專利名稱：一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因以及運(yùn)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的蟲(chóng)生真菌蟬擬青霉來(lái)源的類枯草桿菌蛋白酶基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蝶擬青霉(Paecilomyces cicadae Miq.)是從蝶若蟲(chóng)僵尸上分離到的半知菌綱擬青霉屬的蟲(chóng)生真菌，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥一蟬花，具有多方面的藥用價(jià)值。目前研究已發(fā)現(xiàn)蟬擬青霉對(duì)鱗翅目、同翅目和膜翅目多種害蟲(chóng)具有致病性，所以可將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防治，這些研究為發(fā)展新生 物農(nóng)藥來(lái)彌補(bǔ)化學(xué)農(nóng)藥的缺憾帶來(lái)了希望。浙江作為蟬擬青霉的歷史產(chǎn)區(qū)，如杭州、溫州、麗水、臺(tái)州、寧波等地均具有豐富的蟬擬青霉資源，因此，開(kāi)展蟬擬青霉的生物防治和研究有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。大量的研究表明，蟲(chóng)生真菌對(duì)昆蟲(chóng)的致病能力與其入侵過(guò)程中產(chǎn)生的酶類(蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶、淀粉酶等)存在重要關(guān)系，然而，蟬擬青霉也有著蟲(chóng)生真菌的通病，如對(duì)環(huán)境溫濕度敏感、耐儲(chǔ)藏性差、環(huán)境適應(yīng)能力弱、致死慢和防效不穩(wěn)定等，這嚴(yán)重制約其在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治方面的推廣應(yīng)用和商品化生產(chǎn)。發(fā)展更有效更穩(wěn)定的蟬擬青霉殺蟲(chóng)劑成為必須。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因，其中該基因?yàn)镾EQ IN NO: 16所示。另一方面，本發(fā)明提供一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶蛋白片段，其中該蛋白酶的氨基酸序列為SEQ IN N0:17所示。再一方面，本發(fā)明提供一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因的方法，該方法包括:提取蟬擬青霉的mRNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，采用引物序列從模板克隆獲得部分基因序列，然后采用SLP RACE方法獲得全長(zhǎng)基因序列，其中，克隆cDNA模板的引物序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。在優(yōu)選的方式中，在采用SLP RACE方法中，擴(kuò)增5 ‘端采用的引物序列為SEQ IDNO:5，SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8 所示。優(yōu)選的，在采用SLP RACE方法中，擴(kuò)增3 ‘端采用的引物序列為SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12 和 SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14 所示。另一方面，本發(fā)明提供一種用于降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶，所述的蛋白酶包括SEQ IN NO: 17所示的氨基酸序列。優(yōu)選的，蛋白酶由SEQ IN NO: 16所示的基因編碼。有益效果蟬擬青霉作為一類潛在的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)生防菌，在對(duì)其開(kāi)發(fā)利用方面也存在蟲(chóng)生真菌的通病。但是有關(guān)蟬擬青霉中降解昆蟲(chóng)體壁蛋白酶基因的報(bào)道尚處于空白。盡管不同蟲(chóng)生真菌的Prl酶的功能是相同或相似的，但由于其編碼基因的部分核苷酸的變化可能使氨基酸序列發(fā)生改變，會(huì)造成二級(jí)結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致這些Prl酶在親疏水性能和抗原性上表現(xiàn)出一定的差異，因此，從蟬擬青霉中克隆具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因并對(duì)其功能進(jìn)行鑒定分析，對(duì)了解蟬擬青霉的致病機(jī)理有著重要意義。對(duì)蟬擬青霉中具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因進(jìn)行克隆，將為從分子水平探索病原菌一昆蟲(chóng)的互作機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為新型高效安全的殺蟲(chóng)劑的研發(fā)提供新思路，開(kāi)辟新途徑；而且我們用原核或真核構(gòu)建蟬擬青霉降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因表達(dá)系統(tǒng)，不僅對(duì)研究毒力相關(guān)基因的功能具有重要作用，而且還可以為評(píng)價(jià)和利用該類基因產(chǎn)物提高殺蟲(chóng)真菌的殺蟲(chóng)效果奠定良好的基礎(chǔ)。


圖1為按照常規(guī)方法提取的蟬擬青霉(菌株APC20保存編號(hào)CGMCC NO: 1104)的mRNA電泳圖譜。圖2為經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖，其中M表示:Marker DL2000 ;泳道I為擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化DH5 α后菌落PCR產(chǎn)物；泳道2為擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化DH5 α后提取質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。圖3為圖2中所示的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列圖。圖4為5’ RACE PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖，其中Marker從上到下分別為:100，250,500，750,1000, 1500, 2000, 3000, 5000。圖5為3’ RACE PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖，其中Marker從上到下分別為:100，250,500，750,1000, 1500, 2000, 3000, 5000。圖6為PCR檢驗(yàn)后的電泳圖.
圖7為蝶擬青霉類枯草桿菌蛋白酶與粉擬青霉(Isaria farinosa)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)及蟲(chóng)甬蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-likeprotease)同源性比較圖。圖8 [Il單擬青霉基因片段與Isaria fumosorosea的subtilisin-like protea se mRNA 序列同源性比較圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用以下具體實(shí)施實(shí)例用以說(shuō)明，但并非限于這些例子。Prl特異性片段序列分析和部分片段的克隆根據(jù)Genebank中已登錄的Peacilomyces、Isaria以及球孢白僵菌和金龜子綠僵菌的類枯草桿菌蛋白酶基因序列的同源性比較，以它們高度保守的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，(SEQ ID NO:1) PCPrlF, 5’CTGGCTTCCGTGGTTATGCTGG3’(SEQ ID NO:2) PCPrlR, 5’CACCACCAAGAGACATGTTGGCGAC3’按照常規(guī)方法提取蟬擬青霉(菌株APC20保存編號(hào)CGMCC NO: 1104) mRNA (圖1)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA作為模板，采用上述PCPrF，PCPrR為引物，PCR擴(kuò)增獲得清晰單一的電泳條帶(圖2)，PCR擴(kuò)增的體系和條件如下。PCR 反應(yīng)體系(25ul):10 X Taq酶緩沖液2.5ul
dNTP2.0ul
Mg2+2.0ul
rTaq0.5ul引物各 1.Uul
H2015ul
模板1.0ul
總反應(yīng)體積25 ul反應(yīng)條件:95°C—4min ;95°C—45s，60°C—40s，72°C—lmin，30cycles ;72°C—lOmin。使用DNA純化 試劑盒(TaKaRa Agarose GelVer2.0)對(duì)片段進(jìn)行純化，純化的方法按照試劑盒自帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。電泳片段回收試劑盒進(jìn)行特異條帶的回收，回收的片段被連接到PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Transl-Tl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后委托上海Invitrogen測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，獲得長(zhǎng)度為605bp的序列(SEQ ID NO:
3)。上述保守引物PCPrlF, PCPrlR的位置分別在l_22bp和582_605bp (圖3)(帶有下劃線標(biāo)示出的為引物位置)。蝶擬青霉基因片段(SEQ ID NO:3)與Isaria fumosorosea的subtilisin-like protease mRNA 序列同源性比較(圖 8)。真菌SLP RACE克隆實(shí)驗(yàn)(一)、5’RACE 實(shí)驗(yàn)1.5’RACE模板采用GeneRacer Kit (從Invitrogen公司購(gòu)買)進(jìn)行合成，具體方法如下，其中，GeneRacer RNA Oligo序列為:5' -CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3, (SEQ ID NO:4)1.1RNA脫磷酸化用DEPC處理過(guò)的1.5ml離心管裝以下試劑，
總 RNA(1.5ug)7ul
10XCIP BufferIulRNase 0UT(10U/ul)Iul
LlP (lOU/ul)_Iul
IOul用槍頭輕輕混勻，瞬時(shí)離心，500C，Ih,瞬時(shí)離心，冰置2RNA 沉淀1.反應(yīng)結(jié)束后，加入90ul DEPC水和IOOul酚:氯仿，上下混勻；2.室溫最大轉(zhuǎn)速離心5min,轉(zhuǎn)移上層至新的離心管；3.加入2ull0mg/ml糖原，10ul3M醋酸鈉，ρΗ5.2混勻，再加入220ul95 %乙醇，上下混勻，-20°C過(guò)夜保存；4.40C，最大轉(zhuǎn)速離心20min，棄去上清；5.加入500ul70%酒精，顛倒幾次，上下混勻，4°C，最大轉(zhuǎn)速離心2min，去酒精，再次離心去除殘余酒精，室溫干燥l_2min ;加入7ul DEPC水重懸RNA。3去除mRNA帽子結(jié)構(gòu)和RNA沉淀1.將去磷酸化的RNA反應(yīng)液用1.5ml離心管裝，并加入以下試劑:
權(quán)利要求
1.一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因，其中該基因?yàn)镾EQ INNO: 16所示。
2.一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶蛋白片段，其中該蛋白酶的氨基酸序列為SEQ IN NO: 17所示。
3.—種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因的方法，該方法包括:提取蟬擬青霉的mRNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，采用引物序列從模板克隆獲得部分基因序列，然后采用SLP RACE方法獲得全場(chǎng)基因序列，其中，克隆cDNA模板的引物序列為SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所示的方法，在采用采用SLPRACE方法中，擴(kuò)增5 ‘端采用的引物序列為 SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所示的方法，在采用采用SLPRACE方法中，擴(kuò)增3 ‘端采用的引物序列為 SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12 和 SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14 所示。
6.一種用于降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶，所述的蛋白酶包括SEQ IN NO: 17所示的氨基酸序列。
7.根據(jù) 權(quán)利要求6所述的蛋白酶由SEQIN NO: 16所示的基因編碼。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶基因，其中該基因?yàn)镾EQ IN NO:16所示；以及一種從蟬擬青霉中獲得具有降解昆蟲(chóng)體壁功能的蛋白酶蛋白片段，其中該蛋白酶的氨基酸序列為SEQ IN NO:17所示。利用這些基因表達(dá)的蛋白酶可以降解昆蟲(chóng)體壁，為新型高效安全的殺蟲(chóng)劑的研發(fā)提供新思路，開(kāi)辟新途徑。
文檔編號(hào)C12N9/58GK103233026SQ20131015223
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月26日
發(fā)明者柴一秋, 陳官菊, 黨向利, 厲曉臘, 金軼偉, 劉又高 申請(qǐng)人:浙江省亞熱帶作物研究所