBR系統(tǒng)不同缺氧時間段的前期、中期、后期進行取樣，活性污泥樣品取自反應(yīng)池泥水混合液。2、預(yù)處理方法 樣品在處理前首先要混勻，使其中的懸浮物質(zhì)分布均勻。取約IOmL污水樣品，加入滅菌離心管,4000rpm、離心20min,收集沉淀。加約4倍體積的TENP buffer (50mMTirs, 20mMEDTA, IOOmM NaCl,0.01g/mL PVP，pH10.0)，加玻璃珠(d: lmm)充分均化(解絮凝)。4000rpm、離心20min,棄上清(重復(fù)兩次，直至上清液較澄清)。加入4倍體積的PBS buffer (8g NaCl、
0.2gKCl、l.44gNa2HP04、0.24gKH2P04、溶于 IL 水、ρΗ7.4)，漩渦混勻，4000rpm，離心 20min，收集沉淀(重復(fù)兩次)。二、凍融法裂解將經(jīng)預(yù)處理的污泥樣品置于_20°C冰箱中冷藏lh，沸水煮lOmin，再放入_20°C冰箱中冷藏IOmin,沸水煮lOmin。將經(jīng)過上述細胞裂解方法得到的菌液4000rpm離心20min,棄上清液，沉淀物用于進一步裂解。向沉淀物中加入2ml Extraction bufferC IOOmM EDNA、100mMTirs-base、200mM NaCl、2%CTAB、l%PVP、pH8.0)，加 2 粒玻璃珠(d: lmm)，漩渦 5min，使
樣品充分懸浮。三、不同濃度的SDS細胞裂解效果檢測和蛋白質(zhì)去除加入2ml SDS buffer (IOOmMTirs、200mM NaCl、2%SDS、ρΗ8.0)上下顛倒 5min，4000rpm、離心lOmin，用ImL的移液管將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管內(nèi)。加入等體積Tris-飽和苯酹,顛倒離心管混勻樣品。4000rpm、離心20min,用ImL的移液管小心將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)，注 意不要吸入白色的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)較多，重復(fù)上述步驟一次。加入酚、氯仿和異戊醇(V (酚):V (氯仿):V(異戊醇)=25:24:1)，混合均勻。4000rpm、離心20min，取上清，用ImL的移液器小心將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管內(nèi)。加入氯仿和異戊醇(V(氯仿):V(異戊醇)=24:1)，顛倒混勻，4000rpm、離心20min，取上清，用ImL的移液器小心將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管內(nèi)。四、DNA的分離和純化技術(shù)加入0.6倍樣品體積異丙醇，顛倒混勻。樣品放入冰箱內(nèi)沉淀Ih或過夜沉淀。4000rpm,離心20min,倒掉上清液。樣品自然風(fēng)干30min。用IOOyL TE緩沖液懸浮樣品，溶解沉淀，即為所得的基因組DNA粗提液。力口 4yL RNase A( 10mg/mL)，37°C，溫浴15_20min，消化RNA。然后采用DNA膠回收試劑盒，按照操作說明對其進行純化。五、DNA的純度測定用UVmin1-1240型號紫外分光光度計分別測定DNA樣品在230nm、260nm和280nm
處的吸光度值，計算0D26(i/0D23(i及0D26(i/0D28(i的比值以確定樣品純度。若DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其它小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準確度。一般情況下可以測定同一樣品的0D23(1、0D26(i和OD28tl值，再計算其比值來衡量其樣品的純度。純DNA:OD260/OD280 一 1.8，OD260/OD230 > 2 ;若 OD260/OD280 > 1.9，則可能有 RNA 污染；若 OD260/OD280 < 1.6，則可能有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染；若OD26tZOD23tl < 2，可能存在酚類等小分子雜質(zhì)。六、DNA電泳分析采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為I XTAE緩沖液；100mL的IXTAE緩沖液含瓊脂糖Ig ;電壓:110V ;電泳時間約30分鐘；染色用溴化乙錠(EthidiumBromide, EB)終濃 度是I μ g/mL染色20min，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，包括: (1)活性污泥樣樣品在處理前首先混勻，采用TENP、PBS溶液和玻璃珠震蕩法對樣品進行預(yù)處理；將經(jīng)預(yù)處理的污泥樣品采用凍融法破碎，冷藏、沸水煮，再加入質(zhì)量百分比濃度2% 10%的SDS緩沖液去除蛋白質(zhì)； (2)加入0.6倍樣品體積的異丙醇，顛倒混勻，進行沉淀；離心，倒掉上清液；自然風(fēng)干，用TE緩沖液懸浮樣品，溶解沉淀，即得基因組DNA粗提液；加入RNase A，35 40°C溫浴15-20min消化RNA，然后采用DNA膠回收試劑盒，按照操作說明進行純化； (3)用紫外分光光度計測定上述純化DNA樣品在波長230、260、280nm處的吸光光度值；將上述純化DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(I)中的TENP溶液體積和PBS溶液體積為污水樣品的3 5倍；玻璃珠直徑為I 2mm, 3000 5000rpm 離心 10 30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(I)中的冷藏、沸水煮具體為:置于-25 -15°C冰箱中冷藏I 2h，沸水煮10 20min，重復(fù)一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(I)中冷藏、沸水煮后,加入2 4ml Extraction buffer, I 5粒玻璃珠,鏇潤5 IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(I)中的SDS緩沖液的質(zhì)量百分比濃度為2%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(2)中的沉淀具體為放入冰箱內(nèi)沉淀I 2h或過夜沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(2)中的TE緩沖液的用量為100 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(2)中的RNase A的濃度為10mg/mL，用量為4 μ L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟(3)中的瓊脂糖凝膠質(zhì)量百分比濃度為1%，電壓為100 110V，電泳0.5 Ih。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法,包括污泥樣品前處理、破碎、蛋白質(zhì)的去除、DNA的分離提純、基因組DNA純化、DNA的紫外分光光度分析、DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發(fā)明具有快速，高效的特點，可以高效提取印染廢水或相同的水質(zhì)情況廢水的活性污泥基因組DNA，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/10GK103215254SQ20131015135
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月26日
發(fā)明者趙曉祥, 張灣, 鄧航 申請人:東華大學(xué)