精神分裂癥的基因標(biāo)志物及其使用方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組可用于診斷精神分裂癥的標(biāo)志基因，所述標(biāo)志基因可用于制備診斷精神分裂癥的檢測(cè)試劑或檢測(cè)試劑盒?；谠摌?biāo)志基因，本發(fā)明還提供了用于診斷精神分裂癥的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)試劑和基因芯片或陣列，以及利用該標(biāo)志基因診斷精神分裂癥的方法。本發(fā)明的方法簡便易行，診斷結(jié)果可靠并且兼顧了靈敏度和特異度。
【專利說明】精神分裂癥的基因標(biāo)志物及其使用方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及用于精神分裂癥的基因標(biāo)志物及其 使用方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 精神分裂癥（Schizophrenia)是一種常見的精神疾病，全球人群中的患病率為 0. 3%-0. 7%[1]。精神分裂癥多起病于青壯年，常有感知、思維、情感、行為等多方面的障礙和 精神活動(dòng)的不協(xié)調(diào)，嚴(yán)重影響患者的身體功能和生活質(zhì)量。盡管一些患者可以通過治療得 以康復(fù)，但大多數(shù)會(huì)經(jīng)歷長期反復(fù)發(fā)作，因此精神分裂癥不僅是個(gè)人的疾病，同時(shí)也是一個(gè) 不可小覷的社會(huì)問題，對(duì)其家庭、衛(wèi)生保健系統(tǒng)和整個(gè)社會(huì)都會(huì)造成明顯的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0003] 目前，臨床上對(duì)精神分裂癥的診斷主要是根據(jù)病人的詳細(xì)病史與精神癥狀，再參 考其發(fā)病年齡、病期、病程等來做綜合判斷，因此總體上是一個(gè)依賴于醫(yī)生主觀經(jīng)驗(yàn)的過 程，診斷結(jié)果常常因人而異。為了使精神分裂癥的診斷更加客觀化，提高診斷的一致性和準(zhǔn) 確度，近年來，世界各地的科研工作者一直致力于尋找精神分裂癥的生物標(biāo)志物，建立有效 的檢測(cè)方法。生物標(biāo)志物指可供客觀測(cè)定和評(píng)價(jià)的普通生理或病理或治療過程中的某種特 征性的生化指標(biāo)，通過對(duì)它的測(cè)定可以獲知機(jī)體當(dāng)前所處的生物學(xué)過程中的進(jìn)程。生物標(biāo) 志物的化學(xué)本質(zhì)可以是DNA、RNA、蛋白或代謝物，一般從體液獲得。將生物標(biāo)志物應(yīng)用于精 神分裂癥，可以有效輔助當(dāng)前診斷中不確定的人為因素，減少錯(cuò)/誤診率并有助于指導(dǎo)用 藥和康復(fù)過程。
[0004] 因此，本領(lǐng)域急需可用于診斷精神分裂癥的生物標(biāo)志物，該標(biāo)志物應(yīng)該是可靠，還 應(yīng)具備良好的靈敏度和特異度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于可靠、靈敏和特異地診斷精神分裂癥的生物標(biāo) 志物以及利用所述生物標(biāo)志物診斷精神分裂癥的方法。
[0006] 在第一方面，本發(fā)明提供選自下組中至少一種基因的用途，所述基因用于制備診 斷精神分裂癥的檢測(cè)試劑或檢測(cè)試劑盒：
[0007] (a)其核苷酸序列如SEQ ID N0:1、2、3所示的基因；或
[0008] (b)含有與（a)所述基因的核苷酸序列至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選 99%序列相同性的基因。
[0009] 在一優(yōu)選例中，所述基因是SEQ ID N0:l、2或3。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中任意兩種基因的組合。
[0011] 在進(jìn)一步的優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中三種基因的組合。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑是探針、引物、核酸芯片或陣列。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述探針是 taqman_MGB(minorgroove binder oligodeoxynucleotide conjugate, MGB-0DN)探針。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述芯片是Taqman微流體芯片。
[0015] 在第二方面，本發(fā)明提供一種用于診斷精神分裂癥的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0016] (1)檢測(cè)選自下組中至少一種基因的檢測(cè)試劑；和
[0017] (2)描述利用（1)所述檢測(cè)試劑檢測(cè)選自下組中至少一種基因的使用方法的使用 說明書；
[0018] 所述基因是：
[0019] (a)其核苷酸序列如SEQ ID N0:1、2、3所示的基因；或
[0020] (b)含有與（a)所述基因至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選99%序列相同 性的核苷酸序列的基因。。
[0021] 在一優(yōu)選例中，所述基因是SEQ ID N0:l、2或3。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中任意兩種基因的組合。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中三種基因的組合。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑是探針、引物、核酸芯片或陣列。
[0025] 在第三方面，本發(fā)明提供一種核酸芯片或陣列，所述芯片或陣列上具有檢測(cè)選自 下組中至少一種基因的探針：
[0026] (a)其核苷酸序列如SEQ ID N0:1、2、3所示的基因；或
[0027] (b)含有與（a)所述基因至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選99%序列相同 性的核苷酸序列的基因。
[0028] 在一優(yōu)選例中，所述基因是SEQ ID N0:l、2或3。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中任意兩種基因的組合。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中三種基因的組合。
[0031] 在第四方面，本發(fā)明提供一種精神分裂癥的診斷方法，所述方法包括檢測(cè)選自下 組中至少一種基因的表達(dá)量是否降低：
[0032] (a)其核苷酸序列如SEQ ID N0:1、2、3所示的基因；或
[0033] (b)含有與（a)所述基因至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選99%序列相同 性的核苷酸序列的基因。
[0034] 在一優(yōu)選例中，所述基因是SEQ ID N0:l、2或3。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中任意兩種基因的組合。
[0036] 在進(jìn)一步的優(yōu)選例中，所述基因是（a)或（b)中三種基因的組合。
[0037] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1顯示了 RNA反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟。
[0039] 圖2顯示了定制芯片的示意圖（陰影部分為與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的小孔反應(yīng)室）。
[0040] 圖3顯示了 Realtime-PCR擴(kuò)增曲線圖。
[0041] 圖4顯示了 3個(gè)基因在訓(xùn)練集的正常和疾病組中的表達(dá)量箱式圖。
[0042] 圖5顯示了訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的ROC曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者中ZNF184、 ZSCAN12和HIST1H4I基因的mRNA表達(dá)量均顯著降低，從而利用該3個(gè)基因?yàn)樯飿?biāo)志物可 以有效區(qū)分精神分裂癥患者和正常人，進(jìn)而可用于診斷精神分裂癥。在此基礎(chǔ)上完成了本 發(fā)明。
[0044] 1.術(shù)語定義
[0045] 本文所用的術(shù)語"標(biāo)志基因"或"精神分裂癥標(biāo)志基因"或類似的術(shù)語在本文可以 互換使用，它們具有相同的含義，均表示可用于診斷精神分裂癥的基因；換言之，該基因的 表達(dá)量顯著降低可以作為診斷精神分裂癥的指標(biāo)。
[0046] 本文用于描述標(biāo)志基因表達(dá)量的術(shù)語"顯著降低"表示，與取自健康對(duì)象的血液白 細(xì)胞中標(biāo)志基因或其變體的表達(dá)水平相比，該標(biāo)志基因的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低或 不足。具體地說，就是用統(tǒng)計(jì)學(xué)上的Student' s t檢驗(yàn)來比較健康對(duì)象和病人的血液白細(xì) 胞中標(biāo)志基因的表達(dá)水平，若得出的P值小于0. 05,則認(rèn)為兩者的差別達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的 顯著水平。
[0047] "引物"表示當(dāng)與DNA的一條鏈配對(duì)時(shí)在有合適的聚合試劑存在下能啟動(dòng)引物延 伸產(chǎn)物合成的寡核苷酸。為使擴(kuò)增效率最大，引物優(yōu)選單鏈，但或者可以是雙鏈。引物足夠 長從而能在聚合試劑存在時(shí)引發(fā)合成延伸產(chǎn)物。引物的長度取決于許多因素，包括：應(yīng)用領(lǐng) 域、所采用的溫度、模板反應(yīng)條件、其它試劑和引物來源?？蛇x出與模板序列"基本上互補(bǔ)" 的引物，設(shè)計(jì)這些引物設(shè)計(jì)能與模板雜交并用作合成的起點(diǎn)。"基本上互補(bǔ)"表示該引物的 互補(bǔ)性足夠與靶多核苷酸雜交。引物和所設(shè)計(jì)的與其雜交的模板最好不含錯(cuò)配，但這不是 必需的。例如，可將非互補(bǔ)核苷酸殘基連接在引物的5'末端，而該引物序列的其余部分與 模板互補(bǔ)。鑒于本領(lǐng)域的現(xiàn)有知識(shí)以及本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的 基因和具體需求自主設(shè)計(jì)引物。
[0048] 本文所用的術(shù)語"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的 分子。除非另有指出，術(shù)語"探針"通常指能通過互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸（往往稱為 "靶多核苷酸"）結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完 全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。
[0049] 例如，在具體的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明利用taqman_MGB(minorgroove binder oligodeoxynucleotide conjugate, MGB-0DN)探針。TaqMan 探針是一條和模版互補(bǔ)的基因 特異性探針，探針上5'端和3'端分別標(biāo)記了一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)（供體）和一個(gè)淬滅熒光基 團(tuán)（受體），在反應(yīng)初始（探針完整）時(shí)系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號(hào)被臨近的淬滅基 團(tuán)吸收，所以此時(shí)檢測(cè)不到供體熒光信號(hào)；而當(dāng)PCR過程中TaqDNA聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合 模版的位點(diǎn)時(shí)，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針5'端的報(bào)告基 團(tuán)-游離的報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激發(fā)報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)就可 以被熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。這樣每擴(kuò)增一條DNA鏈，就對(duì)應(yīng)有一個(gè)游離的熒光分子（報(bào)告 基團(tuán)）形成，保證了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，因此對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè) 就可以實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR的過程，準(zhǔn)確定量PCR的起始拷貝數(shù)。MGB探針3'端采用了非熒光性 的淬滅基因-淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號(hào)的干擾。此 夕卜，MGB探針的3'端還連接了一個(gè)二氫環(huán)化卩引哚卩卜啉-三肽（dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值，使較短的探針同樣能 達(dá)到較高的Tm值-而短探針的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，熒光 背景更低，使得信噪比更高：一個(gè)15bp的MGB探針的信噪比大于6。
[0050] 當(dāng)然，鑒于本領(lǐng)域的現(xiàn)有知識(shí)以及本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)本 發(fā)明的基因和具體需求設(shè)計(jì)其它可用于實(shí)施本發(fā)明的探針，而不限于本發(fā)明實(shí)施例中具體 使用的探針。
[0051] 本文所用的術(shù)語"芯片"或"陣列"在本文可以互換使用，它們具有相同的含義，均 表示具有寡核苷酸探針的基板，在該基板表面的已知不連續(xù)位置沉積了不同的已知序列。 例如，該基板可以是如美國專利號(hào)5, 424, 186所述的兩維基板形式。這種基板可用于合成 兩維空間尋址的寡核苷酸（矩陣）陣列?；蛘?，該基板的特征在于通過將兩維平面的薄片 卷成三維管狀構(gòu)型而形成管狀陣列。該基板也可采取與光纖表面相連的微球或珠形式，例 如Chee等在W000/39587中所述的那樣。這些寡核苷酸陣列至少具有兩種不同的元件，其 密度為每cm 2至少400個(gè)元件。在某些實(shí)施方案中，這些陣列的密度可以是每cm2約500、 至少一千、至少一萬、至少十萬、至少一百萬或至少一千萬個(gè)元件。例如，該基板可以是硅或 玻璃，具有載玻片或蓋玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物構(gòu)成。當(dāng)在該基板上進(jìn)行試驗(yàn) 的方法包括光檢測(cè)時(shí)，可用透光的基板。該術(shù)語也指探針陣列和與其相連形成芯片一部分 的基板。
[0052] 例如，在具體的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明利用Taqman微流體芯片，該芯片上預(yù)先 固定了引物和探針。同樣，鑒于本領(lǐng)域的現(xiàn)有知識(shí)以及本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可 以根據(jù)本發(fā)明的基因和具體需求設(shè)計(jì)其它可用于實(shí)施本發(fā)明的芯片，而不限于本發(fā)明實(shí)施 例中具體使用的。
[0053] 本文所用的術(shù)語"序列相同性"指二序列在比較窗上根據(jù)核苷酸對(duì)核苷酸的相同 性程度。因此，"序列相同性百分比"可通過以下步驟計(jì)算：在比較窗上比較兩條最佳比對(duì) 的序列，測(cè)定兩條序列中相同的核苷酸堿基（例如，A、T、C、G、I)的位置數(shù)得到匹配的位置 數(shù)，將匹配的位置數(shù)除以比較窗口的總位置數(shù)（即，窗口大?。?，再將結(jié)果乘以100得到序列 相同性百分比。為本發(fā)明的目的，應(yīng)將"序列相同性"理解為用DNASIS計(jì)算機(jī)程序（適用于 windows 的 2. 5版；購自 Hitachi Software engineering Co. , Ltd. , South San Francisco, 加利福尼亞，美國），采用該軟件所附參考手冊(cè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)（參數(shù)）計(jì)算的"匹配百 分比"。
[0054] 為比對(duì)比較窗口，可通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法（GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA， Wisconsin Genetics Software Package Release7.0, Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison, WI, USA)或通過目測(cè)和所選擇的各種方法之一產(chǎn)生的最佳比 對(duì)（即導(dǎo)致比較窗口上最高同源性百分比），對(duì)諸序列進(jìn)行最佳比對(duì)。也可參考如Altschul 等，1997, Nucl. Acids Res. ,25:3389所述的BLAST程序族進(jìn)行比對(duì)。序列分析的詳述可見 Ausubel 等，《最新分子生物學(xué)方法》（Current Protocols in Molecular Biology)的第 15 章，第 19. 3 單兀，John Wiley&Sons Inc，1994-1998。
[0055] 2.本發(fā)明的精神分裂癥標(biāo)志基因及其應(yīng)用
[0056] 本發(fā)明的目的在于研究和尋找輔助精神分裂癥疾病診斷的生物標(biāo)記物，采用ROC 曲線（receiver operating characteristic curve)工具來衡量生物標(biāo)志物組合性能的 高低。疾病診斷是區(qū)分病人和正常人的問題，在數(shù)學(xué)上是一個(gè)二分問題，即將實(shí)例分成陽 性（positive)或陰性（negative),因此生物標(biāo)志物組合實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于一個(gè)分類器。分 類的正誤，會(huì)出現(xiàn)四種情況：如果一個(gè)實(shí)例是陽性并且被預(yù)測(cè)成陽性，即為真陽性（True Positive，TP);如果實(shí)例是陰性但被預(yù)測(cè)成陽性，稱之為假陽性（False Positive，F(xiàn)P)。相 應(yīng)地，如果實(shí)例是陰性且被預(yù)測(cè)成陰性，稱之為真陰性（True Negative，TN)，陽性但被預(yù)測(cè) 成陰性則為假陰性（False Negative, FN)。分類器的分類能力，以靈敏度（sensitivity)和 特異度（specificity)來衡量。其中，靈敏度亦即真陽性率（true positive rate, TPR)， 計(jì)算公式為TPR=TPATP+FN)，表示分類器所識(shí)別出的陽性實(shí)例占所有陽性實(shí)例的比例。特 異度亦即真陰性率（True Negative Rate，TNR)，計(jì)算公式為TNR=TNAFP+TN)，表示分類器 所識(shí)別出的陰性實(shí)例占所有陰性實(shí)例的比例。對(duì)于一個(gè)具體的分類器，確定了分類的閥值 就確定了相應(yīng)的靈敏度和特異度。假設(shè)閥值以上判斷為陽性，閥值以下判斷為陰性，那么減 小閥值固然固然能識(shí)別出更多的陽性個(gè)體，也就是提高了識(shí)別出的陽性實(shí)例占所有陽性實(shí) 例的比例（即靈敏度，TPR)，但同時(shí)也將更多的陰性實(shí)例當(dāng)作了陽性實(shí)例，降低了特異度。 改變分類器的閥值，將對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度描繪在以1-特異度為橫坐標(biāo)、靈敏度為縱坐 標(biāo)的二維空間，就繪制出R0C曲線。R0C曲線最重要的屬性是曲線下面積（Area under the curve，AUC)。根據(jù)AUC的大小將分類器分為四個(gè)等級(jí)：
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 選自下組中至少一種基因的用途，其特征在于，所述基因用于制備診斷精神分裂癥 的檢測(cè)試劑或檢測(cè)試劑盒： (a) 其核苷酸序列如SEQ ID N0:l、2、3所示的基因；或 (b) 含有與（a)所述基因的核苷酸序列至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選99% 序列相同性的基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因是（a)或（b)中任意兩種基因的組 合。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因是（a)或（b)中三種基因的組合。
4. 一種用于診斷精神分裂癥的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1) 檢測(cè)選自下組中至少一種基因的檢測(cè)試劑；和 (2) 描述利用（1)所述檢測(cè)試劑檢測(cè)選自下組中至少一種基因的使用方法的使用說明 書； 所述基因是： (a) 其核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1、2、3所示的基因；或 (b) 含有與（a)所述基因至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選99%序列相同性的 核昔酸序列的基因。
5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述基因是（a)或（b)中任意兩種基因的 組合。
6. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述基因是（a)或（b)中三種基因的組 合。
7. -種核酸芯片或陣列，其特征在于，所述芯片或陣列上具有檢測(cè)選自下組中至少一 種基因的探針： (a) 其核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1、2、3所示的基因；或 (b) 含有與（a)所述基因至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選99%序列相同性的 核昔酸序列的基因。
8. 如權(quán)利要求7所述的芯片或陣列，其特征在于，所述基因是（a)或（b)中任意兩種基 因的組合。
9. 如權(quán)利要求7所述的芯片或陣列，其特征在于，所述基因是（a)或（b)中三種基因的 組合。
10. -種精神分裂癥的診斷方法，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)選自下組中至少一種 基因的表達(dá)量是否降低： (a) 其核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1、2、3所示的基因；或 (b) 含有與（a)所述基因至少有85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，最優(yōu)選99%序列相同性的 核苷酸序列的基因。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104120172SQ201310157051
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】萬春玲, 孫麗雅, 青穎, 楊侖 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué), 上海佰臻生物科技有限公司