專利名稱：穿過上皮和/或內(nèi)皮層的scFV抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有針對組織穿透性的改進(jìn)特征的scFv抗體，及其在診斷和治療依賴于選定抗原的過量表達(dá)的疾病中的局部應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及特異性結(jié)合并滅活所述選定抗原的抗體。相關(guān)信息將本申請文件通篇中提到的任何專利、專利申請及參考文獻(xiàn)的內(nèi)容均通過弓I用整體并入本文。
背景技術(shù)：
可通過局部應(yīng)用必需能穿透上皮組織的藥物實(shí)施很多疾病的局部治療。鄰近上皮細(xì)胞通過緊密連接被密封，以防止大多數(shù)可溶分子從上皮片層(sheet)的一側(cè)穿到另一側(cè)(Alberts et al., Molecular Biology of the cell, 2nd ed.)。緊密連接在細(xì)胞旁(paracellular)屏障的形成和保持，及簡單上皮和內(nèi)皮中的細(xì)胞極性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它們還在血腦屏障中發(fā)揮重要作用，它們在其中控制出腦或入腦的物質(zhì)。大分子量藥物需要穿過這些組織屏障，以進(jìn)入它們的作用位點(diǎn)?？贵w通常太大，無法穿過上皮細(xì)胞層的緊密連接。作為機(jī)體正?；钚缘囊徊糠?，緊密連接響應(yīng)若干種信號(既有細(xì)胞內(nèi)，也有細(xì)胞外的)選擇性地開閉。這使大分子穿過，或甚至使整個細(xì)胞穿過緊密連接屏障。相比注射及其他施用模式而言，粘膜施用治療化合物通常可提供某些優(yōu)點(diǎn)，例如在方便性和遞送速度方面，及降低或消除涉及通過注射的遞送的副作用和依從性問題。但生物活性劑的粘膜遞送受到粘膜屏障功能及其他因素的限制。因此，粘膜藥物施用一般需要大于注射施用的藥物量。其他治療化合物，包括大分子藥物、肽和蛋白通常都是難于粘膜遞送的。藥物在不借助遞送增強(qiáng)劑的情況下透過粘膜表面的能力似乎與多種因素相關(guān)，包括分子大小、脂溶性和離子化。小于約300-1000道爾頓的小分子通常能穿透粘膜屏障，但隨著分子大小的增加，透過性迅速降低。脂溶性化合物通常比非脂溶性分子更能透過粘膜表面。肽和蛋白的脂溶性差，因此表現(xiàn)出的穿過粘膜表面的吸收性也差。US2006062758提供了組合物和方法，其包含生物活性劑和有效增強(qiáng)生物活性劑在哺乳動物受試者中的粘膜遞送的透過性肽。所述透過性肽一般通過調(diào)節(jié)受試者粘膜上皮表面的上皮連接結(jié)構(gòu)和/或生理而可逆增強(qiáng)粘膜上皮細(xì)胞旁運(yùn)送。 能調(diào)節(jié)上皮緊密連接功能的肽之前已有描述(Johnson, P.H.and Quay, S.C.,2000)。CA2379661提供了細(xì)胞旁藥物遞送系統(tǒng)，其包含源于Caludin-6的肽。Claudin代表了位于緊密連接處且提供屏障功能的整合膜蛋白的超家族。由于抗體能 以高親和力與其抗原特異性結(jié)合，因此是用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究的強(qiáng)大工具，其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥診斷和治療?？贵w一般由通過二硫鍵相互共價(jià)連接的兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成。包含三個互補(bǔ)區(qū)域(CDR)的高度可變結(jié)構(gòu)域位于每條鏈的N-末端。重鏈和輕鏈可變區(qū)協(xié)同決定抗體的抗原特異性。已通過用編碼柔性氨基酸接頭的間隔序列連接編碼可變重(VH)結(jié)構(gòu)域和可變輕鏈(VL)結(jié)構(gòu)域的DNA序列而設(shè)計(jì)出單鏈抗體(scFv) (Bird et al.，1988)。這種形式優(yōu)于傳統(tǒng)全長抗體，因?yàn)閟cFv由單個基因編碼，可易于引入突變，所得scFv可在酵母和原核系統(tǒng)中表達(dá)，這使可通過簡單的分子生物學(xué)方法快速篩選針對幾乎任何表位的高親和力特異性結(jié)合子(binder)。由于scFv抗體缺乏效應(yīng)子功能,它們不會通過抗體依賴性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(分別是ADCC或CDCC)而發(fā)揮毒性作用，并與全長抗體不同，scFv抗體表現(xiàn)出良好的組織穿透能力。已針對多種不同抗體產(chǎn)生了很多單鏈抗體(scFv)，尤其因?yàn)榭墒褂弥T如噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)或核糖體呈現(xiàn)技術(shù)之類技術(shù)易于針對高結(jié)合能力對它們進(jìn)行選擇。此外，可在微生物系統(tǒng)中生產(chǎn)scFv抗體，這比生產(chǎn)治療用全長抗體成本更低。除傳統(tǒng)的細(xì)胞外和體外應(yīng)用之外，還已將ScFv成功用于細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用(W(.1rn etal.2000; Auf der Maur et al.2002; Stocks MR, 2004);因此，已開發(fā)出針對細(xì)胞內(nèi)抗原的scFv.一般而言，功能性scFv的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)受其不穩(wěn)定性、不可溶性及趨于形成聚集物的限制。因此，已使用所謂的“質(zhì)量控制”篩選法(W00148017;Auf der Maur et al.(2001) ;Aufder Maur et al.，2004)成功開發(fā)出針對尤其在還原條件下(一般用于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(例如，核、胞質(zhì)))可溶且穩(wěn)定的scFv抗體體內(nèi)篩選系統(tǒng)，并使可鑒定出用于此類目的的特別穩(wěn)定且可溶的scFv構(gòu)架(framework)序列(W003097697)。此外,這些構(gòu)架還在細(xì)胞外環(huán)境中的天然氧化條件下表現(xiàn)出超常 表達(dá)水平及增強(qiáng)的穩(wěn)定性和可溶性性質(zhì)。因此，這些有利的生物物理和生物化學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致了有利的高產(chǎn)率，且使這些抗體片段一旦針對特定抗原就能作為蛋白治療劑在特定治療領(lǐng)域局部和/或全身應(yīng)用。對于在很多治療(尤其是局部應(yīng)用)中使用抗體而言，一個重要的因素是抗體穿透組織(尤其是上皮組織屏障)的能力。對于在特定位置呈現(xiàn)且無需全身治療的病癥(例如，眼部疾病)的治療尤需局部應(yīng)用。前葡萄膜炎葡萄膜炎是急性或慢性葡萄膜炎癥，其患病率為每十萬人中30-40例(Lightmanand Kok2002)?？蓪⑵咸涯ぱ装凑瘴恢梅譃榍捌咸涯ぱ住⒅衅咸涯ぱ缀秃笃咸涯ぱ?。如不治療，前葡萄膜炎將發(fā)展為后葡萄膜炎，接著是并發(fā)癥，例如白內(nèi)障、視網(wǎng)膜炎，甚至失明(Kokand Lightman2004)。在〈65歲的老年人中有很多是葡萄膜炎(如糖尿病性視網(wǎng)膜病)造成的法定盲人(Kok and Lightman2004)。前葡萄膜炎作為眼內(nèi)炎性疾病最常見的形式,在50%的病例中與組織相容性基因座A等位基因B27(HLA-B27)相關(guān)(Power et al.1998)。在這些患者中，僅約一半患有額外的全身疾病(例如，強(qiáng)直性脊柱炎或慢性炎性腸病)(El-Shabrawiand Hermann2002)。治療葡萄膜炎主要在于控制炎性過程(Kok and Lightman2004)o目前，主要使用皮質(zhì)類固醇治療葡萄膜炎(Kok and Lightman2004)。重要的是,局部和全身皮質(zhì)類固醇治療顯著增加了青光眼和白內(nèi)障的風(fēng)險(xiǎn)，由此限制了其重復(fù)使用(El-Shabrawi andHermann2002)。其他治療(包括甲氨蝶呤、環(huán)孢霉素或硫唑嘌呤)需要最少6周的治療以產(chǎn)生效果，這使患者生活質(zhì)量長期都受到巨大限制(El-Shabrawi and Hermann2002, Dick etal.1997)。從上文顯而易見可看出明確的醫(yī)藥需求。局部皮質(zhì)類固醇作為最常用的治療選擇具有顯著的副作用，這其實(shí)惡化了致盲的長期風(fēng)險(xiǎn)。近來已在葡萄膜炎患者的水狀體中發(fā)現(xiàn)了濃度15pg/ml的TNFa，而健康個體中的相應(yīng)水平為0.56pg/ml (Perez-Guijo et al.2004)。用全身應(yīng)用的TNFa抑制劑進(jìn)行的多項(xiàng)小的臨床研究報(bào)道了“立刻的改善”(El-Shabrawi and Hermann2002)或“數(shù)天內(nèi)的明顯臨床改善” (Murphy et al.2004)或“兩周內(nèi)” (Jos印h2003)或“首次因福利美(infliximab)劑量后的顯著改善” (Benitez Del Castillo et al.2004)。因此，靶向TNFa的概念在臨床上已被很好地確認(rèn)有效。但仍有關(guān)于全身應(yīng)用TNFa抑制劑的安全關(guān)注，也無法判斷是否可應(yīng)用于顯著比例的缺少額外的全身疾病表現(xiàn)的葡萄膜炎患者。因此，局部TNFa抑制劑將滿足明確的醫(yī)藥需求，尤其是在患有前葡萄膜炎的患者中。由于它們分子量較大，因此不能局部應(yīng)用市售的TNFa抑制劑(見Thiel etal.2002)。貝切特病貝切特病是特發(fā)性的、多系統(tǒng)性的、慢性的、反復(fù)發(fā)作的疾病，其經(jīng)典特征在于發(fā)作性攻擊性眼部炎性發(fā)作、口腔-生殖潰瘍和皮膚損傷。在貝切特病的少數(shù)嚴(yán)重病例中，還觀察到關(guān)節(jié)、聽覺前庭、胸胃腸(thoracic gastrointestinal)、心血管、腎或CNS被涉及。眼睛是貝切特病最常被涉及的內(nèi)部器官，且其是患者慢性發(fā)病的首要因素。眼部疾病由慢性和復(fù)發(fā)病程的單側(cè)虹膜睫狀體炎(20%)或雙側(cè)虹膜睫狀體炎(80%)、眼前房積膿或全葡萄膜炎構(gòu)成。通常，初始惡化趨 向于較靠前和單側(cè)，而隨后的發(fā)作趨向于涉及眼的玻璃體腔和靠后的部分，變成雙側(cè)的(EverekliOglu2005)。在來自地域性區(qū)域的患者(例如日本和土耳其患者)中，嚴(yán)重的葡萄膜炎是較為常見的癥狀，其影響該群體中的 70-90% (C)ZCIl 1999;Tursen et al., 2003;Tugal-Tutkun et al., 2004;Yurdakul etal., 2004;Evereklioglu2005)o失明風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加,在10年時(shí)達(dá)到病例中的1/4。此外,法定失明是顯著的，在該病高流行性和嚴(yán)重性的國家(例如日本)，超過50%的病例中這最終會繼發(fā)(Boyd et al., 2001;Evereklioglu2005)o貝切特病表現(xiàn)出有差別的地理變化，尤其是在日本、韓國、沙特阿拉伯、伊朗和土耳其及沿著古代“絲綢之路”的國家(包括中國和以色列)中，其地域性地更高(Bonfioli and Orefice2005;Evereklioglu2005)o 例如，在日本和土耳其，貝切特病在葡萄膜炎中占到20%的比例，與此相比，在美國僅占0.2%。在疾病呈地域性的國家中，其在男性，尤其是年輕的成年男性中更普遍，更嚴(yán)重，具有更高的眼部表現(xiàn)和并發(fā)癥發(fā)作率(Everekl ioglu2005 )。這種罕見的流行病似乎受遺傳(例如與HLA-B51等位基因相關(guān)(Sakane et al., 1999;Verity et al.，1999;Evereklioglu2005))、感染物(Direskeneli2001;Evereklioglu2005)和環(huán)境因素的組合介導(dǎo)。在地中海國家、中東和遠(yuǎn)東，貝切特病的發(fā)病率估計(jì)在1:10，000至1:1000之間。而在日本和沿著絲綢之路的亞洲國家，發(fā)病率為每100,000中13-30例，在日本北部最高；在土耳其的某些地方觀察到高達(dá)每100,000中400的最高總發(fā)病率。在美國約有15，000人患有貝切特病(Zierhut etal.,2003;Evereklioglu2005)。對眼的炎性攻擊的后果是貝切特病患者慢性發(fā)病的首要因素(Evereklioglu2005)。對貝切特病的治療是按癥狀進(jìn)行的和經(jīng)驗(yàn)性的。如在其他形式的葡萄膜炎中一樣，主要通過局部施用、眼周施用和全身施用皮質(zhì)類固醇來治療眼部貝切特病。但在患者中使用基于皮質(zhì)類固醇的治療形式受到其顯著副作用的限制。此外，皮質(zhì)類固醇很少能在眼部貝切特病中誘導(dǎo)完全的復(fù)原(remission),相當(dāng)大量的患者隨著時(shí)間發(fā)展出抗固醇的疾病(Evereklioglu 2005)。在疾病病程中，治療通常包括免疫抑制劑，例如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和環(huán)孢霉素A。但因?yàn)檫@些試劑也與重要的安全問題相關(guān)，因此人們非常需要用于該適應(yīng)癥的高效且安全的新治療形式。近來的流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)提示TNFa的多態(tài)性變化與貝切特病的嚴(yán)重性相關(guān)(Verity et al.，1999b)，除此之外，有很多病例報(bào)告和小的臨床試驗(yàn)描述了因福利美在眼部貝切特病中的用途(Ohno et al., 2004;ffechsler et al., 2004;Giansanti etal., 2004;Lanthier et al., 2005;Tugal-Tutkun et al., 2005;Lindstedt et al.，2005)。事實(shí)上，所有這些研究都報(bào)道了眼部貝切特病的快速且完全的復(fù)原，甚至在抗傳統(tǒng)療法的患者中也如是(Tugal-Tutkun et al.，2005)。但在一些研究中，在因福利美治療的葡萄膜炎患者中，不利事件的發(fā)作率和嚴(yán)重性出人意料地高，這顯示了全身應(yīng)用TNFa拮抗劑來治療該病的潛力(Rosenbaum2004; Suhler et al.，2005)。TNFa在眼部貝切特病中作為高度有吸引力的藥物靶標(biāo)的臨床確認(rèn)有效(Ohno et al.,2004;Wechsler et al.,2004;Giansanti et al.,2004;Lanthier etal., 2005;Tugal-Tutkun et al., 2005;Lindstedt et al.，2005)及對在葡萄膜炎患者中全身性的TNFa遏制的明顯安全關(guān)注(ROSenbaum2004; Suhler et al.，2005)揭示:人們需要開發(fā)可局部應(yīng)用的TNFa拮抗劑用于眼部貝切特病，尤其是用于具有支配性眼部癥狀的患者。由于scFv抗體具有 良好的組織穿透能力和快速的腎臟清除性，它們是局部應(yīng)用所優(yōu)選的。除電荷、親疏水性(hydropathicity)和分子量之外,可溶性、聚集趨勢及熱穩(wěn)定性等性質(zhì)也會影響分子穿透組織屏障的能力。例如，高度可溶的抗體片段如果在約37°C的生理溫度下形成聚集物的話，就可能不能穿透上皮屏障。scFv構(gòu)架中單個氨基酸殘基的突變可能在一方面提高了其在環(huán)境溫度下的可溶性，這種突變可能改變熱穩(wěn)定性，因此導(dǎo)致在37°C的解折疊和聚集。此類聚集物分子量較高，因此不能穿過組織屏障。因?yàn)榻M織穿透是高效藥物遞送(尤其是在局部應(yīng)用中)的重要因素，人們需要除想要得高穩(wěn)定性和低抗原性特征之外還具有改進(jìn)的組織穿透能力的治療性抗體，尤其是scFv抗體。W00040262公開了作為藥物或診斷工具以分別治療或診斷眼部病癥的抗體片段，例如scFv。以0.2至0.25mg/ml的scFv濃度來進(jìn)行眼穿透實(shí)驗(yàn)。其顯示，在無穿透增強(qiáng)劑時(shí)scFv能以非常低的速率穿透角膜上皮屏障，而在存在穿透增強(qiáng)劑時(shí)scFv能以較高的速率穿透。鑒于穿透增強(qiáng)劑可能具有細(xì)胞毒性作用或?qū)е律掀じ淖儯藗冃枰娲缘暮?或改進(jìn)的方法，通過scFv及其片段來治療眼部疾病。人們尤其需要具有低程度副作用的、用于通過局部施用進(jìn)行的受控治療的抗體，其可以相對高的濃度來施用。本文提到的所有公開文本和參考文獻(xiàn)都通過弓I用整體并入本文。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個一般性目的是提供抗體，優(yōu)選scFv抗體，所述抗體能特異性結(jié)合選定抗原，并具有改進(jìn)的組織穿透能力?，F(xiàn)在，為了實(shí)現(xiàn)上述目的及本發(fā)明的其他目的(隨著說明書而將更容易明顯)，所述抗體表現(xiàn)為具有下述特征，所述特征在于，其可通過下述方法獲得，所述方法包括:(i)從可溶且穩(wěn)定的抗體構(gòu)架庫中選出最匹配于以特定結(jié)合特異性抗所述抗原的非人抗體構(gòu)架的可溶且穩(wěn)定的構(gòu)架，(ii)向所述構(gòu)架提供與所述抗原結(jié)合的CDR，或?qū)⑺龇侨丝贵w的構(gòu)架朝向所述可溶且穩(wěn)定的構(gòu)架的序列進(jìn)行突變，(iii)檢測所產(chǎn)生抗體的可溶性和穩(wěn)定性，及(iv)檢測所產(chǎn)生抗體的抗原結(jié)合性，針對抗原的結(jié)合對產(chǎn)生的抗體加以檢測。任選在步驟(ii)和(iii)之間加入下述步驟:-通過對一個或多個選定⑶R和/或構(gòu)架進(jìn)行定點(diǎn)或隨機(jī)誘變來突變所述scFv抗體。本發(fā)明還提供了包含可溶的抗原結(jié)合多肽的組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過一層或多層上皮層，例如，內(nèi)皮層或間皮層。例如，所述抗原結(jié)合多肽能在短于約8、7、6、5、4、3、2、1小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)穿過一層或多層上皮層。在一個實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合多肽能在短于約4小時(shí)內(nèi)穿過一層或多層上皮層。應(yīng)當(dāng)理解，上述值和范圍內(nèi)的所有值和范 圍都被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，所述上皮層是眼的，例如，角膜的，例如，角膜的上皮和/或內(nèi)皮。在一個實(shí)施方案中，上皮層是腸的。另一個實(shí)施方案中，上皮層是血腦屏障。再其他實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合多肽能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過完整的哺乳動物角膜。例如，所述抗原結(jié)合多肽能在短于約8、7、6、5、4、3、2、1小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)穿過完整的哺乳動物角膜。在一個實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合多肽能穿過人的角膜。在一個實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合多肽能穿過完整的豬或兔的角膜。又其他實(shí)施方案中，所述組合物還包含穿透增強(qiáng)劑。在某些實(shí)施方案中，所述穿透增強(qiáng)劑選自氮酮馨、苯扎氯銨(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸鈉、辛酸、西吡氯銨、氯己定、膽酸鹽、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor-EL)、環(huán)糊精、DMSO>十烴溴銨、脫氧膽酸鹽、硫酸葡聚糖、EDTA, EDETATE 二鈉、乙醇、褐霉酸鹽、甘膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、L-a -溶血磷脂酰膽堿(L-a-lysophosphatidylocholine)、醋甲唑胺、N-十二燒基肌氨酸、NMP、油酸、Pz-肽、磷月旨、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、?；悄懰猁}和?；敲撗跄懰猁}。在另一實(shí)施方案中，所述穿透增強(qiáng)劑是癸酸鈉。再一個實(shí)施方案中，所述穿透增強(qiáng)劑包括膠體系統(tǒng)、聚丙烯酸酯和生物粘附性聚合物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子可在無穿透增強(qiáng)劑的情況下穿過上皮層，例如，眼(角膜)的上皮層。在一些實(shí)施方案中，所述多肽對靶抗原的結(jié)合親和力至少為10E-6M或更佳的kD。在一些方面，本發(fā)明提供了 pH小于約8的組合物，所述組合物包含抗原結(jié)合多肽(例如單鏈抗體)，其中所述多肽足夠可溶到能穿過完整角膜。在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有約6-約8的范圍內(nèi)的pH。在其他實(shí)施方案中，組合物具有約6、6.5、7.0、7.5、8.0或其任何遞增值(incremental value)的pH。應(yīng)當(dāng)理解,這些值和范圍內(nèi)的任何值和范圍都被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些方面，本發(fā)明提供了 pH小于約8的組合物，所述組合物包含抗原結(jié)合多肽(例如單鏈抗體)，其中所述多肽足夠可溶到能穿過完整角膜。在一些方面，本發(fā)明提供了包含可溶的抗原結(jié)合多肽的組合物，其中所述多肽足夠可溶到能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過完整角膜，并形成于約8或更小的pH下。在一些實(shí)施方案中，所述多肽足夠可溶到能在短于約4小時(shí)內(nèi)穿過完整角膜。在其他實(shí)施方案中，所述組合物還包含穿透增強(qiáng)劑。在一些實(shí)施方案中，所述穿透增強(qiáng)劑選自氮酮、苯扎氯銨(BzCl )、BL-7、BL-9、Bri j35、Bri j78、Bri j98、Bri j99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸鈉、辛酸、西吡氯銨、氯己定、膽酸鹽、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMS0、十烴溴銨、脫氧膽酸鹽、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE 二鈉、乙醇、褐霉酸鹽、甘膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、L-a-溶血磷脂酰膽堿、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、?；悄懰猁}和牛磺脫氧膽酸鹽。在一些實(shí)施方案中，所述穿透增強(qiáng)劑是癸酸鈉。在一些實(shí)施方案中，所述穿透增強(qiáng)劑是氯己定。在一些方面，本發(fā)明提供了包含可溶的抗原結(jié)合多肽的組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過完整角膜的一層或多層。在其他方面，本發(fā)明提供了包含濃度大于約2.5mg/ml的抗原結(jié)合多肽(例如單鏈抗體)的組合物，其中所述多肽足夠可溶到能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過完整角膜。所述組合物可包含濃度在大于約2.5mg/ml-大于約
10.0mg/ml的范圍內(nèi)的抗原結(jié)合多肽。例如，所述組合物可包含濃度為約2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml>4.5mg/ml、5.0mg/ml>5.5mg/ml、6.0mg/ml>6.5mg/ml、7.0mg/ml、
7.5mg/ml、8.0mg/ml>8.5mg/ml>9.0mg/ml>9.5mg/ml-大于約 10.0mg/ml 或其任何遞增值的抗原結(jié)合多肽。應(yīng)當(dāng)理解，這些值和范圍內(nèi)的所有值和范圍都被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽處于大于約4.0mg/ml的濃度。在其他實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽處于大于約10.0mg/ml的濃度。再一些實(shí)施方案中，所述多肽足夠可溶到能在短于約4小時(shí)內(nèi)穿過完整角膜。在其他實(shí)施方案中，所述組合物還包含穿透增強(qiáng)劑。在一些實(shí)施方案中，所述穿透增強(qiáng)劑選自氮酮、苯扎氯銨(BzCl )、BL-7、BL-9、Bri j35、j78、Bri j98、j99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸鈉、辛酸、西吡氯銨、氯己定、膽酸鹽、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMS0、十烴溴銨、脫氧膽酸鹽、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE 二鈉、乙醇、褐霉酸鹽、甘膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、L-a -溶血磷脂酰膽堿、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、牛磺膽酸鹽和?；敲撗跄懰猁}。在一些實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑是癸酸鈉。在其他實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑是氯己定。在一些方面，本發(fā)明提供了下述抗原結(jié)合多肽(例如單鏈抗體)，其針對靶抗原的結(jié)合親和力至少為10E-6M的KD，且其中所述多肽足夠可溶到能穿過上皮的緊密連接，且其中所述多肽在生理?xiàng)l件下保持為單體形式。在其他方面，本發(fā)明包含下述組合物，所述組合物包含抗原結(jié)合多肽，其中所述抗原結(jié)合多肽在約_80°C -約37°C的溫度下是穩(wěn)定的。例如，所述組合物可在_80°C、_70°C、-60 V、-50 V 、-40°C、-30°C、-20°C、-10°C、(TC、10°C、20 V或 30 V或任何其遞增值的溫度下穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)理解，這些值和范圍內(nèi)的所有值和范圍都被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合多肽保持穩(wěn)定至少約8周。在其他實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合多肽在4°C時(shí)保持穩(wěn)定至少6周。在一些方面，本發(fā)明提供了包含抗原結(jié)合多肽的組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽具有本文公開的任何圖所示的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)特征。在其他方面，本發(fā)明提供了下述抗原結(jié)合多肽，其針對靶抗原的結(jié)合親和力至少為10E-6M或更佳的KD，且其中所述多肽足夠可溶到能穿過上皮的緊密連接，且其中所述多肽足夠可溶到能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過上皮的緊密連接。在一些實(shí)施方案中，所述多肽足夠可溶到能在約4小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)穿過上皮的緊密連接。再其他方面，本發(fā)明提供了下述抗原結(jié)合多肽，其針對靶抗原的結(jié)合親和力至少為10E-6M或更佳的KD，且其中所述多肽具有對應(yīng)于能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過上皮的緊密連接的抗原結(jié)合多肽的穿過動力學(xué)的l/2Vmax值。在其他方面，本發(fā)明包括足夠可溶到能穿過上皮的緊密連接的抗原結(jié)合蛋白(在標(biāo)準(zhǔn)Caco-2 (人結(jié)腸腺癌)單層上皮細(xì)胞測定中測量的)，其適合用于治療。在多個方面，本發(fā)明包括足夠可溶到能穿過上皮的緊密連接的抗原結(jié)合蛋白(在標(biāo)準(zhǔn)小鼠空腸透過性測定中測量的)，其適合用于治療。再其他方面，本發(fā)明包括足夠可溶到能穿過上皮的緊密連接的抗原結(jié)合蛋白(通過標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)單雜交(one hybrid)或雙雜交(two hybrid)可溶性測定來預(yù)測的)，其適合用于治療。在又一些方面，本發(fā)明提供了足夠可溶到能穿過上皮的緊密連接的抗原結(jié)合蛋白(通過標(biāo)準(zhǔn)的PEG沉淀測定或自身相互作用層析(SIC)測定來預(yù)測的)，其適合用于治療。在其他方面，本發(fā)明提供了鑒定下述抗原結(jié)合多肽的方法，所述多肽具有對應(yīng)于能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過上皮的緊密連接的抗原結(jié)合多肽的穿過動力學(xué)的l/2Vmax值。所述方法包括:在具有可誘導(dǎo)的報(bào)告基因系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)候選抗原結(jié)合多肽，其中，在存在具有所述穿過動力學(xué)的抗原結(jié)合多肽時(shí)，所述報(bào)告基因系統(tǒng)產(chǎn)生可被記錄的信號；及根據(jù)可記錄的信號來篩選所述細(xì)胞，其中所述信號的存在將候選多肽鑒定為具有所述穿過動力學(xué)的抗原結(jié)合多肽。本發(fā)明在一些方面還提供了通過該方法鑒定出的抗原結(jié)合多肽。在一些方面，本發(fā)明還提供了實(shí)施該方法的試劑盒。在其他方面，本發(fā)明提供了治療具有眼部病況的患者的方法，所述方法通過局部施用治療有效量的本文權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述抗原結(jié)合多肽來實(shí)現(xiàn)治療。在一些實(shí)施方案中，眼部病況是葡萄膜炎。在其他實(shí)施方案中，眼部病況是年齡相關(guān)的黃斑變性。在一些方面，本發(fā)明提供了下述抗原結(jié)合多肽，其包含具有至少一個抗原結(jié)合基序的多肽區(qū)域，所述基序側(cè)翼有至少一個支架(scaffold)區(qū)域，且其中所述多肽具有足以在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過上皮的緊密連接的穿過動力學(xué)。在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含被兩個支架區(qū)域所夾(flanked by)的一個抗原結(jié)合基序；被三個支架區(qū)域隔夾(flankedby)的兩個抗原結(jié)合基序；被四個支架區(qū)域隔夾的三個抗原結(jié)合基序；或被八個支架區(qū)域隔夾的六個抗原結(jié)合基序，其中在第四和第五支架區(qū)域之間具有居間接頭區(qū)域。在其他實(shí)施方案中，所述抗原結(jié) 合基序是CDR，所述支架區(qū)域時(shí)免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)域。又其他實(shí)施方案中，所述多肽包含三個CDR和四個居間構(gòu)架區(qū)域或六個CDR和八個構(gòu)架區(qū)域和居間接頭區(qū)域。
在一些方面，本發(fā)明還提供了能特異性結(jié)合靶抗原的抗原結(jié)合多肽，且所述多肽具有足以在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過上皮的緊密連接的穿過動力學(xué)，且其中所述多肽由下式表示:Y ;或Z ;或Y-L-Z ;或Z-L-Y ； 其中 Y 是[F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3-F4] , Z 是[F5-CDR1-F6-CDR2-F7-CDR3-F8]；其中，Y的構(gòu)架區(qū)域(F1-F4)源自一種或多種人輕鏈構(gòu)架；Z的構(gòu)架區(qū)域(F5-F6)源自一種或多種人輕鏈構(gòu)架；Y的CDR (CDR1-CDR3)源自能結(jié)合靶抗原的一種或多種供體⑶R ；Z的⑶R (⑶R4-⑶R6)源自能結(jié)合靶抗原的一種或多種供體⑶R ;且L是柔性多肽接頭。在一些實(shí)施方案中，Y和Z由本文公開的序列中的任何序列或其共有序列來表示。此外，在另一實(shí)施方案中，也可沿著抗原結(jié)合多肽編碼序列的全部或部分隨機(jī)引入突變，例如通過飽和誘變引入突變?！肮灿行蛄小笔窃谙嚓P(guān)序列家族中最頻繁出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(參見例如，Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, ffeinheim, Germanyl987)。在蛋白家族中,共有序列中的每個位置都被家族中在該位置最頻繁出現(xiàn)的氨基酸所占據(jù)。如果兩個氨基酸出現(xiàn)的頻次相等，則它們都可被包括進(jìn)共有序列。在一些方面，本發(fā)明提供了被配制為達(dá)到至少約100ng/ml或更高的眼內(nèi)濃度的抗原結(jié)合多肽。再其他 方面，本發(fā)明提供了被配制為用于局部施用以得到100ng/ml或更高的眼內(nèi)濃度的單鏈抗體(基于本文公開的細(xì)胞或動物模型系統(tǒng))。在其他方面，本發(fā)明提供了被配制為用于局部施用的，并能在無穿透增強(qiáng)劑的情況下穿過角膜進(jìn)入眼內(nèi)空間的抗原結(jié)合多肽。再其他方面，本發(fā)明提供了使用任一項(xiàng)權(quán)利要求所述多肽來治療、預(yù)防和診斷眼部疾病或病癥的方法。附圖簡述可從下文描述結(jié)合附圖來完整地理解本發(fā)明的前述及其他方面、實(shí)施方案、目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。在附圖中，類似標(biāo)識符通常表示多幅圖中類似的特征和結(jié)構(gòu)元件。附圖并不一定符合比例，而僅用于闡述本發(fā)明的宗旨。

圖1顯示了重新折疊步驟后進(jìn)行的制備型尺寸排阻層析(凝膠過濾)中ESBA105(圖1A)、TB-WT (圖1B)和lucentis-scFV (圖1C)的洗脫情況。mAU:毫吸光度單位。圖2顯示了制備性凝膠過濾后，對收集到的ESBA105的峰級分進(jìn)行的分析性凝膠過濾的洗脫情況。圖3顯示了 ESBA105在聚乙二醇(PEG)中的溶解度。圖4顯不了 ESBA105和QC15.2scFv抗體在不同溫度和濃度下忙藏兩周時(shí)的穩(wěn)定性。通過SDS PAGE來分離抗體，用考馬斯亮藍(lán)染色。圖5顯示了在37°C或_80°C貯藏8周(都在pH7.4)后通過L929測定法測定的ESBA105濃度。三角形表示在37°C貯藏的ESBA105，方形表示在_80°C貯藏的ESBA105。圖6示意性地顯示了分別從玻璃體和前房移除液體的注射器。1:玻璃體腔液，2:前眼液，3:虹膜，4:角膜，13:注射器。圖7顯示了 ESBA105在4小時(shí)后穿透進(jìn)入完整兔眼的前房。圖8顯示了 ESBA105在4小時(shí)后穿透進(jìn)入完整兔眼的玻璃體腔。圖9顯示了 ESBA105穿透Caco-2細(xì)胞層。圖10顯示了在用于腸藥物吸收的非翻轉(zhuǎn)囊(non-everted sac)模型中對全長IgG形式的抗體(因福利美)和單鏈形式的抗體片段(ESBA105)通過大鼠空腸的穿透效果的比較。黑方形表示ESBA105濃度(nM)，白圓形表示因福利美濃度(nM)。圖1la是在進(jìn)行實(shí)施例7中描述的實(shí)驗(yàn)的過程中采樣的大鼠眼的房水中發(fā)現(xiàn)的ESBA105的量(ng/ml)的圖示。圖1lb是在進(jìn)行實(shí)施例7中描述的實(shí)驗(yàn)的過程中采樣的大鼠眼的玻璃體液中發(fā)現(xiàn)的ESBA105的量(ng/ml)的圖示。圖1lc是在進(jìn)行實(shí)施例7中描述的實(shí)驗(yàn)的過程中采樣的大鼠眼的神經(jīng)視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的ESBA105的量(ng/ml)的圖示。圖1ld是在進(jìn)行實(shí)施例1中描述的實(shí)驗(yàn)的過程中采樣的大鼠眼的血清中發(fā)現(xiàn)的ESBA105的量(ng/ml)的圖示。圖12是大鼠眼中ESB A105的局部體外pK的圖示。視網(wǎng)膜提取物 500ng/ml。060721ELISA (來自 #060718Whole Eye Rabbit)，Retina。圖13是在玻璃體注射進(jìn)大鼠眼中后ESBA105局部半衰期的圖示。圖14圖示了施用ESBA105后局部藥物蓄積的模型(5滴/天，10mg/ml ESBA105,Peff=2.9Xl(T5)圖15是眼的pK的圖示。4:角膜，5:淚膜，6:前房，7:晶狀體，8:玻璃體，9:視網(wǎng)膜，10:鞏膜。圖16是ESBA105的吸收和清除途徑的圖示。11:親水性藥物，12:親脂性藥物。圖17顯示了相關(guān)的體內(nèi)急性單發(fā)性關(guān)節(jié)炎(大鼠)模型中的劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)。n=3，TNF a，10 u g 1.a。圖18A顯示了局部兔眼應(yīng)用體內(nèi)結(jié)果的圖示。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)表示兩只兔(四只眼)的平均值，兔子在最長10小時(shí)的處理時(shí)間內(nèi)每20分鐘獲得I滴(30mcl)10mg/ml的ESBA105(處于PH6.5的PBS溶液中)。液滴應(yīng)用到瞳孔頂端，隨后擠壓眼皮除去多余的液體(保留7mcl)。通過ELISA測定房水、玻璃體和血清中的ESBA105濃度。圖19顯示了局部兔眼應(yīng)用體內(nèi)結(jié)果的圖示。向每只動物的雙眼的下眼囊應(yīng)用一滴10mg/ml的ESBA105溶液,一天五次,持續(xù)可多達(dá)6天。取樣:在指定的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用第二滴后(1、3或6天后)，處死兩只動物，對兩只眼和血清進(jìn)行定量ELISA分析。在房水(圖19A)、玻璃體(圖19B)、神經(jīng)視網(wǎng)膜(圖19C)、脈絡(luò)膜(圖19D)和血清(圖19E)中測定ESBA105的水平，如圖所示?！癈arr”代表載體，其表示不含ESBA105的緩沖溶液。數(shù)據(jù)中的杠表示在指定的區(qū)室測量到的最大、最小和中位ESBA105濃度，將它們與各自的標(biāo)準(zhǔn)差一起給出。發(fā)明詳述為了提供對說明書和權(quán)利要求書的清楚理解，下文中方便地提供下述定義。
定義術(shù)語“抗體”指完整抗體和任何抗原結(jié)合片段(S卩，“抗原結(jié)合部分”、“抗原結(jié)合多肽”或“免疫結(jié)合子”)或其單鏈?！翱贵w”指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)域(縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)域。重鏈恒定區(qū)域包含三個結(jié)構(gòu)域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)域(縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)域。輕鏈恒定區(qū)域包含一個結(jié)構(gòu)域，CL。VH和VL區(qū)域還可被細(xì)分為稱為互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的高度可變區(qū)域，其被稱為構(gòu)架區(qū)域(FR)的較為保守的區(qū)域間隔。每個VH和VL都包含三個CDR和四個FR，它們以下述順序從氨基末端到羧基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)域含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)域可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)子細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。術(shù)語“抗原結(jié)合性”指與抗原特異性結(jié)合的能力。已顯示:抗體的抗原結(jié)合功能可通過全長抗體的片段來進(jìn)行?？贵w的“抗原結(jié)合部分”這個術(shù)語所包括的結(jié)合片段包括:(i) Fab片段，這是由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii) F(ab’)2片段，這是包含在鉸鏈區(qū)域通過二硫鍵相連的兩條Fab片段的二價(jià)片段；(iii) Fd片段，其由VH和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，(iv) Fv片段,其由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(v)單結(jié)構(gòu)域或dAb片段(Ward et al, (1989) Nature341:544-546),其由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；及(vi )分離的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)或(vii)兩個或多個分離的CDR的組合，它們可任選地通過合成接頭相連結(jié)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域——VL和VH由單獨(dú)基因編碼，但可使用重組方法將它們連結(jié)起來，這通過能使它們被制成單條蛋白鏈的合成接頭來實(shí)現(xiàn)，其中所述鏈中，VL和VH區(qū)域配對形成單價(jià)分子(被稱為單鏈Fv (scFv)已知；參見例如，Bird et al.(1988)Science242:423-426;and Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)技術(shù)來獲得這些抗體片段，以與完整抗體相同的方式針對效用來篩選所述片段。`“免疫球蛋白”可用于表示免疫球蛋白的任何被認(rèn)可的類或亞類，例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。免疫球蛋白可源于任何物種，例如人、鼠或兔來源。此外，免疫球蛋白可為多克隆的、單克隆的或片段。此類免疫球蛋白片段可包括，例如Fab’、F(ab’)2、Fv或Fab片段或其他抗原識別免疫球蛋白片段?？衫缤ㄟ^蛋白水解酶的消化(例如通過胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、還原性烷基化或重組技術(shù)來制備此類免疫球蛋白片段。用于制備此類免疫球蛋白片段的材料和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(Parham, (1983) J.1mmunology, 131:2895;Lamoyi et al., (1983)J.1mmunologicalMethods, 56:235;Parham, (1982)J.1mmunological Methods, 53:133;and Matthew etal., (1982)J.1mmunological Methods, 50:239)。此外，免疫球蛋白可為單鏈抗體(“SCA”)。它們可由單鏈Fv片段(“scFv”)構(gòu)成，其中可變輕(“VL”)和可變重(“VH”)結(jié)構(gòu)域通過肽橋或二硫鍵相連。此外，免疫球蛋白可由單VH結(jié)構(gòu)域(dabs)構(gòu)成,其具有抗原結(jié)合活性。參見例如,G.Winter and C.Milstein, Nature, 349, 295(1991);R.Glockshuber et al., Biochemistry29, 1362(1990);and, E.S.Wardet al.，Nature341, 544(1989)。如本文所用術(shù)語“多肽”指兩個或多個天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。本發(fā)明的多肽包含至少一條源于免疫球蛋白(Ig)分子的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含非源于免疫球蛋白分子的氨基酸序列或一個或多個部分(moiety)。下文中更詳細(xì)描述了示例性的修飾。例如，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可包含柔性接頭序列。在另一實(shí)施方案中，可通過添加功能性部分(例如PEG、藥物或標(biāo)記)來修飾多肽。本發(fā)明的優(yōu)選多肽包含源于人免疫球蛋白序列的氨基酸序列。但多肽可包含來自另外的哺乳動物物種的一個或多個氨基酸。例如，靈長類的重鏈部分、鉸鏈部分或結(jié)合位點(diǎn)可被包括進(jìn)本發(fā)明的多肽。此外，多肽中也可存在一個或多個鼠科動物的氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)選多肽不是免疫原性的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的多肽可被改變，使它們的氨基酸序列與天然存在的或它們所源于的天然多肽有所不同，但同時(shí)保留著想要的天然多肽的活性。例如，可在“非關(guān)鍵”氨基酸殘基處制造導(dǎo)致保守取代或變化的核苷酸或氨基酸取代?？赏ㄟ^向免疫球蛋白的核苷酸序列引入一處或多處核苷酸取代、添加或缺失，以向被編碼的蛋白引入一處或多處氨基酸取代、添加或缺失，來制造編碼源于免疫球蛋白的多肽(例如，免疫球蛋白重鏈部分或輕鏈部分)的非天然變體的經(jīng)分離的核酸分子。可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)引入突變。本發(fā)明的多肽可在一個或多個非關(guān)鍵氨基酸殘基處包含保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔沁@樣的取代，其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。本領(lǐng)域中已確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，其包括:堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶3支鏈的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基來代替多肽中的非關(guān)鍵氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，氨基酸片斷可被結(jié)構(gòu)相似的片斷(其中側(cè)鏈家族成員的順序和/或組成不同)代替。此外，在另一實(shí)施方案中，也可沿著全部或部分 免疫球蛋白編碼序列隨機(jī)引入突變，例如通過飽和誘變來進(jìn)行，且所得突變可被摻入本發(fā)明的多肽，并針對它們結(jié)合所需靶標(biāo)的能力進(jìn)行篩選。術(shù)語“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”、“選擇性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”指抗體與預(yù)定抗原上表位的結(jié)合?？贵w一般以約小于10-6M的親和力(KD)結(jié)合，例如約小于10-7M、10-8M或10-9M或甚至更低。術(shù)語“KD”指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。本發(fā)明的抗體一般以小于約10-6M的解離平衡常數(shù)(KD)與它們的靶抗原結(jié)合，例如小于10-7M、10-8M或10-9M或甚至更低，例如，如在BIAC0RE儀器中使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)測定的。本文所用術(shù)語“穿過動力學(xué)”或“藥代動力學(xué)”指與在機(jī)體組織或流體內(nèi)的藥物吸收、分布及代謝和/或清除的動力學(xué)相關(guān)的所有因素。這包括調(diào)控多肽運(yùn)送穿過膜的物理化學(xué)因素，因?yàn)槎嚯牡奈?、分布、生物轉(zhuǎn)化和排出都涉及到多肽穿過細(xì)胞膜。對于臨床醫(yī)師來說，最大的興趣是多肽的生物可獲得性。本文所用該術(shù)語指多肽到達(dá)它的作用位點(diǎn)的程度或多肽到達(dá)多肽的作用位點(diǎn)的生物流。影響生物可獲得性的因素包括受試者對多肽的吸收及代謝或清除的速率。很多因素影響吸收，它們包括影響到運(yùn)送穿過膜的多種物理化學(xué)因素，例如多肽可溶性和攝取機(jī)制，及諸如多肽的組成和配方(濃度)及施用位點(diǎn)之類的因素。多肽施用的多種途徑具有明顯不同的吸收特征。這些途徑包括:口服攝入、肺吸收、非腸道注射(包括:肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、胸內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)及向粘膜、皮膚或眼睛的局部應(yīng)用。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明的用于治療眼病的多肽局部施用到眼表面，例如，以眼藥水的形式。可使用例如本文公開的任何細(xì)胞或任何基于動物的分子測定本發(fā)明的多肽的穿過動力學(xué)，且一般選出以適于臨床相關(guān)穿過血腦屏障、腸或眼的緊密連接。術(shù)語“受試者”是本領(lǐng) 域已知的，其在本文中使用時(shí)除表示人之外還表示溫血動物，更優(yōu)選哺乳動物，例如非人動物，例如大鼠、小鼠、兔、貓、狗、綿羊、馬、牛。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人。受試者是容易受到用本發(fā)明的可溶抗原結(jié)合多肽進(jìn)行的治療影響的?！按┩冈鰪?qiáng)劑”或“穿透增強(qiáng)劑”在本文中指能促進(jìn)穿透上皮連接的分子或化合物。用于本發(fā)明的穿透增強(qiáng)劑包括但不限于:氮酮、苯扎氯銨(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸鈉、辛酸、西卩比氯銨、氯己定、膽酸鹽、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMS0、十烴溴銨、脫氧膽酸鹽、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE 二鈉、乙醇、褐霉酸鹽、甘膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、L- a -溶血磷脂酰膽堿、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、?；悄懰猁}和牛磺脫氧膽酸鹽。例如，在一些實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑是癸酸鈉。在其他實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑是氯己定。本發(fā)明第一方面提供了 scFv抗體，其特異性結(jié)合選定抗原，且具有改進(jìn)的組織穿透能力。所述抗體特征在于，其可通過下述方法獲得，所述方法包括:(i)從可溶且穩(wěn)定的抗體構(gòu)架庫中選出最匹配于以特定結(jié)合特異性抗所述抗原的非人抗體構(gòu)架的可溶且穩(wěn)定的構(gòu)架，(ii)向所述構(gòu)架提供與所述抗原結(jié)合的CDR，或?qū)⑺龇侨丝贵w的構(gòu)架朝向所述可溶且穩(wěn)定的構(gòu)架的序列進(jìn)行突變，(iii)檢測所產(chǎn)生抗體的可溶性和穩(wěn)定性，及(iv)檢測所產(chǎn)生抗體的抗原結(jié)合性。術(shù)語“匹配最好”表示一級或三級結(jié)構(gòu)上盡可能地接近。本發(fā)明的抗體通常包含具有VL和/或VH結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架，通過不依賴于抗原的方法針對酵母細(xì)胞中的高細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和可溶性從天然人抗體庫的至少一部分選出所述構(gòu)架。所述方法也被稱為對抗體構(gòu)架的“質(zhì)量控制”篩選，并已選出了以高細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和可溶性為特征的特別穩(wěn)定且可溶的抗體構(gòu)架?？蓪⑦@些構(gòu)架用于，例如針對抗原特異性的第二套基于酵母的篩選系統(tǒng)。在這種情況下，可隨機(jī)選擇排列特別穩(wěn)定且可溶的抗體的CDR,并根據(jù)最佳可能的抗原識別篩選所得抗體。此外，也可將具有與所選抗原的強(qiáng)結(jié)合親和力的抗體的已知抗體CDR移植到所述特別穩(wěn)定且可溶的構(gòu)架上。還可任選通過誘變所選⑶R和/或構(gòu)架，在“質(zhì)量控制系統(tǒng)”中選擇改進(jìn)的克隆(W00148017，Auf der Maur etal.2004)，即通過對一個或多個選定CDR和/或構(gòu)架進(jìn)行定點(diǎn)誘變或隨機(jī)誘變來突變所述scFv抗體,并在同樣條件或更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下選擇穩(wěn)定且可溶得抗體，來進(jìn)一步改進(jìn)所述抗體?？稍诮湍纲|(zhì)量控制系統(tǒng)中進(jìn)行體內(nèi)選擇。術(shù)語“構(gòu)架殘基”涉及抗原結(jié)合多肽單元的氨基酸殘基或抗原結(jié)合多肽模塊的相應(yīng)殘基，所述殘基貢獻(xiàn)于折疊拓?fù)鋵W(xué)，即貢獻(xiàn)于所述單元(或模塊)的折疊，或貢獻(xiàn)于與相鄰單元(或模塊)的相互作用。此類貢獻(xiàn)可為與單元(或模塊)中其他殘基的相互作用，或是對多肽主鏈構(gòu)象造成的影響，如在a-螺旋或￠-折疊、或形成線性多肽或環(huán)的氨基酸片斷中發(fā)現(xiàn)的。術(shù)語“靶相互作用殘基”指所述單元的氨基酸殘基或所述模塊的相應(yīng)氨基酸殘基，所述殘基貢獻(xiàn)于與靶物質(zhì)的相互作用。此類貢獻(xiàn)可為與靶物質(zhì)的直接相互作用，或是對其他直接相互作用殘基的影響，例如通過穩(wěn)定多肽的所述單元(或模塊)的構(gòu)象，以使或增強(qiáng)所述直接相互作用殘基與所述靶的相互作用?？赏ㄟ^分析由上文提到的物理化學(xué)方法獲得的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，或通過與結(jié)構(gòu)生物學(xué)和/或生物信息學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的已知且相關(guān)結(jié)構(gòu)信息加以比較，來鑒定此類構(gòu)架和靶相互作用殘基。此類構(gòu)架還可被稱為支架，因?yàn)樗鼈兲峁┝藢Ω鄻拥陌邢嗷プ饔脷埢駽DR的呈遞的支持?？蓪DR或靶相互作用殘基移植進(jìn)合適的構(gòu)架，例如，本領(lǐng)域公知的備選支架，其包括但不限于:CTLA-4、淀粉酶抑肽、纖連蛋白(FN3)、新制癌菌素、CBM4-2、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、T-細(xì)胞受體、蛋白A結(jié)構(gòu)域(蛋白V)、Im9、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins)、設(shè)計(jì)的TPR蛋白、鋅指、pVII1、鳥胰腺多肽、GCN4、ffff結(jié)構(gòu)域、Src同源性結(jié)構(gòu)域3 (SH3)、Src同源性結(jié)構(gòu)域2 (SH2)、PDZ結(jié)構(gòu)域、TEM-1 ^ -內(nèi)酰胺酶、GFP、硫氧還蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指、C1-2、BPTl APPI, HPSTI, ecotin、LAC1-Dl, LDTI, MT1-11、蝎毒素、昆蟲防御素 A肽、EET1-11、Min-23、CBD、PBP、細(xì)胞色素b562、Ldl受體結(jié)構(gòu)域A、Y _晶狀體蛋白、泛素、轉(zhuǎn)移和 C 型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(見 Binz et al.(20050ct)Nat Biotech23 (10): 1257-68)，或可被移植進(jìn)合適的源于免疫球蛋白的抗原結(jié)合多肽，它們是本領(lǐng)域公知的，其包括但不限于:VhH 結(jié)構(gòu)域、V-NAR 結(jié)構(gòu)域、Vh 結(jié)構(gòu)域、Fab> scFv、Bis-scFv、Camel IG、IfNAR、IgG、Fab2、Fab3、微型抗體(minibodies)、雙特異抗體(diabodies)、三特異抗體(trabodies)和四特異抗體(tetrabodies)(參見例如 Holliger, P.and Hudson, P.(2005), Nat.Biotechnol.23(9), pp.1126-1136)。 本發(fā)明的抗體優(yōu)選還具有下述特征中的一種或多種:-其在還原條件下(如在酵母相互作用測定中測量時(shí))穩(wěn)定，其中，與所述scFv融合的選擇性標(biāo)記蛋白的活性與所述scFv在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的高穩(wěn)定性和可溶性相關(guān)。有對所述酵母相互作用測定(所謂的“質(zhì)量控制”)的詳細(xì)描述(Auf der Maur et al.(2001) ;Aufder Maur et al.，2004 ;將參考文獻(xiàn)整體并入本文)。-其在20°C-40°C (優(yōu)選在37°C)于PBS中能穩(wěn)定至少I個月，優(yōu)選至少2個月，最優(yōu)選至少6個月，-其在生理?xiàng)l件下保持為單體，-其在環(huán)境溫度下在PBS中以〉約lmg/ml的濃度可溶，優(yōu)選以> 約4mg/ml，更優(yōu)選以 > 約10mg/ml,再更優(yōu)選以 > 約25mg/ml,最優(yōu)選以 > 約50mg/ml的濃度可溶，-其在鹽酸胍滴定中表現(xiàn)出至少1.5M的轉(zhuǎn)換中點(diǎn)(midpoint),優(yōu)選至少1.75M,更優(yōu)選至少1.9M，最優(yōu)選至少2M的轉(zhuǎn)換中點(diǎn)，即可抵抗變性。術(shù)語抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用時(shí)指能結(jié)合選定抗原的scFv抗體或抗體片段。因此,本發(fā)明的scFv抗體可為包含通過短接頭肽(例如包含1-4個序列GGGGS的重復(fù)的接頭，優(yōu)選(GGGGS) 4 肽(SEQ ID NO: 16)，更優(yōu)選序列 GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS (SEQ ID NO:17)的接頭或 Alfthan et al.(1995)Protein Eng.8:725-731 中公開的接頭)相連的 VL 和VH結(jié)構(gòu)域的完整scFv，或簡單地為VL或VH結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域具有針對選定抗原的足夠結(jié)合能力。VL和VH的連接可有兩種方向，VL-接頭-VH或VH-接頭-VL。本發(fā)明一方面提供了能在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中穩(wěn)定至少I個月，優(yōu)選至少2個月的抗體。優(yōu)選檢測所述抗體在生理溫度，即37°C下的穩(wěn)定性。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體能在PBS中于4°C下保存時(shí)或在凍干之后于室溫下穩(wěn)定至少6個月?？衫缤ㄟ^SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)染色程序(例如考馬斯染色或銀染)，并比較全長條帶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的染色強(qiáng)度分析標(biāo)準(zhǔn)量的所述抗體來檢測穩(wěn)定性。此外，檢查降解產(chǎn)物的缺失。降解的蛋白會形成電泳條帶拖尾，或甚至由于降解產(chǎn)物太短而看不到，這種情況下，僅全長蛋白條帶強(qiáng)度損失表示降解。通常情況下，在對顏色和/或清晰度進(jìn)行視覺觀察時(shí)，或通過UV光散射或通過尺寸排阻層析觀察時(shí)，如果沒有聚集、沉淀和/或變性的跡象，則可假定抗體是物理穩(wěn)定的。以貯藏一定時(shí)間之后的活性看的穩(wěn)定性也是本發(fā)明抗體的另一重要特征。這可通過比較貯藏前后的抗體效力加以確定，例如，通過使用ELISA在體外靶結(jié)合測定或在體內(nèi)細(xì)胞活性測定(其中，測量抗體的抑制效力)確定。本發(fā)明另一方面提供了在生理?xiàng)l件下是且保持為單體的抗體(可例如通過凝膠電泳來判斷的)。單體狀態(tài)是能穿透上皮屏障的抗體的重要特征。本發(fā)明再一方面提供了在PBS中于環(huán)境溫度下以大于約lmg/ml的濃度可溶的抗體，優(yōu)選以大于約4mg/ml,最優(yōu)選以約10mg/ml的濃度可溶的抗體?？墒褂肞EG3000通過PEG沉淀，或通過自身相互作用層析(SIC)來測定經(jīng)純化的抗體的溶解度。本發(fā)明又一方面提供了下述抗體，其在鹽酸胍滴定中表現(xiàn)出至少約1.5M的轉(zhuǎn)換中點(diǎn)，優(yōu)選至少約1.75M，更優(yōu)選至少約1.9M，最優(yōu)選至少約2M的轉(zhuǎn)換中點(diǎn)。這是對從解折疊抗性的意義上說的穩(wěn)定性的量度，其中，加入鹽酸胍誘導(dǎo)的解折疊/變性之后進(jìn)行熒光或圓二色光譜分析。在本發(fā)明再一方面，具有上述生物物理特征中一種或多種的抗體的結(jié)構(gòu)特征在于:輕鏈可變區(qū)域(VL)的構(gòu)架與選自SEQ ID NO:1 Ul型)、SEQ ID NO:2 Ul型)、SEQID NO:3 ( K 3 型)或 SEQ ID NO:4 ( A I 型)、SEQ ID NO:5 ( k 3 型)、SEQ ID NO:6 (入 3型)或SEQ ID NO:7 (A3型)的VL構(gòu)架具有至少85%的相似性，優(yōu)選至少約95%相似性，最優(yōu)選至少約98%同一性；且/或重鏈可變區(qū)域(VH)的構(gòu)架與選自SEQ ID NO:8 (H3型)、SEQ ID NO:9 (H3 型)、SEQ ID NO:10 (Hlb 型)或 SEQ ID NO: 11 (H3 型)的 VH 構(gòu)架具有至少85%的相似性，優(yōu)選至少約95%相似性，最優(yōu)選至少約98%同一性。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用SEQ ID NO:2的VL同源體與SEQ ID NO:8的VH同源體的組合、SEQ ID NO:4的VL同源體與SEQ ID NO:10的VH同源體的組合或上文提到的VL序列中任何一條的同源體與SEQ ID NO:9的VH同源體的組合。更優(yōu)選與SEQ ID NO:7相似性>90%，再更優(yōu)選>95%的抗體。最優(yōu)選序列為SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8的抗體。還應(yīng)當(dāng)理解，只要保持著靶結(jié)合特異性，本發(fā)明包括公開的VL序列中任何一條與公開的VH序列中任何一條的組合。兩條序列間的相似性百分?jǐn)?shù)是對蛋白序列相關(guān)程度的量度。兩條序列間相似性的程度可基于序列同一性和/或保守性百分?jǐn)?shù)。保守性指在氨基酸序列上特定位置的改變，但保留原有殘基的物理化學(xué)性質(zhì)。一般，通過序列比對來測定序列間的相似性。
通過使用可網(wǎng)絡(luò)獲取的BLAST 程序(Basic Local Alignment Search Tools ；見 Altschul, S.F.，Gish, W.，Miller, W.，Myers, E.W.& Lipman, DJ.(1990) "Basic localalignment search tool."J.Mol Biol.215:403-410)來測定本文提到的相似性。BLAST蛋白檢索可用XBLAST程序(分?jǐn)?shù)=50，字長=3)來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的蛋白分子相似的氨基酸序列。就比較目的而言，為獲得帶缺口的比對，可按照Altschul et al., (1997)Nucleic Acids Res.25 (17): 3389-3402 所述，使用 Gapped BLAST。當(dāng)使用 BLAST 和 GappedBLAST程序時(shí)，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。兩條序列間的同一性百分?jǐn)?shù)是序列共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，其中要考慮到缺口的數(shù)量、每個缺口的長度(為了對兩條序列的最優(yōu)比較而需要引入的)。對序列的比較和兩條序列間同一性百分?jǐn)?shù)的測定可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的數(shù)學(xué)算法來完成。可使用GCG軟件包中的GAP程序來測定兩條核苷酸序列間的同一性百分?jǐn)?shù)，其中使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口權(quán)重及1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。還可使用E.Meyers 和 W.Miller (CAB10S，4:11-17 (1989))的算法(其已被并入ALIGN程序(版本2.0))來測定兩條核苷酸或氨基酸序列間的同一性百分?jǐn)?shù)，其中使用PAM120權(quán)重殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分。此外，可使用Needle-man和Wunsch (J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法(已被并入 GCG 軟件包中的 GAP 程序)來測定兩條氨基酸序列間的同一丨I"生百分?jǐn)?shù)，其中使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重及1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。另一方面，本發(fā)明的抗體被化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾可改變抗體的性質(zhì)，例如穩(wěn)定性、可溶性、抗體結(jié)合特異性或親和性、體內(nèi)細(xì)胞毒性半衰期及組織穿透能力?；瘜W(xué)修飾是技術(shù)人員公知的。對本發(fā)明抗體的優(yōu)選化學(xué)修飾是PEG化。在另一優(yōu)選方面，通過小于約IOOnM,優(yōu)選小于約10nM，最優(yōu)選小于約InM的解離常數(shù)Kd來表征本發(fā)明的抗體的親和性。通過表面等離子共振(BiaCore)或ELISA來測定結(jié)合參數(shù)，例如抗體與其關(guān)聯(lián)抗 原的親和性。這些方法是本領(lǐng)域公知的。與本發(fā)明的抗體結(jié)合的抗原優(yōu)選是TNFa (腫瘤壞死因子a )。TNF a也被稱為惡病質(zhì)素(cachectin)，其是天然存在的哺乳動物細(xì)胞因子，其由多種細(xì)胞類型(包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)響應(yīng)內(nèi)毒素或其他刺激而產(chǎn)生。TNFa是炎性、免疫和病理生理反應(yīng)的主要介導(dǎo)因素(Grell，M.，et al.(1995) Cell, 83:793-802)。大量病癥都與TNF a水平升高相關(guān)，它們中很多有顯著的醫(yī)藥重要性。TNFa已顯示在多種人類疾病中被上調(diào)，所述疾病包括:慢性疾病，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病(包括Crohn’ s癥和潰瘍性結(jié)腸炎)、敗血癥、充血性心力衰竭、支氣管哮喘和多發(fā)性硬化。TNFa還被稱為前炎性細(xì)胞因子。但其還涉及一些局部表現(xiàn)的病癥，例如眼病，例如，黃斑變性、葡萄膜炎、青光眼、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜炎、干眼綜合征、鞏膜炎、結(jié)膜炎和角膜炎。本發(fā)明的抗體特別適用于治療此類疾病，因?yàn)槠淇删植?locally)和局部(topically)施用，例如通過眼藥水用于眼病。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體的DNA序列及含有所述DNA序列的克隆載體或表達(dá)載體。此外，還提供了經(jīng)所述DNA序列轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞。其可為原核或真核細(xì)胞，尤其是大腸桿菌(E.coli)、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞?？墒褂弥亟M遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。在已知多肽序列的情況下，可通過基因合成來產(chǎn)生編碼它們的cDNA。
此外，提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法，所述方法包括:在使所述抗體合成的條件下培養(yǎng)經(jīng)編碼所述抗體的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，及從所述培養(yǎng)物中回收所述分子。所述方法優(yōu)選提供了從大腸桿菌包涵體或從大腸桿菌周質(zhì)(如果所用的scFv構(gòu)建體包涵指導(dǎo)多肽進(jìn)入周質(zhì)的信號序列)純化的scFv抗體。本發(fā)明另一方面是本發(fā)明提供的抗體作為診斷工具(優(yōu)選用于體外診斷)和/或作為藥物的用途。在任何TNF a相關(guān)病況的范疇中特別優(yōu)選該用途。待用抗TNFa scFv或其片段治療的疾病優(yōu)選是與TNF a過量表達(dá)相關(guān)的疾病。如果TNF a的過量表達(dá)導(dǎo)致異常的細(xì)胞功能，則能結(jié)合并從而中和過量TNFa的抗體就是治療此類疾病的理想藥物(如果所述抗體能到達(dá)TNF a過量的位置的話)。如果該位置在細(xì)胞內(nèi)，則所述抗體必需要能進(jìn)入所述細(xì)胞。如果該位置是細(xì)胞外的，則所述抗體必需能夠到達(dá)組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，即，其必需穿過組織的最外圍細(xì)胞層(其通常是上皮細(xì)胞層)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述抗體能穿透內(nèi)皮。IV.藥物組合物和藥物施用A.組合物和施用在大多數(shù)情況下，會將本發(fā)明的抗體用于藥物組合物中，所述藥物組合物包含至少一種其他化合物。優(yōu)選將其與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑組合。所述賦形劑可選自氮酮、苯扎氯銨(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸鈉、辛酸、西吡氯銨、氯己定、膽酸鹽、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMS0、十烴溴銨、脫氧膽酸鹽、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE 二鈉、乙醇、褐霉酸鹽、甘膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、L-a -溶血磷脂酰膽堿、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、牛磺膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、緊密連接開口肽(opening peptides)和肽衍生物、緊密連接開口蛋白(opening proteins)和蛋白衍生物。所述賦形劑優(yōu)選選自苯扎氯銨、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80和氯己定。還可使用癸酸鹽。此類物質(zhì)可作為穿透增強(qiáng)劑發(fā)揮作用。在大多數(shù)情況下，將包含本發(fā)明抗體的藥物組合物局部應(yīng)用而非全身應(yīng)用。本發(fā)明的抗體特別適合于局部應(yīng)用，因?yàn)閟cFv形式較小，并且其構(gòu)架具有能使其穿透上皮組織屏障的物理化學(xué)特征。局部應(yīng)用是在相對有限的區(qū)域內(nèi)的應(yīng)用，例如其是眼、鼻腔、口腔、腸道、皮膚、口腔粘膜和泌尿生殖道、關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)間隙、腦、脊椎等，其中體積相對小的足夠濃縮的抗體的應(yīng)用就是有效的。另一方面，局部應(yīng)用是在機(jī)體部分的表面上的應(yīng)用。施用本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選形式是局部應(yīng)用；但其他形式包括吸入，例如，如果抗體是要穿透肺上皮的話?？墒褂梦肫骰驀婌F器及包含氣霧劑的制劑實(shí)現(xiàn)經(jīng)肺遞送。對于局部應(yīng)用而言，優(yōu)選的位置是眼。本發(fā)明的抗體特別適合穿透角膜，其主要由三層組織層，即，上皮、間質(zhì)和內(nèi)皮構(gòu)成。因此，所述抗體可用于治療很多眼病。B.藥物遞送 系統(tǒng)用于本發(fā)明的局部眼部藥物遞送系統(tǒng)的非限制性例子包括穿透增強(qiáng)劑、角膜膠原膜(collagen shield)、眼部離子滲透、微顆?；蚣{米顆粒、眼部插入物、粘膜粘附聚合物、原位膠凝系統(tǒng)、樹枝狀聚合物、脂乳液和眼部插入物(見Sultana, et al.(2007)FutureDrugs, 2 (2)，309-323 (2007) 1.)1.穿透增強(qiáng)劑
本發(fā)明的藥物組合物可包括穿透增強(qiáng)劑。穿透增強(qiáng)劑的例子是本領(lǐng)域公知的，其包括:氮酮⑩、苯扎氯銨(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、fcij78、Brij98、fcij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸鈉、辛酸、西吡氯銨、氯己定、膽酸鹽、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、環(huán)糊精、DMS0、十烴溴銨、脫氧膽酸鹽、硫酸葡聚糖、EDTA, EDETATE 二鈉、乙醇、褐霉酸鹽、甘膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、L-a-溶血磷脂酰膽堿、醋甲唑胺、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、Pz-肽、磷脂、聚氧乙烯-9-十二燒基醚、阜苷、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、牛磺膽酸鹽和?；敲撗跄懰猁}(見 Sultana, et al.(2007) Future Drugs, 2 (2)，309-323 (2007))。在另一實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑是癸酸鈉。再一個實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑包括膠體系統(tǒng)、聚丙烯酸酯和生物粘附性聚合物。還見U.S.S.N.60/—，—(代理人案卷號N0.ES5-016-1，標(biāo)題為“Improved penetration Enhancers for the Delivery of Therapeutic Proteins，，，提交于2007年7月10日)。i1.角膜膠原膜還可用角膜膠原膜來施用本發(fā)明的抗體。在一些實(shí)施方案中，可使用解離時(shí)間為12、24和72小時(shí)的膠原膜。在其他實(shí)施方案中，在加替沙星(gatifloxacin)和/或莫西沙星(moxif1xacin)溶液中預(yù)先浸泡膠原膜。ii1.眼部離子滲透還可通過眼部離子滲透來遞送本發(fā)明的抗體。在一個實(shí)施方案中，可通過跨角膜的離子滲透將抗體遞送至眼前節(jié)。在另一實(shí)施方案中，可通過跨鞏膜的離子滲透將高且持續(xù)濃度的本發(fā)明抗體遞送至玻璃體和視網(wǎng)膜。以所需持續(xù)時(shí)間進(jìn)行離子滲透。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)用離子滲透約1-約4分鐘。在其他實(shí)施方案中，應(yīng)用離子滲透少于I分鐘。在另一實(shí)施方案中，應(yīng)用離子滲透超過4分鐘。iv.微顆粒和納米顆粒還可用微顆?；蚣{米顆粒遞送系統(tǒng)來遞送本發(fā)明的抗體。在一些實(shí)施方案中，微顆粒是微膠囊。在其他實(shí)施方案中，微顆粒是微球。再一些實(shí)施方案中，微顆粒包含可被侵蝕的、可生物降解的 、不可被侵蝕的聚合物或離子交換樹脂。在另一實(shí)施方案中，微顆粒遞送系統(tǒng)是Betoptic S ,其含有0.25%的倍他洛爾(betaxolol )。也可使用顆粒小于I y m的納米顆粒。在一個實(shí)施方案中，納米顆粒是納米膠囊。在另一實(shí)施方案中，納米顆粒是納米球。在一個實(shí)施方案中，納米顆粒包含聚丙烯氰基丙烯酸酯(PACA)。在另一實(shí)施方案中，納米顆粒包含聚-4-己內(nèi)酯。在某些實(shí)施方案中，納米顆粒包含固體脂類納米顆粒，其中含有2.5%的托普霉素及磷酸十六酯。在另一實(shí)施方案中，納米顆粒包含Eudragit RS100或Eudragit RL100,且任選還包含氯克羅曼(cloricromene)。在其他實(shí)施方案中，納米顆粒包括裝載氟比洛芬鈉(flurbiprofen, FB)的丙烯酸酯聚合物納米懸浮液。V.眼部插入物還可使用眼部插入物來施用本發(fā)明的抗體。在一些實(shí)施方案中，眼部插入物是不可溶的、可溶的或可被生物侵蝕的插入物。不可溶的插入物包括擴(kuò)散系統(tǒng)、滲透系統(tǒng)和親水性接觸式鏡片?？扇懿迦胛锟捎商烊弧⒑铣苫虬牒铣傻木酆衔锝M成?？杀簧锴治g的插入物可由可被生物侵蝕的聚合物組成。v1.粘膜粘附聚合物
本發(fā)明的藥物組合物可包括粘膜粘附聚合物。粘膜粘附聚合物的例子是本領(lǐng)域公知的，其包括:殼聚糖(CS)、Ch-HCL和N-羧甲基殼聚糖(CMCh)、N-三甲基殼聚糖(TMC)聚
合物、裝載毛果蕓香堿的C:S/C:arbopol 、聚丙烯酸(paa)、多糖、木葡聚糖、羅望子種
多糖(TSP)和巰基化聚合物或巰聚物(thiomer)。vi1.原位膠凝系統(tǒng)本發(fā)明的藥物組合物可包含原位膠凝系統(tǒng)。原位膠凝系統(tǒng)的例子是本領(lǐng)域公知的，且包括PH介導(dǎo)的原位膠凝系統(tǒng)、溫度介導(dǎo)的原位膠凝系統(tǒng)和離子介導(dǎo)的原位膠凝系統(tǒng)。pH介導(dǎo)的原位膠凝系統(tǒng)可包括，例如，聚合物，例如，鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)和Carbopo膽。溫度介導(dǎo)的原位膠凝系統(tǒng)可包括，例如，普羅尼克、tetraonic和乙基羥乙基纖維素。原位膠凝系統(tǒng)還可包括=Gdrite⑩(去乙酰化結(jié)冷膠(dcg))、藻酸鹽(例如，藻酸鹽-聚(L-賴氨酸))、馬來酸噻嗎洛爾(timolol maleate)、眼用溶液(例如Timoptol XE和Lizmon TG )及它們的組合。vii1.樹枝狀聚合物本發(fā)明的藥物組合物可包括樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物的例子是本領(lǐng)域公知的，其包括TM聚酰胺(PAMAM) οC.制劑在另一實(shí)施方案中，制劑可為緩慢、延長或定時(shí)釋放制劑、載體制劑(例如微球、微膠囊、脂質(zhì)體等)，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。上述任何遞送系統(tǒng)都可局部、眼內(nèi)、結(jié)膜下施用，或通過植入施用，使試劑在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放。制劑可為介載體的形式，例如微膠囊或大膠囊，或生物相容聚合物的基質(zhì)，例如聚己內(nèi)酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚酸酐、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚氨基酸、聚環(huán)氧乙烷、末尾是丙烯酸的聚環(huán)氧乙烷(acrylicterminated polyethylene oxide)、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯腈、聚膦腈、聚原酸酯、乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB)及其他聚合物，例如 U.S.Pat.Nos.6，667，371,6, 613，355,6, 596，296、6，413，536,5, 968，543,4, 079，038,4, 093，709,4, 131，648,4, 138，344,4, 180，646、4，304，767,4, 946，931 (將它們通過引用整體明確并入本文)公開的那些，或可被配制為微球或脂質(zhì)體的脂類。可局部施用微小的或大的制劑，或通過針頭施用，或可被植入。延遲或延長的釋放性質(zhì)可通過多種介載體制劑來提供(經(jīng)包被或未包被的微球、經(jīng)包被或未包被的膠囊、脂類或聚合物類化合物、單片層或多片層結(jié)構(gòu)，及上述這些的組合等)。微球、微膠囊、脂質(zhì)體等的配制和裝載及它們的眼部植入都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如，使用丙氧鳥苷持續(xù)釋放植入體，以治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎，這是VitreoretinalSurgical Techniques,Peyman et al., Eds.(Martin Dunitz,London2001, chapter45)
;Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology, Wise,Ed.(MarcelDekker, New York2000)公開的,將其相關(guān)章節(jié)通過引用整體并入本文。例如,可經(jīng)由睫狀環(huán)插入，將持續(xù)釋放的眼內(nèi)植入體植入玻璃體腔內(nèi)。眼內(nèi)注射可進(jìn)入到玻璃體(玻璃體內(nèi))或結(jié)膜下面(結(jié)膜下)或眼后(眼球后)或特農(nóng)囊下面(特農(nóng)下)，并且可為儲存形式(depotform)?？赏ㄟ^應(yīng)用到眼睛外表面的接觸式鏡片來施用所述組合物，將所述組合物摻入到鏡片材料中(例如，在制造時(shí)，或含在 鏡片溶液中)?？山?jīng)由植入眼內(nèi)的眼內(nèi)鏡片(IOL)來施用所述組合物。可植入的鏡片包括在白內(nèi)障手術(shù)后用于代替患者病眼的任何10L，其包括但不限于 Bausch and Lomb (Rochester N.Y.)、Alcon (Fort Worth Tex.)、Allergan (IrvineCalif)和 Advanced Medical Optics (Santa Ana Calif.)制造的那些。還見 Degim, ITand Celebi, N.(2007), Current Pharmaceutical Design, 13，99-117]。當(dāng)將鏡片植入到鏡片囊中時(shí)，所述組合物向眼睛提供所需作用。適于植入體(鏡片及其他類型)和接觸式鏡片施用的濃度可變化，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。例如，植入體可裝載有高含量的試劑，但被配制或調(diào)控為使以處于上述范圍內(nèi)的所需濃度持續(xù)釋放(例如，持續(xù)釋放制劑)。已發(fā)現(xiàn)，用多至lmg/ml的范圍內(nèi)的scFv正常獲得的抗體濃度并不能很有效地穿透上皮，除非添加額外的穿透增強(qiáng)劑(W00040262)。本發(fā)明提供了高度可溶的抗體，使可制備包含更高濃度(即，大于約2mg/ml,優(yōu)選大于約5mg/ml,最優(yōu)選大于約10mg/ml)的所述抗體的藥物組合物，并將其用于對相應(yīng)抗原相關(guān)疾病的有效治療。因此，本發(fā)明提供了治療抗原相關(guān)疾病的方法，其中所述抗體向抗原-抗體相互作用位點(diǎn)的遞送需要穿透包含緊密連接的組織，尤其是上皮和/或內(nèi)皮。上皮是由細(xì)胞的層構(gòu)成的組織，其襯于生物體的外側(cè)(皮膚)和內(nèi)側(cè)(例如腸)。上皮還包括襯于口腔和體腔內(nèi)的粘膜膜(包含死的鱗狀上皮細(xì)胞)及襯于肺、胃腸道和生殖和泌尿道內(nèi)的上皮細(xì)胞。內(nèi)皮是薄的、平的細(xì)胞的層，其襯于血管和器官的內(nèi)表面。在脈管系統(tǒng)中其形成內(nèi)腔中的循環(huán)血液和血管壁其余部分之間的界面。內(nèi)皮細(xì)胞襯于整個循環(huán)系統(tǒng)，從心臟到最小的毛細(xì)血管。在小血管和毛細(xì)血管中，內(nèi)皮細(xì)胞通常是僅存在的細(xì)胞類型。內(nèi)皮細(xì)胞還控制物質(zhì)進(jìn)出血流。在一些器官中，存在高度分化的內(nèi)皮細(xì)胞，執(zhí)行專門的“過濾”功能。此類獨(dú)特的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)包括腎小球和血腦屏障。內(nèi)皮組織是上皮組織的專門類型。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可實(shí)現(xiàn)對角膜的穿透。角膜上皮覆蓋在角膜前面，其由數(shù)層細(xì)胞構(gòu)成，這使抗體的穿透進(jìn)一步更難。本發(fā)明的抗體優(yōu)選能穿透整個角膜。用于治療葡萄膜炎的理想藥物應(yīng)當(dāng)具備四個關(guān)鍵特征:1)提供迅速的針對急性癥狀的作用啟動。2)顯示與標(biāo)準(zhǔn)局部皮質(zhì)類固醇相當(dāng)?shù)男Ч?)顯示與標(biāo)準(zhǔn)局部皮質(zhì)類固醇相比更好的安全性。4)與標(biāo)準(zhǔn)皮質(zhì)類固醇或標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體相比，具有有利的藥代動力學(xué)性質(zhì)，以使局部應(yīng)用至角膜，及用于玻璃體內(nèi)注射。局部應(yīng)用的TNFa抑制劑(包含足夠的藥代動力學(xué)性質(zhì))可滿足所有這些方面?？筎NFa 的SCFV抗體ESBA105能夠很好地穿透進(jìn)入眼前部，組合其高的TNFa中和活性，最終產(chǎn)生眼內(nèi)濃度，這非常適合治療前葡萄膜炎的療效?？紤]到在患病的眼中發(fā)現(xiàn)的TNFa水平為15pg/ml，而在前部測量到的ESBA105的濃度高達(dá)40，000ng/ml (見圖7)，在眼的玻璃體部分測量到高達(dá)125ng/ml (見圖8)，我們推斷ESBA105不僅適于治療前葡萄膜炎，其還適用于治療不同類型的全葡萄膜炎，例如，眼部貝切特病。本發(fā)明因此提供了通過局部應(yīng)用到眼來治療眼部病癥的方法，尤其是用于治療任何類型的葡萄膜炎、貝切特病、視網(wǎng)膜炎、干眼綜合征、青光眼、Sjiigren綜合征、糖尿病(包括糖尿病性神經(jīng)病)、鞏膜炎、結(jié)膜炎和角膜炎。優(yōu)選通過眼藥水施用、眼膏或通過儲存設(shè)備(例如接觸式鏡片)來進(jìn)行。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體應(yīng)當(dāng)穿透腸的上皮。在肺治療中，應(yīng)當(dāng)使用吸入，以攜帶抗體，從而在肺的上皮處應(yīng)用本發(fā)明的抗體。在本發(fā)明還一方面，抗體被用作為診斷工具。本發(fā)明 的序列如下:SEQ ID NO:I κ I 型的 VL
EIVMTQSPSTLSASV⑶RVIITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKA SSLESGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYKSYffTFGQGTKLTVL GSEQ ID NO:2 κ I 型的 VLEIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLIYA GSILQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKVD IKRSEQ ID NO:3 k 3 型的 VLEIVMTQSPATLSVSPGESAALSCRASQGVSTNVAWYQQKPGQAPRLLIY GATTRASGVPARFSGSGSGTEFTLTlNSLQSEDFAAYYCQQYKHWPPffTFGQGT KVEIKRSEQ ID NO:4 κ 3 型的 VLEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYD TSKRATGTPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDSALYYCQQRNSffPHTFGGGTKLE IKRSEQ ID NO:5 λ I 型的 VLQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNI⑶NYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTCDEADYYCGTWDSSLSGWFGGG TKLTVLG·
SEQ ID NO:6 λ 3 型的 VLSYVLTQPPSVSVAPGQTATVTCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY DDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIRRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHNVFGSG TKVEIKRSEQ ID NO:7 λ 3 型的 VLLPVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGNNIETISVHWYQQKPGQAPVLVVSDD SVRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTK LTVLGSEQ ID NO:8Hlb 型的 VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEff MGRINPDS⑶TIYAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPR GTYLDPffDYFDYffGQGTLVTVSSSEQ ID NO:9H3 型的 VHQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHVLR FLEffLPDAFDIffGQGTLVTVSSSEQ ID NO:10H3 型的 VH EVQLVESGGGVAQPGGSLRVSCAASGFSFSSYAMQWVRQAPGKGLEWV AVISNDGRIEHYADAVRGRFTISRDNSQNTVFLQMNSLRSDDTALYYCAREIGA TGYLDNWGQGTLVTVSSSEQ ID NO:11H3 型的 VHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAGI AVAGTCFDYffGQGTLVTVSSSEQ ID NO:12TB_ADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIY SAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTK LEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGY TFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTV YMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYffGQGTLVTVSSSEQ ID NO:13ESBA105DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIY SAFNRYTGVPSRFSGRGYG
權(quán)利要求
1.配制為用于局部應(yīng)用到上皮組織屏障表面的藥物組合物，所述組合物包含可溶性抗原結(jié)合多肽和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述多肽能在無穿透增強(qiáng)劑的情況下在短于8小時(shí)內(nèi)穿過一層或多層上皮層。
2.權(quán)利要求I的藥物組合物，其中所述組織屏障是眼、鼻腔、口腔、腸道、皮膚、口腔粘膜和泌尿生殖道、關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)間隙、腦和脊椎的表面。
3.權(quán)利要求I或2的藥物組合物，其被用于局部應(yīng)用到眼。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其被配制為所述抗原結(jié)合多肽的眼內(nèi)濃度達(dá)到至少約100ng/ml。
5.權(quán)利要求3或4的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽被配制為用于局部應(yīng)用到眼，并能在無穿透增強(qiáng)劑的情況下穿過角膜并進(jìn)入眼內(nèi)空間。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述組合物是眼藥水的形式。
7.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述組合物的pH小于8。
8.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述多肽足夠可溶到能在短于約4小時(shí)內(nèi)穿過一層或多層上皮層。
9.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述組合物還包含一種或多種穿透增強(qiáng)劑。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述穿透增強(qiáng)劑選自氮酮、苯扎氯銨(BzCl)、BL-7、BL-9、15Bri j35、Bri j78、Bri j98、Bri j99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸鈉、辛酸、西吡氯銨、氯己定、膽酸鹽、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMS0、十烴溴銨、脫氧膽酸鹽、硫酸葡聚糖、EDTA, EDETATE 二鈉、乙醇、褐霉酸鹽、甘膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、L-a -溶血磷脂酰膽堿、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、?；悄懰猁}和?；敲撗跄懰猁}，尤其是癸酸鈉。
11.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述多肽針對靶抗原的結(jié)合親和力為至少10E-6M或更小的KD。
12.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物,其包含濃度大于2mg/ml、或大于2.5mg/ml、優(yōu)選大于5mg/ml、甚優(yōu)選大于約10mg/ml的抗原結(jié)合多肽。
13.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽達(dá)到大于約IOOng/ml的治療濃度。
14.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽在_80°C— 37°C的溫度下穩(wěn)定。
15.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽保持穩(wěn)定至少8周。
16.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽在4°C保持穩(wěn)定至少6周。
17.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽在PBS中于200C -40°C，優(yōu)選于37°C下穩(wěn)定I個月，優(yōu)選至少2個月、最優(yōu)選至少6個月。
18.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽如在被稱為“質(zhì)量控制”的酵母相互作用測定中測量時(shí)在還原條件下穩(wěn)定。
19.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述多肽在生理?xiàng)l件下保持為單體形式。
20.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述多肽在環(huán)境溫度下在PBS中以大于lmg/ml的濃度可溶,優(yōu)選以大于4mg/ml,更優(yōu)選以大于10mg/ml,再更優(yōu)選以大于25mg/ml,最優(yōu)選以大于50mg/ml的濃度可溶。
21.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述多肽在鹽酸胍滴定中表現(xiàn)出至少1.5M、優(yōu)選至少I. 75M、更優(yōu)選至少I. 9M或最優(yōu)選至少2M的轉(zhuǎn)換中點(diǎn)。
22.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述溶解度或穿過動力學(xué)是在標(biāo)準(zhǔn)Caco-2上皮細(xì)胞單層測定中測量的，和/或通過標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)單雜交或雙雜交溶解度測定來預(yù)測的，和/或是在標(biāo)準(zhǔn)小鼠空腸透過性測定中測量的。
23.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述溶解度或穿過動力學(xué)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PEG沉淀測定或自身相互作用層析(SIC)測定測量的。
24.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽包含具有至少一個抗原結(jié)合基序的多肽區(qū)域，所述基序側(cè)翼有至少一個支架區(qū)域。
25.權(quán)利要求24的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽包含被兩個支架區(qū)域所夾的一個抗原結(jié)合基序；被三個支架區(qū)域隔夾的兩個抗原結(jié)合基序；被四個支架區(qū)域隔夾的三個抗原結(jié)合基序；或被八個支架區(qū)域隔夾的六個抗原結(jié)合基序，其中在第四和第五支架區(qū)域之間具有居間接頭區(qū)域。
26.權(quán)利要求24或25的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合基序是CDR，且所述支架區(qū)域是免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)域。
27.權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述支架區(qū)域是備選支架區(qū)域。
28.權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述構(gòu)架區(qū)域通過不依賴于抗原的方法針對酵母細(xì)胞中的高細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和可溶性從天然人抗體庫的至少一部分選出。
29.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述多肽包含三個CDR和四個居間構(gòu)架區(qū)域或六個CDR和八個構(gòu)架區(qū)域和居間接頭區(qū)域。
30.權(quán)利要求29中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述多肽由下式表示Y ;或Z ;或Y-L-Z ;或Z-L-Y ； 其中 Y 是[F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3-F4]，Z 是[F5-CDR1-F6-CDR2-F7-CDR3-F8];其中，Y的構(gòu)架區(qū)域(F1-F4)源自一種或多種人輕鏈構(gòu)架； Z的構(gòu)架區(qū)域(F5-F6)源自一種或多種人輕鏈構(gòu)架； Y的⑶R (⑶Rl-⑶R3)源自能結(jié)合靶抗原的一種或多種供體⑶R ； Z的⑶R (⑶R4-⑶R6)源自能結(jié)合靶抗原的一種或多種供體⑶R ;并且， L是柔性多肽接頭。
31.權(quán)利要求30的藥物組合物，其中Y和Z由本文公開的序列中的任何序列或其共有序列來表示。
32.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗原結(jié)合多肽是包含下述中的至少一種的單鏈抗體 (1)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)構(gòu)架，其與選自SEQ ID N0:l、2、3、.4、5、6和7的VL構(gòu)架具有至少約85%的相似性；及 (2)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)構(gòu)架，其與選自SEQ ID N0:8、9、10和11的VH構(gòu)架具有至少約85%的相似性。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)構(gòu)架與SEQID NO :2具有至少約85%的相似性，且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)構(gòu)架與SEQ ID NO 8具有至少約85%的相似性。
34.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)構(gòu)架與SEQID N0:4具有至少約85%的相似性，且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)構(gòu)架與SEQ ID NO 10具有至少約85%的相似性。
35.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)構(gòu)架與SEQID N0:7具有至少約95%的相似性，且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)構(gòu)架與SEQ ID NO 8具有至少約95%的相似性。
36.權(quán)利要求32-35中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗體針對其抗原的親和力特征在于解離常數(shù)KD小于約lOOnM。
37.權(quán)利要求32-36中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗體具有對人TNFa的特異性。
38.權(quán)利要求32-37中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗體經(jīng)過化學(xué)修飾。
39.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述賦形劑選自苯扎氯銨、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80和氯己定。
40.鑒定抗原結(jié)合多肽的方法，所述多肽具有對應(yīng)于能在短于約8小時(shí)內(nèi)穿過上皮的緊密連接的抗原結(jié)合多肽的穿過動力學(xué)的l/2Vmax值，所述方法包括 (i)在具有可誘導(dǎo)的報(bào)告基因系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)候選抗原結(jié)合多肽，其中在存在具有所述穿過動力學(xué)的抗原結(jié)合多肽時(shí)，所述報(bào)告基因系統(tǒng)產(chǎn)生可被記錄的信號；及 (ii)針對可記錄的信號來篩選所述細(xì)胞，其中所述信號的存在將候選多肽鑒定為具有所述穿過動力學(xué)的抗原結(jié)合多肽。
41.用于實(shí)施權(quán)利要求40的方法的試劑盒。
42.通過權(quán)利要求40的方法鑒定出，及/或由權(quán)利要求32-38中任一項(xiàng)定義的抗原結(jié)合多肽。
43.權(quán)利要求42的抗原結(jié)合多肽，作為藥物。
44.權(quán)利要求42或43的抗原結(jié)合多肽，作為治療與TNFa過量表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物。
45.權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，作為治療眼部病癥的藥物，所述眼部病癥選自葡萄膜炎、貝切特病、視網(wǎng)膜炎、干眼綜合征、青光眼、S.jiigreri綜合征、糖尿病性神經(jīng)病、鞏膜炎和角膜炎。
46.權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，作為治療葡萄膜炎的藥物。
47.權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，作為治療年齡相關(guān)的黃斑變性的藥物。
48.編碼權(quán)利要求42的抗體的經(jīng)分離的多核苷酸分子。
49.包含權(quán)利要求48的經(jīng)分離的多核苷酸分子的克隆或表達(dá)載體。
50.經(jīng)權(quán)利要求49的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞。
51.權(quán)利要求50的宿主細(xì)胞，其是原核或真核細(xì)胞，尤其是大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞。
全文摘要
特異性結(jié)合選定抗原且可通過以下方法獲得的scFv抗體，所述方法包括(i)從可溶且穩(wěn)定的抗體構(gòu)架庫中選出最匹配于以特定結(jié)合特異性抗所述抗原的非人抗體構(gòu)架的可溶且穩(wěn)定的構(gòu)架，(ii)向所述可溶且穩(wěn)定的構(gòu)架提供特異性結(jié)合所述抗原的CDRs，或?qū)⑺龇侨丝贵w的構(gòu)架朝向所述可溶且穩(wěn)定的構(gòu)架的序列進(jìn)行突變，以產(chǎn)生scFv抗體，(iii)檢測所產(chǎn)生抗體的可溶性和穩(wěn)定性，并檢測所產(chǎn)生抗體的抗原結(jié)合性，及(iv)選出可溶、穩(wěn)定且特異性結(jié)合所述抗原的scFV。還提供了包含所述scFv抗體的藥物組合物、治療和診斷與可被所述抗體特異性結(jié)合的抗原過量表達(dá)相關(guān)的疾病的方法。
文檔編號C12N15/63GK103251947SQ20131015938
公開日2013年8月21日 申請日期2007年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日
發(fā)明者A·奧弗德毛爾, A·巴伯利斯, D·厄里什, P·李奇特蘭 申請人:艾斯巴技術(shù),愛爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司