新型微rna篩選方法、驗(yàn)證系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了新型微RNA篩選方法、驗(yàn)證系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明的篩選驗(yàn)證系統(tǒng)可簡(jiǎn)單快速經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)hetRNA的表達(dá)。本發(fā)明為天然hetRNA的篩選驗(yàn)證提供了一個(gè)方便可行的路徑和方法，為將來(lái)大規(guī)模的發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證hetRNA提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。本發(fā)明還提供了新的構(gòu)建用于RNA篩選數(shù)據(jù)庫(kù)的方法。
【專利說(shuō)明】新型微RNA篩選方法、驗(yàn)證系統(tǒng)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種新型微RNA(hetRNA)篩選系統(tǒng)的構(gòu)建方 法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 最近的研究表明，真核基因組90%以上的序列都會(huì)被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量的非編 碼 RNA(ncRNAs) 【Costa FF.,Bioessays2010;32(7):599-608;Carninci P，Yasuda J，Hayashizaki Υ·，Curr Opin Cell Biol2008;20(3):274-280】，包括長(zhǎng)的非編碼 RNA(lncRNAs)和小的非編碼（sRNAs〈200nt)。sRNAs幾乎能直接或間接影響細(xì)胞的每一個(gè) 生物學(xué)活動(dòng)【Czech B, Hannon GJ·，Nat Rev Genet 2010;12(1):19-31】。自從 1993 年發(fā) 現(xiàn)microRNAs ( -種sRNA)以來(lái)，解析小RNA組學(xué)（sRNAome)已經(jīng)成了很多實(shí)驗(yàn)室的目標(biāo) 【Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V·，Celll993;75(5):843-854】。這導(dǎo)致多種功能性的內(nèi)源 微RNA(〈30nt)的發(fā)現(xiàn)【Choudhuri S.，JBiochem Mol Toxicol2010;24(3) :195-216. ;Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, Dinger M, Mattick JS. , J Pathol 2009;220 (2):126-139. ；Li Z,Kim Sff, Lin Y et al. ,J Virol2009;83(24):12751-12758. ；Taft RJ, Simons C, Nahkuri S et al.，Nat Struct Mol Biol;17(8):1030-1034】。但是，這些微 RNA-般是連續(xù)地存在 于對(duì)應(yīng)的基因組上。
[0003] 最近發(fā)展起來(lái)的深度測(cè)序技術(shù)（deep sequencing)特別適合于發(fā)現(xiàn)微RNA 【Hafner M，Landgraf P, Ludwig J et al·，Methods 2008;44(1):3_12】。深度測(cè)序技術(shù) 可以產(chǎn)生千萬(wàn)乃至上億的微RNA數(shù)據(jù)，這使得人們能夠比先前更為詳盡地解析微RNA組 學(xué)，特別是它能夠發(fā)現(xiàn)那些先前克隆和標(biāo)準(zhǔn)的方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的新的尤其是低豐度的微RNA 【Nagalakshmi U，Waern K，Snyder M·， Curr Protoc Mol Biol2010;Chapter4:Unit4 11 11-13. ;van der Brug M，Nalls MA，Cookson MR·, Brain Res2010;1338:146_154·】。但 是，隨之而來(lái)的挑戰(zhàn)是如何確定這百萬(wàn)級(jí)以上的小核苷酸序列在基因組上的定位。事實(shí) 上，對(duì)一般的測(cè)序平臺(tái)來(lái)說(shuō)，的確有明顯比例的數(shù)據(jù)是不能在基因組中找到定位的【Blow N.，Nature2009 ;458(7235):239-242.】。有趣的是，最近，人們?cè)诟咄繙y(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā) 現(xiàn)一種不連續(xù)的小于200nt的小RNA，這種小RNA在基因組上被一個(gè)內(nèi)含子所隔開(kāi)【Na ture2009;457(7232):1028-1032. ；Mercer TR, Dinger ME, Bracken CP et al., Genome Res;20(12):1639-1650. ；Valen E, Preker P, Andersen PR et al., Nat Struct Mol Biol; 18 (9) : 1075-1082.】。但是，有沒(méi)有小于30nt的不連續(xù)的微RNA還有待進(jìn)一步探究。 畢竟小于200nt還是很大的分子，也容易與基因組匹配，但小于30nt的分子就很困難了。
[0004] 綜上所述，本領(lǐng)域?qū)τ谖NA的認(rèn)識(shí)還非常有限，迫切需要開(kāi)發(fā)新的鑒別新型微 RNA的方法。此外，還需要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單方便快速的技術(shù)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，以便篩選和鑒別新型的微 RNA。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是提供一種鑒別新型微RNA或其前體的方法。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種構(gòu)建用于hetRNA篩選的數(shù)據(jù)庫(kù)的方法，所述方法 包括：
[0007] (a)提供一微小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)（或稱為微RNA垃圾數(shù)據(jù)庫(kù)，或0級(jí)RNA篩選 庫(kù)），
[0008] 其中所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號(hào)為 j0的RNA序列，j0為1-nO的正整數(shù)，n0為所述微小數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列總數(shù)，并且RNAjO 是未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)不包括已驗(yàn)證或證實(shí) 的hetRNA和已知小RNA的RNA序列；
[0009] (b)將所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列RNAjO,與標(biāo)準(zhǔn)RNA (reference RNA或RefSeq RNA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而在所述標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中排除與各RNA序列 RNAjO不匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA序列，并選取標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中與RNAjO匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA，并將對(duì)應(yīng) 于該匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列組成一級(jí)RNA篩選庫(kù)（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)， 其中，所述標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0010] X-SEQfflAJ0-Y (I)
[0011] 式中，
[0012] SEQmj(l為相匹配的RNAjO的核苷酸序列；
[0013] X為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接上游（immediately upstream)的長(zhǎng)度為 50-100bp的核苷酸序列；
[0014] Y為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接下游（immediately downstream)的長(zhǎng)度 為50-100bp的核苷酸序列；
[0015] 為連接X(jué)和SEQmj(l以及連接SEQmj(l和Y的鍵（化學(xué)鍵）；
[0016] 其中所述一級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列記為RNAj 1，其中，RNAj 1 表示序號(hào)為jl的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數(shù)，nl為一級(jí)RNA篩選庫(kù)中 的RNA序列總數(shù)；
[0017] (C)將所述一級(jí)篩選庫(kù)中的RNAjl，與基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而排除不含 有內(nèi)含子的RNA序列，并且選取內(nèi)含子要位于成熟微RNA序列（即起始微RNA)之中的RNA 序列，組成二級(jí)RNA篩選庫(kù)，
[0018] 其中所述二級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號(hào)為j2 的RNA序列，其中j2為1-η2的正整數(shù)，n2為二級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)；
[0019] (d)將所述二級(jí)篩選庫(kù)中的RNAj2序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，排 除無(wú)法形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，并將所述二級(jí)篩選庫(kù)中可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列組成 三級(jí)RNA篩選庫(kù)，即用于hetRNA篩選的數(shù)據(jù)庫(kù)，
[0020] 其中，所述三級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號(hào)為j3的 RNA序列，其中j3為1-η3的正整數(shù)，n3為三級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的表示連接式I中各序列的腱，更佳地，為化學(xué)鍵。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的微小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)、標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)、和基因組序 列數(shù)據(jù)庫(kù)是來(lái)自同一物種的。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的物種包括（但并不限于）：哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行動(dòng)物、昆 蟲(chóng)。
[0024] 較佳地，所述的哺乳動(dòng)物包括人、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)目、牛、羊、豬、狗、貓。
[0025] 更佳地，所述的哺乳動(dòng)物包括小鼠、大鼠、人。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)是國(guó)際通用公用數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI (National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站的標(biāo)準(zhǔn) RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（c)中，基因組序列是NCBI網(wǎng)站的基因組序列。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（d)中，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是用公用網(wǎng)站the mFold Server 進(jìn)行。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的三級(jí)RNA篩選庫(kù)也稱為包含內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的hetRNA前 體庫(kù)。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列長(zhǎng)度為18_30nt。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（d)中還包括：將所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)于 RNAjO的各RNA序列組成相應(yīng)的成熟hetRNA庫(kù)。
[0032] 本發(fā)明第二方面，提供了一種鑒定由包含內(nèi)含子的hetRNA前體產(chǎn)生的成熟 hetRNA的方法，包括步驟：
[0033] (a)提供一微小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)（或稱為微RNA垃圾數(shù)據(jù)庫(kù)，或0級(jí)RNA篩選 庫(kù)），
[0034] 其中所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號(hào)為 j0的RNA序列，j0為1-nO的正整數(shù)，n0為所述微小數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列總數(shù)，并且RNAjO 是未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)不包括已驗(yàn)證或證實(shí) 的hetRNA和已知小RNA的RNA序列；
[0035] (b)將所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列RNAjO,與標(biāo)準(zhǔn)RNA (reference RNA或RefSeq RNA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而在所述標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中排除與各RNA序列 RNAjO不匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA序列，并選取標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中與RNAjO匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA，并將對(duì)應(yīng) 于該匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列組成一級(jí)RNA篩選庫(kù)（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)， 其中，所述標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0036] X-SEQfflAJ0-Y (I)
[0037] 式中，
[0038] SEQmj(l為相匹配的RNAjO的核苷酸序列；
[0039] X為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接上游（immediately upstream)的長(zhǎng)度為 50-100bp的核苷酸序列；
[0040] Y為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接下游（immediately downstream)的長(zhǎng)度 為50-100bp的核苷酸序列；
[0041] 為連接X(jué)和SEGUj。以及連接SEGUj。和Y的鍵（化學(xué)鍵）；
[0042] 其中所述一級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列記為RNAj 1，其中，RNAj 1 表示序號(hào)為jl的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數(shù)，nl為一級(jí)RNA篩選庫(kù)中 的RNA序列總數(shù)；
[0043] (c)將所述一級(jí)篩選庫(kù)中的RNAjl，與基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而排除不含 有內(nèi)含子的RNA序列，并且選取內(nèi)含子要位于成熟微RNA序列（即起始微RNA)之中的RNA 序列，組成二級(jí)RNA篩選庫(kù)，
[0044] 其中所述二級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號(hào)為j2 的RNA序列，其中j2為1-η2的正整數(shù)，n2為二級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)；
[0045] (d)將所述二級(jí)篩選庫(kù)中的RNAj2序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，排 除無(wú)法形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，并將所述二級(jí)篩選庫(kù)中可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列組成 三級(jí)RNA篩選庫(kù)，
[0046] 其中，所述三級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號(hào)為j3的 RNA序列，其中j3為1-η3的正整數(shù)，n3為三級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)；和
[0047] (e)對(duì)三級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNAj3序列，測(cè)定其形成hetRNA的能力，其中，如果所 述RNAj3能夠形成hetRNA，則所述的RNAj3是包含內(nèi)含子的hetRNA前體，而其所形成的 hetRNA 為成熟 hetRNA。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的hetRNA來(lái)源于選自下組的物種：哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行動(dòng) 物、昆蟲(chóng)。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物包括人、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)目、牛、羊、豬、狗、貓。
[0050] 更佳地，所述的哺乳動(dòng)物包括小鼠、大鼠、人。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞是293FT細(xì)胞。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，在轉(zhuǎn)染后，通過(guò)莖環(huán)引物擴(kuò)增法（STEM LOOP PCR)進(jìn)行檢測(cè)。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)是深度測(cè)序的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述的深度測(cè)序指測(cè)序深度彡20。
[0055] 本發(fā)明第三方面，提供了 一種鑒定候選RNA序列是否是包含內(nèi)含子的hetRNA前體 的方法，包括步驟：
[0056] ⑴構(gòu)建一表達(dá)載體，所述質(zhì)粒攜帶對(duì)應(yīng)于待鑒定的RNA序列的DNA序列并可將所 述DNA序列表達(dá)為RNA序列，其中所述的待鑒定的RNA序列包含內(nèi)含子；
[0057] (ii)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，并培養(yǎng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞；
[0058] (iii)鑒別所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞中hetRNA，從而確定所述待鑒定的RNA序列 是否是包含內(nèi)含子的hetRNA前體，其中，如果與對(duì)照的受體細(xì)胞相比，并經(jīng)測(cè)序列證明，在 經(jīng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞中形成了對(duì)應(yīng)于所述待鑒定的RNA序列的hetRNA序列，則表示待鑒定的 RNA序列是包含內(nèi)含子的hetRNA前體，而所形成的hetRNA為成熟hetRNA。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的待鑒定的RNA序列來(lái)自用本發(fā)明第一方面所述方法構(gòu)建 的用于hetRNA篩選的數(shù)據(jù)庫(kù)，即所述三級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的RNAj3。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（iii)中，鑒別步驟包括：抽提所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞的 總RNA ;PCR擴(kuò)增待驗(yàn)證的成熟hetRNA序列；以及對(duì)上述PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0061] 本發(fā)明第四方面，提供了一種用本發(fā)明第三方面所述的方法所鑒別出的微RNA分 子或微RNA分子的前體。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述的微RNA分子的序列如SEQ ID N0. :22或23所示的hetRNA ; 或
[0063] 所述的微RNA分子前體的序列如SEQ ID N0. : 24或25所示。
[0064] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0065] 圖1顯示了 hetRNA(前體包含內(nèi)含子的微RNA)形成的示意圖。
[0066] 圖2顯示了本發(fā)明篩選天然hetRNA的分析流程圖。
[0067] 圖3顯示人工構(gòu)建的包含內(nèi)含子的miRNA前體可在細(xì)胞體系中剪切形成成熟 miRNA。圖中，"Primer"表示引物。
[0068] 其中，（A)為人造的包含內(nèi)含子的miRNA前體的剪接過(guò)程的示意圖。
[0069] (B)對(duì)應(yīng)于⑷中的核酸序列及結(jié)構(gòu)。箭頭表示內(nèi)含子hmirtron-1224插入 miR-1955前體的位點(diǎn)。
[0070] (C)內(nèi)含子剪接后剩余產(chǎn)物的RT-PCR結(jié)果。剪接的確認(rèn)引物與載體匹配，不與前 體匹配，如圖（A)所示，其序列為PCDNA6F和PCDNA6R。最后一條泳道的235bp和320bp條 帶分別指剪接前后的PCR產(chǎn)物。
[0071] (D)人工設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的成熟hetRNA-1955的RT-PCR結(jié)果。引物設(shè)計(jì)用標(biāo)準(zhǔn) 的莖環(huán)引物法。"No vector"指HEK293FT沒(méi)有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；PE-miR-126, PE-miR-1955和 PE-miR-1955-hmirtron-1224 指樣品各自轉(zhuǎn)染包含 miR-126,miR-1955 和 miR-1955 中含內(nèi) 含子 mirtron-1224 的 miR-1955 前體質(zhì)粒；PE 指載體 pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR。U6 和 gapdh 作為上樣對(duì)照。所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。
[0072] 圖4顯示了天然內(nèi)源性hetRNA_Ubap21的篩選和驗(yàn)證。
[0073] 其中，（A)hetRNA_Ubap21的篩選示意圖。
[0074] (B)天然hetRNA_Ubap21過(guò)表達(dá)的證明。上圖的表達(dá)情況證實(shí)了內(nèi)含子剪接。 最后一條泳道的926bp和243bp條帶指剪接前后的PCR產(chǎn)物。剪接的確認(rèn)引物與載體匹 配，但不與前體匹配，如圖3(A)所示，其序列為1^)嫩6?和1^)嫩61? ;下圖指檢測(cè)成熟的 hetRNA_Ubap21。
[0075] (C)檢測(cè)小鼠組織中天然的內(nèi)源性hetRNAs。上圖，證明天然內(nèi)含子的剪接，引物 設(shè)計(jì)跨過(guò)內(nèi)含子（見(jiàn)實(shí)施例）。下圖檢測(cè)小鼠組織中的hetRNA-Ubap21。PCR引物設(shè)計(jì)用標(biāo) 準(zhǔn)的莖環(huán)引物法。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293FT細(xì)胞。PE指所用載體。U6和gapdh作為上樣對(duì) 照。所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。
[0076] 圖5顯示了天然內(nèi)源性hetRNA-Pccb的驗(yàn)證。
[0077] 其中，（A)天然內(nèi)源性hetRNA-Pccb利用細(xì)胞體系的驗(yàn)證示意圖。
[0078] (B)對(duì)應(yīng)于（A)中的核酸序列及結(jié)構(gòu)。箭頭表示天然內(nèi)含子插入hetRNA-Pccb前 體的位點(diǎn)。
[0079] (C)天然人hetRNA-Pccb過(guò)表達(dá)的證明。上圖的表達(dá)證實(shí)了內(nèi)含子剪接的證明。 最后一條泳道的217bp條帶指剪接后的PCR產(chǎn)物，剪接的確認(rèn)引物與載體匹配，但不與前體 匹配，如圖（A)所示，其序列為PCDNA6F和PCDNA6R ;下圖指檢測(cè)成熟的hetRNA-Pccb。
[0080] (D)檢測(cè)小鼠組織中天然的內(nèi)源性hetRNAs。hetRNA-Pccb序列在大鼠附睪小RNA 文庫(kù)的垃圾序列中發(fā)現(xiàn)。在大鼠睪丸中能夠被RT-PCR和測(cè)序證明。PCR引物設(shè)計(jì)用標(biāo)準(zhǔn)的 莖環(huán)引物法。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293FT細(xì)胞。PE指所用載體。U6和gapdh作為上樣對(duì)照。 所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

【具體實(shí)施方式】
[0081] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次開(kāi)發(fā)了一種RNA-hetRNA篩選系統(tǒng)，并利用 篩選系統(tǒng)，首次驗(yàn)證了在哺乳動(dòng)物等物種中，存在內(nèi)源性的含內(nèi)含子的hetRNA前體分子， 即hetRNA前體。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0082] 具體地，本發(fā)明人選取質(zhì)粒pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR作為載體，用含內(nèi)含子的 hetRNA前體序列作為受體，F(xiàn)ASTDIGEST限制性內(nèi)切酶作為消化酶，293FT細(xì)胞作為反應(yīng)器， STEM LOOP PCR作為表達(dá)檢測(cè)方法，形成一個(gè)完全的篩選技術(shù)系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快速經(jīng)濟(jì) 地檢測(cè)hetRNA的表達(dá)。
[0083] 術(shù)語(yǔ)
[0084] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明RNA"、"hetRNA"可互換使用，指由hetRNA前體所產(chǎn)生 的、長(zhǎng)度彡30nt的微RNA。通常，hetRNA的長(zhǎng)度為18-30nt。
[0085] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明前體"、"本發(fā)明的RNA前體"、"hetRNA前體"可互換使 用，指可產(chǎn)生所述hetRNA的RNA分子，該前體的特點(diǎn)是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)（也稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)）， 并且在前體的序列中含有插入的內(nèi)含子序列。所述hetRNA前體在剪接過(guò)程中，可剪切掉內(nèi) 含子序列，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度< 30nt的hetRNA。通常，hetRNA前體的長(zhǎng)度為50-200bp。
[0086] 應(yīng)理解，本發(fā)明前體可指RNA序列、DNA序列或RNA-DNA序列，也包括相應(yīng)的正義 序列或反義序列。
[0087] hetRNA
[0088] 本發(fā)明證實(shí)了，在未匹配的深度測(cè)序數(shù)據(jù)中，至少一部分序列是基因組轉(zhuǎn)錄來(lái)的 hetRNA前體，它被一個(gè)內(nèi)含子所隔開(kāi)。
[0089] 如圖1所示，在未匹配的深度測(cè)序數(shù)據(jù)中，基因組轉(zhuǎn)錄來(lái)的轉(zhuǎn)錄物（hetRNA前體） 被一個(gè)內(nèi)含子所隔開(kāi)。不象典型的miRNA和mirtron前體，產(chǎn)生的成熟hetRNA是前體中的 內(nèi)含子被剪接后所形成的產(chǎn)物。
[0090] 天然hetRNA的鑒別
[0091] 本發(fā)明提供了一種鑒別各物種中，天然存在的或內(nèi)源性hetRNA的方法和系統(tǒng)。
[0092] 參見(jiàn)圖2, 一種代表性的方法包括：
[0093] 通過(guò)對(duì)RNA深度測(cè)序小RNA數(shù)據(jù)的"垃圾"數(shù)據(jù)在NCBI網(wǎng)站上對(duì)標(biāo)準(zhǔn)RNA使用 BLAST，然后選取能夠匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA (reference RNA)(也可稱為參照RNA);
[0094] 將匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA再與基因組序列（同一物種）進(jìn)行基因組的BLAST，選出在基 因組中被內(nèi)含子所分隔的序列作為目標(biāo)序列；
[0095] 將目標(biāo)序列用the mFold Server網(wǎng)站進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，選取前體有莖環(huán)結(jié)構(gòu) 的內(nèi)含子打斷的微RNA作為以后實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的候選分子；
[0096] 對(duì)所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，測(cè)定其形成hetRNA的能力，其中，如果所述 RNA能夠形成hetRNA，則表示所形成的微RNA是hetRNA，而相應(yīng)的RNA序列是hetRNA前體。
[0097] 在本發(fā)明方法中，可使用商業(yè)化的或公開(kāi)的數(shù)據(jù)庫(kù)，也可使用通過(guò)常規(guī)方法構(gòu)建 的數(shù)據(jù)庫(kù)。代表性的數(shù)據(jù)庫(kù)包括（但并不限于）NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)等。例如，網(wǎng)站blast可使用 地址：http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/ ;mFold Server 網(wǎng)站可使用地址：http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold〇
[0098] 篩選系統(tǒng)和測(cè)定方法
[0099] 本發(fā)明還提供了一種用于本發(fā)明方法的篩選系統(tǒng)（RNA-hetRNA篩選系統(tǒng)）。
[0100] -種代表性的RNA-hetRNA的篩選系統(tǒng)包括：
[0101] (a)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用于插入對(duì)應(yīng)于待篩選RNA分子的DNA序列；
[0102] (b)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，所述的轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞用于轉(zhuǎn)入所述的轉(zhuǎn)染受體，并且將所述轉(zhuǎn) 染質(zhì)粒中所插入的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA ;
[0103] (c)任選的抽提細(xì)胞總RNA的試劑；
[0104] (d)任選的進(jìn)行STEM-LOOP PCR的試劑。
[0105] 一種代表性的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)測(cè)定方法包括：
[0106] (el)提供質(zhì)粒（例如pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR)作為轉(zhuǎn)染載體；
[0107] (e2)用多個(gè)引物對(duì)（含前體序列及插入其中的intron序列），通過(guò)PCR拼接形成 序列X，或商業(yè)化人工合成所述序列X，其中該序列X包含待測(cè)定的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的hetRNA 前體序列；
[0108] (e3)用合適內(nèi)切酶分別酶切質(zhì)粒和序列X ;
[0109] (e4)將上述序列X亞克隆進(jìn)所述載體；
[0110] (e5)將步驟（e4)所得到質(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適的轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞（如293FT細(xì)胞）；
[0111] (e6)用TRIZ0L試劑提取細(xì)胞總RNA ;
[0112] (e7)將步驟（e6)所得RNA用STEM-LOOP PCR方法檢測(cè)目標(biāo)hetRNA的表達(dá)。
[0113] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0114] (a)提供了一種篩選天然hetRNA的方便可行的路徑和方法，為將來(lái)大規(guī)模的發(fā)現(xiàn) 驗(yàn)證hetRNA提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。
[0115] (b)首次證實(shí)了包括人在內(nèi)的物種中，存在hetRNA前體以及所述hetRNA前體可產(chǎn) 生長(zhǎng)度< 30nt的hetRNA。為研究hetRNA及其前體的功能奠定了基礎(chǔ)。
[0116] (c)為從廢棄的微RNA深度測(cè)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘新型微RNA提供了一種新思路。
[0117] (d)打破了基因測(cè)序結(jié)果分析中傳統(tǒng)以與基因組匹配為標(biāo)準(zhǔn)的黃金準(zhǔn)則，建議改 為以RNA和基因組雙重匹配為標(biāo)準(zhǔn)。
[0118] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0119] 材料和通用方法
[0120] 1.主要試劑
[0121] pcDNA6· 2_GW/EmGFP-miR :購(gòu)自 INVITRIGEN。
[0122] 限制性內(nèi)切酶 Fast-Digest :購(gòu)自 Fermentas。
[0123] 2.試驗(yàn)方法
[0124] 2.1質(zhì)粒構(gòu)建
[0125] 質(zhì)粒pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR-X的產(chǎn)生。序列X由上海博尚生物技術(shù)公司合成， 然后亞克隆進(jìn)載體 pcDNA6. 2-GW/EmGFP(Invitrogen，UK)的 Hind III 和 EcoR I 位點(diǎn)。 質(zhì)粒pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR-Y的產(chǎn)生。序列Y用引物對(duì)通過(guò)PCR，然后亞克隆進(jìn)載體 pcDNA6.2_GW/EmGFP(Invitrogen，UK)的 BamHI and Xhol 位點(diǎn)。為了成功的構(gòu)建質(zhì)粒，不 要選用通常所的限制性內(nèi)切酶，而要選用Fast-Digest系統(tǒng)（如Fermentas, Canada)來(lái)作 用于特別復(fù)雜的雙發(fā)夾前體結(jié)構(gòu)的。X序列用于構(gòu)建人工模型，Y序列用于鑒定內(nèi)源性的 hetRNAs。所有的序列最終均過(guò)測(cè)序確認(rèn)（Biosune，China)。
[0126] X序列如下：
[0127] Mir-1955-hmirtron_1224 前體：
[0128] ctggtttacttactacaagtcccag gtgaggactcgggaggtggagggtggtgccgccggggc cgggcgctgtttcagctcgcttctccccccacctcctctctcctcag gatgcactgcagctttttcttaa cttcagacaagagcattgcatgctgggacatgtagttggtttaaatagca(SEQ ID NO:1)
[0129] 其中，粗體為 intron hmirtron-1224;非粗體部分為 mir_1955precursor ;下劃線 部分是成熟的 mir-1955(agtcccaggatgcactgcagctttt，SEQ ID N0:2);斜體堿基為突變堿 基。
[0130] Y序列如下：
[0131] HetRNA_Ubap21前體序列（含天然內(nèi)含子），PCR擴(kuò)增用小鼠Raw264. 7細(xì)胞基因 組DNA為模板。引物如下：
[0132] Pre-hetRNA-Ubap21_F:catcgcggatcctcagtcgacaacttatacctcccaa(SEQ ID NO:3);
[0133] Pre-hetRNA-Ubap21in-R:gaaccgctcgagaccttcaacagattgcgtggtctg (SEQ ID NO:4)〇
[0134] HetRNA_Ubap21前體序列（不含天然內(nèi)含子），用Trizol法抽提的Raw264. 7細(xì)胞 總RNA轉(zhuǎn)錄來(lái)的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得。其中，引物如下：
[0135] hetRNA-Ubap21-F:CATCGCGGATCCtcagtcgacaacttatacctcccaa(SEQ ID NO. :5);
[0136] hetRNA-Ubap21in-R:GAACCGCTCGAGactgtttcattgagagagggtatact(SEQ ID NO. : 6)。
[0137] hetRNA-Pccb的前體序列（含或不含天然內(nèi)含子）均用HEK293FT細(xì)胞，其中不含 天然內(nèi)含子的前體序列擴(kuò)增所使用的是Trizol法抽提的細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)錄來(lái)的cDNA為模 板，前體含天然內(nèi)含子的序列擴(kuò)增則使用細(xì)胞基因組DNA為模板。擴(kuò)增hetRNA前體及前體 含內(nèi)含子的引物如下：
[0138] hhetRNA-Pccb-F:TCACCGGAATTCgtcacagtcatcaccaggaa(SEQ ID NO. :7);
[0139] hhetRNA_Pccb-R:GTACCCAAGCTTtagttggtatcaccacaaaggtgc(SEQ ID NO. :8)。
[0140] 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0141] HEK293T細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室保存或常規(guī)市售）用培養(yǎng)其常規(guī)的市售培養(yǎng)基Dulbecco' s modified Eagle's medium(DMEM)，其中含 10% 胎牛血清（Hyclone，USA)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用 Lipofectamine2000 (Invitrogen，UK)，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0142] E14T小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs)(購(gòu)自Austin Smith)用無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)。E14T小鼠 胚胎干細(xì)胞用懸滴法誘導(dǎo)向心肌的自發(fā)分化。簡(jiǎn)單講，ESCs被胰酶消化（D0)并懸浮培養(yǎng) 在培養(yǎng)基中，沒(méi)有LIF for2days (D2)，接下懸浮培養(yǎng)四天，胚狀體鋪板于明膠覆蓋的培養(yǎng)盤(pán) (D6)當(dāng)出現(xiàn)自發(fā)收縮的買心肌細(xì)胞時(shí)收集樣品D9。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品用于提取RNA。
[0143] RNA 分離和 RT-PCR
[0144] 小鼠或培養(yǎng)的細(xì)胞總RNA用TRIzol提?。ㄙ?gòu)自Invitrogen，UK)，用Super Script II reverse transcriptase(Invitrogen，UK)反轉(zhuǎn)錄 cDNA，其中 miRNA用特異性莖環(huán)引物， mRNA和u6用隨機(jī)引物，mRNA和gapdh用oligo dT。PCR擴(kuò)增必須用高保真的K0D-PLUS DNA polymerase(Toyobo，Japan)。所有操作根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序確認(rèn) (Invitrogen，UK)〇
[0145] 引物如下（5'to3'）：
[0146]

【權(quán)利要求】
1. 一種構(gòu)建用于hetRNA篩選的數(shù)據(jù)庫(kù)的方法，其特征在于，所述方法包括： (a) 提供一微小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)， 其中所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號(hào)為jO 的RNA序列，jO為1-nO的正整數(shù)，nO為所述微小數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列總數(shù)，并且RNAjO是 未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)不包括已驗(yàn)證或證實(shí)的 hetRNA和已知小RNA的RNA序列； (b) 將所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列RNAjO,與標(biāo)準(zhǔn)RNA (reference RNA或 RefSeq RNA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而在所述標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中排除與各RNA序列RNAjO不匹 配的標(biāo)準(zhǔn)RNA序列，并選取標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中與RNAjO匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA，并將對(duì)應(yīng)于該匹配 的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列組成一級(jí)RNA篩選庫(kù)（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)，其中，所述 標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列的結(jié)構(gòu)如式I所示： X-SEQ碰J0-Y (I) 式中， SEQ?^為相匹配的RNAjO的核苷酸序列； X為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接上游的長(zhǎng)度為50-100bp的核苷酸序列； Y為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接下游的長(zhǎng)度為50-100bp的核苷酸序列； 為連接X(jué)和SEQK_以及連接SEQK_和Y的鍵； 其中所述一級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列記為RNAjl，其中，RNAjl表 示序號(hào)為jl的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數(shù)，nl為一級(jí)RNA篩選庫(kù)中的 RNA序列總數(shù)； (c) 將所述一級(jí)篩選庫(kù)中的RNAj 1，與基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而排除不含有內(nèi) 含子的RNA序列，并且選取內(nèi)含子要位于成熟微RNA序列之中的RNA序列，組成二級(jí)RNA篩 選庫(kù)， 其中所述二級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號(hào)為j2的 RNA序列，其中j2為1-η2的正整數(shù)，n2為二級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)； (d) 將所述二級(jí)篩選庫(kù)中的RNAj2序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，排除無(wú) 法形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，并將所述二級(jí)篩選庫(kù)中可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列組成三級(jí) RNA篩選庫(kù)，即用于hetRNA篩選的數(shù)據(jù)庫(kù)， 其中，所述三級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號(hào)為j3的RNA序 列，其中j3為l_n3的正整數(shù)，n3為三級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列長(zhǎng) 度為 18-30nt。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（d)中還包括：將所述微小RNA測(cè)序 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)于RNAjO的各RNA序列組成相應(yīng)的成熟hetRNA庫(kù)。
4. 一種鑒定由包含內(nèi)含子的hetRNA前體產(chǎn)生的成熟hetRNA的方法，其特征在于，包括 步驟： (a)提供一微小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)， 其中所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號(hào)為jO 的RNA序列，jO為Ι-nO的正整數(shù)，nO為所述微小數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列總數(shù)，并且RNAjO是 未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)不包括已驗(yàn)證或證實(shí)的 hetRNA和已知小RNA的RNA序列； (b) 將所述微小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的各RNA序列RNAjO,與標(biāo)準(zhǔn)RNA (reference RNA或 RefSeq RNA)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而在所述標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中排除與各RNA序列RNAjO不匹 配的標(biāo)準(zhǔn)RNA序列，并選取標(biāo)準(zhǔn)RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中與RNAjO匹配的標(biāo)準(zhǔn)RNA，并將對(duì)應(yīng)于該匹配 的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列組成一級(jí)RNA篩選庫(kù)（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)，其中，所述 標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列的結(jié)構(gòu)如式I所示： X-SEQ碰J0-Y (I) 式中， SEQ?^為相匹配的RNAjO的核苷酸序列； X為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接上游的長(zhǎng)度為50-100bp的核苷酸序列； Y為所述標(biāo)準(zhǔn)RNA中位于所述RNAjO直接下游的長(zhǎng)度為50-100bp的核苷酸序列； 為連接X(jué)和SEQK_以及連接SEQK_和Y的鍵； 其中所述一級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列記為RNAjl，其中，RNAjl表 示序號(hào)為jl的標(biāo)準(zhǔn)RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數(shù)，nl為一級(jí)RNA篩選庫(kù)中的 RNA序列總數(shù)； (c) 將所述一級(jí)篩選庫(kù)中的RNAj 1，與基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而排除不含有內(nèi) 含子的RNA序列，并且選取內(nèi)含子要位于成熟微RNA序列之中的RNA序列，組成二級(jí)RNA篩 選庫(kù)， 其中所述二級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號(hào)為j2的 RNA序列，其中j2為1-η2的正整數(shù)，n2為二級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)； (d) 將所述二級(jí)篩選庫(kù)中的RNAj2序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，排除無(wú) 法形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，并將所述二級(jí)篩選庫(kù)中可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列組成三級(jí) RNA篩選庫(kù)， 其中，所述三級(jí)RNA篩選庫(kù)所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號(hào)為j3的RNA序 列，其中j3為l_n3的正整數(shù)，n3為三級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNA序列總數(shù)；和 (e) 對(duì)三級(jí)RNA篩選庫(kù)中的RNAj 3序列，測(cè)定其形成hetRNA的能力，其中，如果所 述RNAj3能夠形成hetRNA，則所述的RNAj3是包含內(nèi)含子的hetRNA前體，而其所形成的 hetRNA 為成熟 hetRNA。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的hetRNA來(lái)源于選自下組的物種：哺 乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行動(dòng)物、昆蟲(chóng)。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物包括人、哨齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)目、 牛、羊、豬、狗、貓。
7. -種鑒定候選RNA序列是否是包含內(nèi)含子的hetRNA前體的方法，其特征在于，包括 步驟： (i) 構(gòu)建一表達(dá)載體，所述質(zhì)粒攜帶對(duì)應(yīng)于待鑒定的RNA序列的DNA序列并可將所述 DNA序列表達(dá)為RNA序列，其中所述的待鑒定的RNA序列包含內(nèi)含子； (ii) 用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，并培養(yǎng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞； (iii) 鑒別所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞中hetRNA，從而確定所述待鑒定的RNA序列是否 是包含內(nèi)含子的hetRNA前體，其中，如果與對(duì)照的受體細(xì)胞相比，并經(jīng)測(cè)序列證明，在經(jīng)轉(zhuǎn) 染的受體細(xì)胞中形成了對(duì)應(yīng)于所述待鑒定的RNA序列的hetRNA序列，則表示待鑒定的RNA 序列是包含內(nèi)含子的hetRNA前體，而所形成的hetRNA為成熟hetRNA。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟（iii)中，鑒別步驟包括：抽提所述 經(jīng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞的總RNA ;PCR擴(kuò)增待驗(yàn)證的成熟hetRNA序列；以及對(duì)上述PCR擴(kuò)增序列 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
9. 一種用權(quán)利要求4所述的方法所鑒別出的微RNA分子或微RNA分子的前體。
10. 如權(quán)利要求9所述的微RNA分子，其特征在于，所述的微RNA分子的序列如SEQ ID NO. : 22或23所示的hetRNA ;或 所述的微RNA分子前體的序列如SEQ ID NO. : 24或25所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104123480SQ201310153531
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月27日
【發(fā)明者】荊清, 李湘麒, 李粵 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院