利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶富集長鏈多不飽和脂肪酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用固定化的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶富集長鏈多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括：(1)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生酯化反應(yīng)；(2)從反應(yīng)后的產(chǎn)物中分離出富集的游離型長鏈多不飽和脂肪酸。所述方法利用固定化脂肪酶在催化脂肪酸和醇類酯化過程中對不同鏈長脂肪酸的選擇性催化酯化，實(shí)現(xiàn)了一種從深海魚油或微生物油脂中富集長鏈多不飽和脂肪酸的新方法。
【專利說明】利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶富集長鏈多不飽和脂肪酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginosus)脂肪酶富集長鏈多不飽和脂肪酸的方法，所述方法利用固定化脂肪酶在催化脂肪酸和醇類酯化過程中對不同鏈長脂肪酸的選擇性催化酯化，實(shí)現(xiàn)了一種從深海魚油或微生物油脂中富集長鏈多不飽和脂肪酸的新方法。
技術(shù)背景
[0002]近些年來，EPA、DHA, DPA和ARA等長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)因其獨(dú)特的生理功能一直能為研究的熱點(diǎn)。由于天然存在的PUFAs含量不高，為了提高PUFAs的醫(yī)療和保健價值，越來越多的研究工作開始致力于PUFAs的富集純化方面。
[0003]目前PUFAs分離純化方法主要采用傳統(tǒng)的化學(xué)法，如低溫結(jié)晶法、尿素包合法、銀離子絡(luò)合分離法等。這些方法提純富集PUFAs需要用到大量的有機(jī)試劑，對環(huán)境造成極大的污染，同時工藝繁瑣、比較耗時，易造成PUFAs的氧化。
[0004]脂肪酶催化法反應(yīng)效率高，酶使用量少，反應(yīng)條件溫和，且固定化酶能重復(fù)利用，在水解、醇解、酸解、酯酯交換和酯化等反應(yīng)有著廣泛應(yīng)用。近年來，關(guān)于運(yùn)用脂肪酶來富集PUFAs的研究工作也取得一定進(jìn)展。CN101161819A利用酶法制備了 EPA和DHA總含量達(dá)50%~80%的甘油酯；CN101348807B利用柱層析方法分離提純EPA和DHA，用脂肪酶催化提純后的EPA和DHA與甘油進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到富含EPA和DHA的甘油酯。以上專利方法及目前大多數(shù)文獻(xiàn)報道均先將水解或醇解后的脂肪酸(游離型或乙酯型)進(jìn)行化學(xué)法富集純化PUFAs，然后用脂肪酶催化酯化或酯交換等反應(yīng)，得到純度較高的PUFAs甘油酯。該種方法的弊端在于，工序較為繁瑣，其關(guān)鍵步驟還在于化學(xué)方法提純，使用尿素包合等方法會浪費(fèi)大量的有機(jī)試劑，得率較低，同時會造成尿素等成分的殘留。
[0005]關(guān)于脂肪酶選擇性水解來富集co-3PUFAS的研究國內(nèi)外也有一定的報道，如岡田智子(Tomoko Okada)等人通過篩選脂肪酶來水解富集沙丁魚油中ω _3PUFAs，DHA含量僅從13.62%提升到29.94%。脂肪酶選擇性水解富集法的關(guān)鍵是篩選出良好選擇性的脂肪酶和控制好水解過程參數(shù)，目前文獻(xiàn)報道的能用于催化魚油選擇性水解的脂肪酶主要有假單胞菌(Pseudomonas sp.)、皺裙假絲酵母(Candida rugosa)和柱狀假絲酵母(Candidacylindracea)等價格昂貴的脂肪酶。脂肪酶選擇性水解方法主要缺點(diǎn)是:因水解酶來源限制造成生產(chǎn)成本較高，水解反應(yīng)進(jìn)程難于控制，富集純度偏低，無法滿足高含量o-3PUFAs的市場需求。
[0006]CN200380106326.2公開了在基本不含有機(jī)溶劑的條件下，在脂酶催化劑存在下，使含有游離酸或己酯形式EPA和DHA的海產(chǎn)品油與乙醇進(jìn)行酯化，并進(jìn)行蒸餾分離。其中使用了固定的MML酶(米黑根毛酶脂酶)和固定于硅膠顆粒上的新型Novozyme脂酶(疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TL脂肪酶))。但其轉(zhuǎn)化率不高，其中固定于硅膠顆粒上的新型Novozyme脂酶的轉(zhuǎn)化率僅僅43%。此外，W02008SE290A公開了多不飽和脂肪酸富集的海洋石油可用于形成具有水富集組分的乳液(用于形成例如調(diào)味品和沙司)，它包括二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸以及甘油一酸酯和甘油二酯。其中，使用了固定于聚丙烯MPlOOO上的TL酶。但其對PUFAs的富集效果仍舊不高,還不如固定的米黑根毛酶脂酶(Rhizo-mucormiehei，RM)、PS (Pseudomonas sp.)和 PF (Pseudomonas fluorescens)。
[0007]因此，現(xiàn)有技術(shù)急需一種新的富集PUFAs的方法，具有操作簡便、成本低廉、富集純度更高的特點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，提供一種利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TL脂肪酶)富集長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的方法，所述方法包括:
[0009](I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生酯化反應(yīng)，所述游離的脂肪酶含有PUFAs ；
[0010](2)從反應(yīng)后的產(chǎn)物中分離出富集的游離型PUFAs。
[0011]本發(fā)明還提供了一種利用固定化脂肪酶純化長鏈多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括:
[0012](I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)；
[0013](2)從反應(yīng)后的產(chǎn)物中分離出含有游離型PUFAs的游離脂肪酸。
[0014]本發(fā)明還提供了一種利用固定化脂肪酶降低游離脂肪酸中短碳鏈脂肪酸含量的方法，所述方法包括:
[0015](I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)。
[0016]本發(fā)明還提供了一種利用固定化脂肪酶提高游離脂肪酸中長鏈多不飽和脂肪酸含量的方法，所述方法包括:
[0017](I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)。
[0018]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，使用的游離的脂肪酸通過堿催化水解、酶法水解或高壓高溫水解含有PUFAs的油脂獲得。
[0019]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，本發(fā)明所述方法還包括提供游離的脂肪酸的步驟:
[0020](a)在抽真空或保護(hù)氣氛下，對含有PUFAs的油脂進(jìn)行堿催化水解；
[0021](b)加入萃取劑進(jìn)行萃取，并將所得水層進(jìn)行酸化后再次萃取，獲得游離的脂肪酸。
[0022]在本發(fā)明中，含有PUFAs的油脂包括魚油和微生物油脂，優(yōu)選的，所述魚油包括沙丁魚油、金槍魚油、鯡魚油、鱈魚肝油、三文魚油、鮪魚油、鮭魚油、鱔魚油、鯖魚油以及它們的組合；所述微生物油脂包括DHA藻油、ARA油脂以及它們的組合。
[0023]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(a)的保護(hù)氣氛選自氮?dú)獗Ｗo(hù)氣氛、IS氣保護(hù)氣氛、氦氣保護(hù)氣氛。
[0024]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(a)使用選自KOH醇-水溶液、NaOH醇-水溶液的堿溶液進(jìn)行堿催化水解。優(yōu)選地，所述堿催化水解在40-80°C下、在攪拌條件下回流0.5-2小時。
[0025]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(b)中，所述萃取劑選自正己烷、正庚烷、石油醚。所述酸化使用選自HC1、HN03來進(jìn)行。其中，所述酸化優(yōu)選酸化至pH = I~3。
[0026]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，所述方法還包括將步驟(b)獲得游離的脂肪酸進(jìn)行干燥，并去除萃取劑。其中，用于干燥的干燥劑選自無水Na2SO4、無水MgSO4、無水CuSO4、P2O5。所述去除萃取劑的方法包括旋蒸、氮吹除法、真空干燥。
[0027]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(1)的保護(hù)氣氛選自氮?dú)獗Ｗo(hù)氣氛、氬氣保護(hù)氣氛、氦氣保護(hù)氣氛。
[0028]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，所述醇包括碳原子數(shù)為I~12的一元醇、二元醇和三元醇。優(yōu)選，所述醇包括碳原子數(shù)為2~12的一元醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇。更優(yōu)選，所述醇包括碳原子數(shù)為3~12的一元醇和丙三醇。
[0029]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(1)中醇和游離脂肪酸的摩爾比為10:1~1:10。
[0030]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，所述固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶為固定于離子交換樹脂的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶。
[0031]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，所述固定于離子交換樹脂的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶通過以下方式制得:(i)將離子交換樹脂與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶接觸，以獲得固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶；在一個更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述方法還進(jìn)一步包括以下步驟:
(ii)將固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶干燥。
[0032]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，所述離子交換樹脂與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶，在25-35°C, 150-300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)條件下，接觸2_8小時；在一個更優(yōu)選的實(shí)施例中，每ml所述疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶液中加入0.l-5g離子交換樹脂，優(yōu)選為0.4-2.5g離子交換樹脂。
[0033]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，所述離子交換樹脂為苯乙烯系樹脂、丙烯酸系樹脂、陽離子樹脂或陰離子樹脂，優(yōu)選的，所述離子交換樹脂為弱堿性離子交換樹脂。
[0034]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(1)中所述固定于離子交換樹脂的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的使用量為醇和脂肪酸總質(zhì)量(下文中，醇和脂肪酸稱為反應(yīng)底物)的1%~20%。
[0035]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，抽真空條件下，反應(yīng)容器內(nèi)壓強(qiáng)為0.1~lKPa。
[0036]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(1)中，脂肪酸與醇反應(yīng)4~24小時。
[0037]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，在酯化反應(yīng)中加入帶水劑，優(yōu)選的帶水劑為分子篩。
[0038]在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，步驟(1)中，脂肪酸與醇在20_80°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行2-24小時。其中，在步驟(1)中，碳數(shù)小于20的脂肪酸與醇類發(fā)生反應(yīng)生成脂肪酸酯，而PUFAs依然以游離脂肪酸形式存在，從而實(shí)現(xiàn)PUFAs的分離和富集。
[0039]本發(fā)明的上述方法與傳統(tǒng)富集PUFAs的物理化學(xué)方法相比，除具有酶法反應(yīng)的一系列優(yōu)勢外，大大減少了有機(jī)試劑的使用，簡化了工藝；與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的脂肪酶選擇性水解富集PUFAs的方法相比，本發(fā)明所采用富集方法的原理是基于選擇性酯化而非選擇性水解，富集純度較高，而且Thermomyces Ianuginosus脂肪酶來源于工業(yè)化生產(chǎn),價格較為低廉，大大節(jié)約了成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1是本發(fā)明利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶富集長鏈多不飽和脂肪酸方法的一個實(shí)例的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0041]以下，發(fā)明人結(jié)合附圖對本發(fā)明利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyces Ianuginosus)富集長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但需要注意的是，這些說明并不意圖用于限制本申請要求的范圍。
[0042]不同于現(xiàn)有技術(shù)中采用了包括選擇性水解的富集長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的方法，本發(fā)明所述方法實(shí)際采用了包括選擇性酯化的富集長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的方法。具體來說，本發(fā)明提供一種利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶富集長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的方法。將含有PUFAs的游離脂肪酸，在脂肪酶催化作用下與醇類進(jìn)行酯化反應(yīng)，短碳鏈脂肪酸(碳數(shù)小于20)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)生成酯類，而PUFAs仍以游離脂肪酸形式存在，進(jìn)而達(dá)到富集效果。本發(fā)明通過篩選對比不同的固定化脂肪酶(包括本發(fā)明所述固定于離子交換樹脂的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TL脂肪酶))和商品酶)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明固定化TL脂肪酶最為適合本工藝方法，酯化選擇性較好，PUFAs富集純度較高。
[0043]本發(fā)明還提供了一種利用固定化脂肪酶純化長鏈多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括:(1)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)；(2)從反應(yīng)后的產(chǎn)物中分離出含有游離型PUFAs的游離脂肪酸。該方法將含有PUFAs游離脂肪酸，在脂肪酶催化作用下與醇類進(jìn)行酯化反應(yīng)，短碳鏈脂肪酸(碳數(shù)小于20)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)生成酯類，而PUFAs仍以游離脂肪酸形式存在，從而提高PUFAs的純度，進(jìn)而達(dá)到純化效果。
[0044]本發(fā)明還提供了一種利用固定化脂肪酶降低游離脂肪酸中短碳鏈脂肪酸含量的方法，所述方法包括:(I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)。該方法將含有PUFAs游離脂肪酸，在脂肪酶催化作用下與醇類進(jìn)行酯化反應(yīng)，短碳鏈脂肪酸(碳數(shù)小于20)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)生成酯類，進(jìn)而達(dá)到降低游離脂肪酸中短碳鏈脂肪酸含量的效果。
[0045]本發(fā)明還提供了一種利用固定化脂肪酶提高游離脂肪酸中長鏈多不飽和脂肪酸含量的方法，所述方法包括:(I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)。該方法將含有PUFAs游離脂肪酸，在脂肪酶催化作用下與醇類進(jìn)行酯化反應(yīng)，短碳鏈脂肪酸(碳數(shù)小于20)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)生成酯類，而PUFAs仍以游離脂肪酸形式存在，進(jìn)而達(dá)到提高游離脂肪酸中長鏈多不飽和脂肪酸含量的效果。
[0046]參見圖1，在該實(shí)例中，本發(fā)明利用固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(ThermomycesIanuginosus)富集長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的方法可以包括以下步驟:
[0047]I)堿催化水解:在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，一定量的KOH醇-水溶液和含有PUFA的油脂在60°C磁力攪拌條件下回流I小時，使油脂水解。反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量的水，用正己烷萃取出未皂化物，水化層用HCl酸化至pH=l，用正己烷萃取出游離脂肪酸，然后用無水Na2SO4干燥后，旋蒸或氮吹除去溶劑，得到游離脂肪酸。
[0048]2)酶催化選擇性酯化:按照一定比例，以醇類和步驟I)所得游離脂肪酸為底物，加入固定化TL脂肪酶，在抽真空或充氮環(huán)境下，反應(yīng)，則碳數(shù)小于20的脂肪酸與醇類發(fā)生反應(yīng)生成脂肪酸酯，而PUFAs依然以游離脂肪酸形式存在，從而達(dá)到將PUFAs與其他脂肪酸分離的效果。
[0049]在本發(fā)明中，提供游離的脂肪酸的方法是現(xiàn)有技術(shù)人員熟知的方法，除圖1所示的堿催化水解外，還可以包括但不限于酶法水解、高壓高溫水解等方法。
[0050]在本發(fā)明中，“堿催化水解”是指一種制備游離脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入堿溶液，如NaOH-醇溶液，以催化油脂水解。
[0051]在本發(fā)明中，“酶法水解”是指一種制備游離脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水，并使用酶(包括但不限于固定化酶)，例如脂肪酶、磷脂酶等作為催化劑在低溫條件下使該混合物反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，固定化酶指的是固定在載體上的酶，例如固定化脂肪酶等。
[0052]在本發(fā)明中，“高壓高溫水解”是指一種制備脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水并使該混合物在高溫高壓條件下反應(yīng)。
[0053]在本發(fā)明中，要水解的原料油脂為富含長鏈多不飽和脂肪酸的油脂，包括但不限于深海魚油、微生物油脂或其混合物，含有PUFAs的魚油包括但不限于:沙丁魚油、金槍魚油、鯡魚油、鱈魚肝油、三文魚油、鮪魚油、鮭魚油、鱔魚油、鯖魚油，微生物油脂包括蛋白限于DHA藻油和ARA油脂。
[0054]在本發(fā)明中，所用醇類包括:碳數(shù)為I~12的一元醇類、乙二醇、丙二醇、甘油等。
[0055]在本發(fā)明中，脂肪酸和醇的比例為摩爾比10:1~1:10。
[0056]在本發(fā)明中，固定化酶可通過以下方法制備:稱取40_100g弱堿性離子交換樹脂于三角瓶(例如，容量為250-500ml)中，加入40_100ml TL酶液，在25_35°C搖床中150-300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)振蕩2-8小時，然后將酶取出放入干凈的培養(yǎng)皿中，放入通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行干燥，得到固定化酶。
[0057]在本發(fā)明中，固定化TL脂肪酶的使用量為反應(yīng)底物質(zhì)量(醇和脂肪酸質(zhì)量)的1% ~20%。
[0058]在本發(fā)明中，抽真空條件下，反應(yīng)容器內(nèi)壓強(qiáng)為0.1~lKPa。
[0059]在本發(fā)明中，在充氮條件下，需要在反應(yīng)I~3小時后，加入分子篩除水。
[0060]在本發(fā)明中，反應(yīng)溫度為20~80°C。
[0061]在本發(fā)明中，反應(yīng)時間為2~24小時。
[0062]在本發(fā)明中，所述離子交換樹脂包括苯乙烯系樹脂、丙烯酸系樹脂、陽離子樹脂(強(qiáng)酸性陽離子樹脂和弱酸性陽離子樹脂)、陰離子樹脂(強(qiáng)堿性陰離子樹脂和弱堿性陰離子樹脂)等等。優(yōu)選的，本發(fā)明所述離子交換樹脂為弱堿性陰離子交換樹脂。在本發(fā)明中，所述弱堿性陰離子交換樹脂主要交換基團(tuán)為伯、仲、叔胺基的陰離子交換樹脂。這類樹脂含有弱堿性基團(tuán)，如伯胺基(亦稱一級胺基)-NH2、仲胺基(二級胺基)-NHR、或叔胺基(三級胺基)-NR2,它們在水中能離解出OH —而呈弱堿性。這種樹脂的正電基團(tuán)能與溶液中的陰離子吸附結(jié)合，從而產(chǎn)生陰離子交換作用。這種樹脂在多數(shù)情況下是將溶液中的整個其他酸分子吸附。它只能在中性或酸性條件(如PHl~9)下工作。它可用Na2C03、NH4OH進(jìn)行再生。所述弱堿性陰離子交換樹脂可從市場購買，如可從上海樹脂有限公司、南開化工廠、浙江爭光實(shí)業(yè)股份有限公司、晨光化工研究院樹脂廠、江蘇色可賽思樹脂有限公司、美國Rohm&Hass公司、Success公司、Dow化學(xué)公司等購買獲得。
[0063]在本發(fā)明中，“長鏈多不飽和脂肪酸”指的是:碳鏈長度為20碳以上，不飽和度大于3的脂肪酸，包括但不限于二十二碳六烯酸(DHA)、和二十碳五烯酸(EPA)。
[0064]以下，發(fā)明人結(jié)合具體的實(shí)施方式來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非另有說明，本說明書中脂肪酸含量數(shù)據(jù)均為質(zhì)量百分比。
[0065]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的固定化TL脂肪酶采用以下方法制備:
[0066]稱取10_50g弱堿性離子交換樹脂于250ml三角瓶中，加入10_50ml TL酶液，在4-60°C搖床中以10-200轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的速度振蕩0.5-16小時，然后將酶取出放入干凈的培養(yǎng)皿中，放入通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行干燥。
[0067]其中，弱堿性離子交換樹脂可以使用但不限于Amberlite IRA900C1, AmberliteFPA91C1, Amberlite FPA54, D301R, D392, D380, D382, D284, D280, JK206, NKX-8，DuoliteA-161, LX1000HA, Dowexl*2。
[0068]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，甲酯化方法參考GB-T17376-2008 ;氣相色譜分析條件參考 GB-T17377-2008 ；
[0069]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，金槍魚油、鯡魚油、鱈魚肝油和沙丁魚油購自NorskHydro A/S ;DHA藻油購自馬泰克公司。
[0070]實(shí)施例1DHA藻油中PUFAs的富集純化
[0071](I)堿催化水解:首先將36.8gK0H溶于70.4mL水和422.4mL95%乙醇，配制成KOH醇-水溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入160g DHA藻油，50°C磁力攪拌條件下回流I小時，使油脂水解。反應(yīng)結(jié)束后，加入381mL水，用500mLX2正己烷萃取出未皂化物，水化層用3N的HCl酸化至pH=l,用300mLX2正己燒萃取出游離脂肪酸,然后用無水Na2SO4干燥后,旋蒸除去溶劑，得到游離脂肪酸。
[0072](2)稱取9.57g步驟(1)中制備的游離脂肪酸和3g甘油(游離脂肪酸和甘油的摩爾比約為1:1)于50mL反應(yīng)器內(nèi)，加入10%固定化TL脂肪酶(以反應(yīng)底物(即游離脂肪酸和甘油的總質(zhì)量)質(zhì)量計(jì))，在60°C的抽真空條件下(表壓讀數(shù)為0.2kPa)以250rpm的攪拌速率進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)每隔4小時進(jìn)行取樣，用薄層色譜(TLC)方法(展開劑為，正己烷:乙醚:甲酸=80:20:2)分離后，刮下游離脂肪酸條帶，進(jìn)行甲酯化處理，氣相色譜(GC)分析測定游離酸中PUFAs的含量變化。
[0073]表1固定化TL脂肪酶TL脂肪酶在不同反應(yīng)時間內(nèi)富集PUFAs的效果
[0074]

【權(quán)利要求】
1.一種利用固定化脂肪酶富集長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAS)的方法， 所述方法包括: (1)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)； (2)從反應(yīng)后的產(chǎn)物中分離出富集游離型PUFAs的游離脂肪酸。
2.一種利用固定化脂肪酶純化長鏈多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括: (1)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)； (2)從反應(yīng)后的產(chǎn)物中分離出含有游離型PUFAs的游離脂肪酸。
3.一種利用固定化脂肪酶降低游離脂肪酸中短碳鏈脂肪酸含量的方法，所述方法包括: (I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)。
4.一種利用固定化脂肪酶提高游離脂肪酸中長鏈多不飽和脂肪酸含量的方法，所述方法包括: (I)在抽真空或保護(hù)氣氛下，在固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶存在下，使游離的脂肪酸與醇發(fā)生反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述游離的脂肪酸通過堿催化水解、酶法水解或高壓高溫水解含有PUFAs的油脂獲得。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述游離的脂肪酸通過以下步驟制備: (a)在抽真空或保護(hù)氣氛下，對含有PUFAs的油脂進(jìn)行堿催化水解； (b)加入萃取劑進(jìn)行萃取，并將所得水層進(jìn)行酸化后再次萃取，獲得游離的脂肪酸。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶為固定于離子交換樹脂的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述固定于離子交換樹脂的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶通過以下方式制得:(i)將離子交換樹脂與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶接觸，以獲得固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶； 優(yōu)選的，所述方法還進(jìn)一步包括以下步驟:(ii)將固定化疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶干燥。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟(i)中，所述離子交換樹脂與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶，在25-35°C，150-300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)條件下，接觸2_8小時； 優(yōu)選的，每ml疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶液中加入0.l_5g離子交換樹脂，優(yōu)選為0.4-2.5g離子交換樹脂。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述離子交換樹脂為苯乙烯系樹脂、丙烯酸系樹脂、陽離子樹脂或陰離子樹脂；優(yōu)選的，所述離子交換樹脂為弱堿性離子交換樹脂。
【文檔編號】C12P7/64GK104130860SQ201310161447
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月3日
【發(fā)明者】楊武林, 鄭妍, 辛本榮, 楊天奎, 徐學(xué)兵 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司