專利名稱：BGIos040基因、構(gòu)建體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及BGIOS040基因、構(gòu)建體及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及分離的寡核苷酸、構(gòu)建體、重組細(xì)胞、制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，以及制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
分蘗是決定水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，在生產(chǎn)實(shí)踐中主要通過栽培措施和育種手段來增加有效分蘗，減少無效分蘗。目前，隨著水稻分子育種理論與技術(shù)的不斷成熟和完善，遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化，新型測(cè)序技術(shù)結(jié)合基因組學(xué)方法鑒定受人工選擇的基因資源，使得利用基因組重測(cè)序技術(shù)發(fā)掘分蘗相關(guān)基因和遺傳轉(zhuǎn)化成為可能。然而，現(xiàn)階段分蘗相關(guān)基因的發(fā)掘和遺傳轉(zhuǎn)化研究仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠提高植物持續(xù)分蘗能力及產(chǎn)量的手段。需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人從野生稻中發(fā)現(xiàn)了分蘗相關(guān)基因BG1s040基因，然后通過多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 BG1s040基因的轉(zhuǎn)化能夠顯著提高受體植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株的分蘗數(shù)目，進(jìn)而能夠顯著提高其產(chǎn)量。具體地，發(fā)明人從野生稻中擴(kuò)增出分蘗相關(guān)基因BG1s040基因——制備含有該基因的構(gòu)建體(即重組表達(dá)載體)——通過直接法將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化
根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404--利用上述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組
織——愈傷組織⑶S染色——再生植株⑶S染色——轉(zhuǎn)基因小苗移植到大田中進(jìn)行性狀觀察，并測(cè)定其產(chǎn)量——轉(zhuǎn)基因植物Tl、T2代植株田間種植及農(nóng)藝性狀觀測(cè)。從而，證明了BG1s040基因?yàn)橹参锓痔Y相關(guān)基因，利用該基因轉(zhuǎn)化植物能夠顯著提高受體植物的持續(xù)分蘗能力，提高其T2代植株分蘗數(shù)目，進(jìn)而能夠顯著提高植物的產(chǎn)量。由此，本發(fā)明提出了 BG1s040基因，包含該基因的構(gòu)建體及其在提高植物持續(xù)分蘗能力中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該分離的寡核苷酸具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。其中，該分離的寡核苷酸即為BG1s040基因。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將該分離的寡核苷酸引入植物細(xì)胞中，能夠顯著提高植物細(xì)胞中BG1s040基因的表達(dá)，進(jìn)而能夠顯著增強(qiáng)植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株分蘗數(shù)目，從而能夠有效提高植物產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包含前面所述的分離的寡核苷酸。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該構(gòu)建體能夠有效地將該分離的寡核苷酸即BG1s040基因引入植物細(xì)胞中，進(jìn)而，能夠通過植物細(xì)胞中表達(dá)BG1s040基因而顯著增強(qiáng)植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株的分蘗數(shù)目，從而能夠有效提高植物產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的構(gòu)建體呈選自質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒以及病毒的至少一種的形式。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。由此，能夠有效提高利用本發(fā)明的構(gòu)建體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的效率。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該重組細(xì)胞含有前面所述的分離的寡核苷酸或構(gòu)建體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該重組細(xì)胞轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，能夠有效地將該分離的寡核苷酸即BG1s040基因引入植物細(xì)胞中，進(jìn)而，能夠通過在植物細(xì)胞中表達(dá)BG1s040基因而顯著增強(qiáng)植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株的分蘗數(shù)目，從而能夠有效提高植物產(chǎn)量。根據(jù)本 發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該方法包括:使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用該方法能夠有效制備包含BG1s040基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，進(jìn)而利用該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞能夠有效獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法中，轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法進(jìn)行的。由此，能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法中，受體植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞均呈細(xì)胞、組織或器官的形式，優(yōu)選呈組織的形式，更優(yōu)選呈愈傷組織的形式。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，采用愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由此，能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物是通過前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法獲得的。由此，利用該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，能夠有效地獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:利用前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；以及對(duì)該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，后代植株分蘗數(shù)目明顯提高，植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物或其后代。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，轉(zhuǎn)基因植物或其后代是通過前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物的方法獲得的。相對(duì)于野生型，該轉(zhuǎn)基因植物或其后代，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，植物產(chǎn)量顯著提高。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了另一種制備轉(zhuǎn)基因植物方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:1)將權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或利用權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織培育轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述植物為單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，特別優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。利用該方法能夠有效地獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)、后代植株分蘗數(shù)目明顯提高、植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1顯示了實(shí)施例3中制備的經(jīng)重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BG1s040轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織與對(duì)照的GUS染色結(jié)果；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，經(jīng)含有p6+BG1s040重組載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的水稻幼苗及對(duì)照的根GUS染色結(jié)果；圖3顯示了實(shí)施例5中篩選獲得的TO代BG1s040基因轉(zhuǎn)基因苗及野生型對(duì)照的根系形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并證明了 BG1s040基因是與控制水稻分蘗性狀相關(guān)的功能基因，進(jìn)而提出了下述的本發(fā)明的提高植物持續(xù)分蘗能力及產(chǎn)量的手段。分離的寡核苷酸、構(gòu)建體及重組細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的 一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該分離的寡核苷酸具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。其中，該分離的寡核苷酸即為BG1s040基因。發(fā)明人驚 奇地發(fā)現(xiàn)，將該分離的寡核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中，能夠顯著提高植物細(xì)胞中BG1s040基因的表達(dá)，進(jìn)而能夠顯著增強(qiáng)植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株分蘗數(shù)目，從而能夠有效提高植物產(chǎn)量。其中，BG1s040基因的核苷酸序列如下所示:ATGAGGAAGGAAATTGTCATCAGGCTGCAGAGCTCTGAGAAGGGCCACAAGAAAGCTATCAAGGTTGCTGCTGCAGTCTCCGGTGTGGAATCCGTGACGCTCGCCGGCGAGGACAAGAACCTGCTGCTGGTGATCGGCTTCGGGGTGGACTCCAACGACCTCACCGAGAAGCTGCGGAGGAAGGTCGGCCACGCCGAGGTGGTGGAGCTGCGCACCGTCGACGCCGACGAGCTCATGCGCGTCGCCGCCGCCAACCAGTACCCGTACCGCTACTACCCCGGCGCGCCGCCCCCGGCCCCGTACTACGGCAACGGCGGGTACCCTCCTCCTCACCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGTGGCTACTACACGCCGATGACGATGGCCACGGGTGGCTACTACGGCGGCGGCGGCGGCGGGTACCCGCAGTACGGGCAGTCGTCGTCGTACCCGCAGTACGGGCAGTCGTCGTCGTACTACCCGCCGGCGGCGGCGGCGACGACGAACACGCACACCGTCGTGCACCACCAGTACGCCAACAACGACCCGGACAGCTGCGCCATCATGTAG (SEQ ID NO:7)需要說明的是，本發(fā)明中所采用的BG1s040基因來源于普通野生稻元江(普通野生稻元江種子于2010年9月6日保藏于地址為中國.武漢.武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:P201011)o根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，本發(fā)明的分離的寡核苷酸可以具有與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的再一些實(shí)施例，本發(fā)明的分離的寡核苷酸還可以為選自下列變體的任意一種:I)在高等嚴(yán)緊條件下能夠與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列雜交的寡核苷酸，2)對(duì)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾而獲得的寡核苷酸，以及3)與SEQ ID NO:7所不的核苷酸序列具有至少90%的序列同一丨丨生的寡核苷酸。為了便于理解，下面將對(duì)高等嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交進(jìn)行解釋。首先，可以根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來對(duì)雜交條件進(jìn)行分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)進(jìn)行衡量。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm - 50C (低于探針Tm5°C )高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5 — 10°C 中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10 - 200C ;“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20 — 25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC=極低嚴(yán)緊性；3XSSC=低至中等嚴(yán)緊性；1XSSC=中等嚴(yán)緊性；0.5XSSC=高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。因而,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解,實(shí)驗(yàn)人員能夠通過改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度等，容易地控制雜交嚴(yán)緊性。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明前面所述的“在高等嚴(yán)緊條件下能夠與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列雜交的寡核苷酸”，其所述的雜交的高嚴(yán)緊條件為:用 5XSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA (pH8.0)溶液預(yù)洗；在 60-65。?；?65_70°C下在5XSSC中雜交過夜；隨后用含0.1%SDS的2X、0.5X和0.2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 需要說明的是，在高等嚴(yán)緊條件下能夠與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列雜交的寡核苷酸，其具有與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相同或相似的促進(jìn)植物分蘗數(shù)目增多的活性。另外，在本發(fā)明中，所述“對(duì)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾而獲得的寡核苷酸“，是指分別或同時(shí)在SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個(gè)，或者不超過2-30個(gè)，或者不超過3-20個(gè),或者不超過4-15個(gè),或者不超過5-10個(gè),或者不超過6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。需要說明的是，該“對(duì)SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾而獲得的寡核苷酸“具有與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相同或相似的促進(jìn)植物分蘗數(shù)目增多的活性。在本文中所述的“與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”指的是這樣一種寡核苷酸:相對(duì)于SEQ ID NO:7所不的參考核苷酸序列的每100個(gè)核苷酸中，除了 10個(gè)核苷酸不同外，該寡核苷酸的其他核苷酸序列與參考序列均相同。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，“與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”可以通過下列方法的至少之一獲得:以SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列為參考序列，將該參考序列中多達(dá)10%的核苷酸刪除或用另一核苷酸替代；將一些核苷酸插入到該參考序列中，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列總核苷酸數(shù)的5% ;在參考序列的基礎(chǔ)上，選取一些核苷酸進(jìn)行刪除、插入和替換的組合，其中被刪除、插入或替換的核苷酸可多達(dá)參考序列總核苷酸數(shù)的5%。其中，需要說明的是，上述對(duì)參考序列進(jìn)行的變形可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，而與參考序列不同的核苷酸或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過BLAST、BLAST2.0 (執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得)確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)(例如可參見 Altschul 等(1977) Nucl.Acid.Res.25:3389-3402 和 Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410，通過參照將其全文并入本文)。其中，在本發(fā)明中，所述“與SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”包括與SEQ ID N0:7所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)通過例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析確定序列同一性時(shí)，該寡核苷酸是指與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相比具有至少90%序列同一性，優(yōu)選至少具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。需要說明的是,上述“與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的寡核苷酸”具有與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列相同或相似的促進(jìn)植物分蘗數(shù)目增多的活性。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包含前面所述的分離的寡核苷酸。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該構(gòu)建體能夠有效地將該分離的寡核苷酸即BG1s040基因?qū)胫参锛?xì)胞中，進(jìn)而，能夠通過在植物細(xì)胞中表達(dá)BG1s040基因顯著增強(qiáng)植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株的分蘗數(shù)目，從而能夠有效
提高植物產(chǎn)量。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“構(gòu)建體”是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄修D(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，使目的核酸序列整合到宿主細(xì)胞的基因組上，以獲得重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建體的形式不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其可以為質(zhì)粒、噬 菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡(jiǎn)單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長(zhǎng)度不受任何特別限制。對(duì)于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為DNA，因?yàn)镈NA相對(duì)于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建體中還可以包含其他的元件，從而為構(gòu)建體賦予額外的有益效果。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含啟動(dòng)子序列和終止子序列。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導(dǎo)與其可操縱地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“可操縱地”指的是核酸表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子、信號(hào)序列、增強(qiáng)子等與目標(biāo)核酸序列之間的功能連接，其中當(dāng)合適的分子例如轉(zhuǎn)錄活化分子與表達(dá)控制序列結(jié)合時(shí)，表達(dá)控制序列影響著對(duì)應(yīng)于目標(biāo)核酸序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。由此，可以直接通過構(gòu)建體在植物細(xì)胞中引入特定的啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子可以用于啟動(dòng)SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列即BG1s040基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，由此，可以提高所獲得的重組細(xì)胞中BG1s040基因的表達(dá)效率。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的構(gòu)建體進(jìn)一步包括玉米泛素(ubi)啟動(dòng)子和NOS終止子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記基因。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“篩選標(biāo)記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產(chǎn)物能夠賦予連同載體接受該基因的細(xì)胞一種特殊的性質(zhì)，該特殊的性質(zhì)使得接受該基因的細(xì)胞與未接受該基因的細(xì)胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選接受構(gòu)建體的植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，篩選標(biāo)記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)樗幬锟剐曰?。由此，容易地通過接受外源構(gòu)建體的重組細(xì)胞的抗藥性來進(jìn)行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加殺菌劑，則相應(yīng)連同載體接受并表達(dá)殺菌劑抗性基因的細(xì)胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，該篩選標(biāo)記基因可以為選自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和羧芐青霉素抗性基因的至少一種，優(yōu)選霉素抗性基因和羧芐青霉素抗性基因。由此，能夠進(jìn)一步提高篩選接受外源構(gòu)建體的重組細(xì)胞的效率。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括編碼報(bào)告蛋白的序列。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“報(bào)告蛋白”是指這樣的一種蛋白質(zhì)，其在表達(dá)后，能夠產(chǎn)生可以直接或者間接檢測(cè)的信號(hào)，進(jìn)而能夠反映構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，報(bào)告蛋白的種類并不受特別限制，只要其具有可檢測(cè)的活性即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，報(bào)告蛋白可以是一種能夠產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)的蛋白質(zhì)例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白例如綠色熒光蛋白等。由此，可以根據(jù)常規(guī)的方法，對(duì)所述報(bào)告蛋白進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如可以采用:比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對(duì)報(bào)告蛋白進(jìn)行檢測(cè)。從而，通過上述方法，就能夠便捷高效地確定構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。上面對(duì)根據(jù)本發(fā)明 實(shí)施例的構(gòu)建體進(jìn)行了描述。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，構(gòu)建體還可以包含其他常規(guī)的元件以促進(jìn)構(gòu)建體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中并且整合到宿主細(xì)胞的基因組上，正常發(fā)揮功能，例如復(fù)制起點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)等。在此對(duì)這些元件不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該重組細(xì)胞含有前面所述的分離的寡核苷酸或構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該重組細(xì)胞可以為大腸桿菌細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞，優(yōu)選為農(nóng)桿菌細(xì)胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該重組細(xì)胞轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，能夠有效地將該分離的寡核苷酸即BG1s040基因引入植物細(xì)胞中，進(jìn)而，能夠通過在植物細(xì)胞中表達(dá)BG1s040基因而顯著增強(qiáng)植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株的分蘗數(shù)目，從而能夠有效提高植物產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、植物及其制備方法根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該方法包括:使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用該方法能夠有效制備包含BG1s040基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，進(jìn)而利用該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞能夠有效獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所適用的植物并不受特別限制，即受體植物細(xì)胞的來源不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該受體植物細(xì)胞可以來源于單子葉植物。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，該單子葉植物包括但不限于水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，優(yōu)選為水稻，所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)I號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，津原101以及日本晴(其中，上述水稻品種均為市售可得的品種，例如可購自安徽徽商農(nóng)家福有限公司)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，該宿主細(xì)胞來源于日本晴水稻。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，使用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物細(xì)胞的方法不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法進(jìn)行所述轉(zhuǎn)化。由此，可以提高將構(gòu)建體引入受體植物細(xì)胞中的效率，并且可以方便地篩選目的核酸序列與受體植物細(xì)胞的染色體成功地發(fā)生整合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，進(jìn)一步能夠提高制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的效率。需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”與“轉(zhuǎn)染”是可以互換使用的，均是指將外源核酸序列引入宿主細(xì)胞(即受體植物細(xì)胞)中的操作。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法中，受體植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞均呈細(xì)胞、組織或器官的形式，優(yōu)選呈組織的形式，更優(yōu)選呈愈傷組織的形式。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，采用愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。由此，能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。需要說明的是，在本文中所使用的表達(dá)方式“分離轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞”是指，根據(jù)構(gòu)建體所攜帶的核酸序列例如篩選標(biāo)記基因或報(bào)告蛋白基因，以及所采用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，選擇相應(yīng)的篩選方法，以便區(qū)分接受目的基因的細(xì)胞與未接受目的因的細(xì)胞，分離選擇出接受構(gòu)建體的植物細(xì)胞。例如，當(dāng)構(gòu)建體攜帶有篩選標(biāo)記基因例如藥物抗性基因時(shí)，能夠通過接受外源構(gòu)建體的重組細(xì)胞的抗藥性來進(jìn)行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加殺菌劑，則相應(yīng)連同載體接受并表達(dá)殺菌劑抗性基因的細(xì)胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來；當(dāng)構(gòu)建體攜帶有報(bào)告蛋白例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白時(shí)，可以采用:比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對(duì)報(bào)告蛋白進(jìn)行檢測(cè)，則連同載體接受并表達(dá)報(bào)告蛋白基因的細(xì)胞發(fā)出熒光。從而，通過上述方法，就能夠便捷高效地區(qū)分接受目的基因的細(xì)胞與未接受目的因的細(xì)胞，進(jìn)而篩選分離出轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物是通過前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法獲得的。由此，利用該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，能夠有效地獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。這里所使用的術(shù)語“培養(yǎng)物”指的是，將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞在適于生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所得到的細(xì)胞衍生物，這些細(xì)胞衍生物具有與原始的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞相同的基因組。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的來源不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可以來源于單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，更優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:利 用前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；以及對(duì)該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物。需要說明的是，這里所使用的術(shù)語“培養(yǎng)”應(yīng)作廣義理解，其涵蓋了從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞獲得植物個(gè)體過程中所經(jīng)歷的各種為細(xì)胞/細(xì)胞集合體提供能量的操作。需要說明的是，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的條件不受特別限制，任何能夠?qū)崿F(xiàn)“培養(yǎng)”的各種操作條件均可。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，后代植株分蘗數(shù)目明顯提高，植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物的方法中，該轉(zhuǎn)基因植物可以為單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，更優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物或其后代。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，轉(zhuǎn)基因植物或其后代是通過前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物的方法獲得的。相對(duì)于野生型，該轉(zhuǎn)基因植物或其后代，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，植物產(chǎn)量顯著提高。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以為單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，更優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了另一種制備轉(zhuǎn)基因植物方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:1)將權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或利用權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織培育轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述植物為單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，特別優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。利用該方法能夠有效地獲得相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)、后代植株分蘗數(shù)目明顯提高、植物產(chǎn)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)植物分蘗的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法為:根據(jù)前面所述的任意一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物，使所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)水稻BG1s040基因。由此，能夠有效地使得轉(zhuǎn)基因植物或其后代，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，植物產(chǎn)量顯著提高。其中，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述植物為水稻。由此，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻，相對(duì)于野生型，持續(xù)分蘗能力顯著增強(qiáng)，產(chǎn)量明顯提高。
·
需要說明的是，本發(fā)明的BG1s040基因、構(gòu)建體及其應(yīng)用，是本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動(dòng)和優(yōu)化的工作才發(fā)現(xiàn)以及完成的。下面參考具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1構(gòu)建體制備一、BG1s040基因的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+BG1s040重組載體的構(gòu)建1.PCR 擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄號(hào):DP320_02)提取普通野生稻元江(Oryza.rifupongon Yuanjiang)(其由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供)的基因組DNA(gDNA)。根據(jù)BG1s040基因的堿基序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物:上游引物Fl (SEQ ID NO:1)包含限制性酶切位點(diǎn)Spel，下游引物Rl(SEQ ID NO:2)包含限制性酶切位點(diǎn)BamHI。以上述提取的元江gDNA為模板，利用上游引物F1、下游引物Rl和高保真Ex TaqTM (TaKaRa，DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系如表I所示。表1:BG1s040基因的PCR擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種分離的寡核苷酸，其特征在于，具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列。
任選地，所述分離的寡核苷酸具有與SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列， 任選地，所述分離的寡核苷酸為選自下列變體的任意一種 1)在高等嚴(yán)緊條件下能夠與SEQID NO :7所示的核苷酸序列雜交的寡核苷酸， 2)對(duì)SEQID NO :7所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾而獲得的寡核苷酸，和 3)與SEQID NO 7所不的核苷酸序列具有至少90%的序列同一'丨生的寡核苷酸。
2.—種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求I所述的分離的寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體呈選自質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒以及病毒的至少一種的形式， 任選地，所述構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。
4.一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞含有權(quán)利要求I所述的分離的寡核苷酸或權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建體， 任選地，所述重組細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞，優(yōu)選為農(nóng)桿菌細(xì)胞。
5.一種制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括 使用權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物細(xì)胞；以及 分離轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞， 任選地，所述受體植物細(xì)胞來源于單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，更優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴， 任選地，所述轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法進(jìn)行的， 任選地，所述受體植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞均呈細(xì)胞、組織或器官的形式，優(yōu)選呈組織的形式，更優(yōu)選呈愈傷組織的形式。
6.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其培養(yǎng)物，其是通過權(quán)利要求5所述的方法獲得的， 任選地，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞來源于單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，更優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。
7.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，包括 利用權(quán)利要求5所述的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；以及 對(duì)所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物， 任選地，所述轉(zhuǎn)基因植物為單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，更優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。
8.一種制備轉(zhuǎn)基因植物方法，其特征在于，包括 1)將權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或利用權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞感染植物愈傷組織； 2)利用所述愈傷組織培育轉(zhuǎn)基因植物， 其中，所述植物為單子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱和玉米，特別優(yōu)選水稻，進(jìn)一步優(yōu)選日本晴。
9.一種促進(jìn)植物分蘗的方法，其特征在于， 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物，使所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)水稻BGIos040 基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了分離的寡核苷酸、構(gòu)建體及其應(yīng)用。其中，該分離的寡核苷酸具有SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。將該分離的寡核苷酸引入植物細(xì)胞中，能夠顯著提高植物細(xì)胞中BGIos040基因的表達(dá)，進(jìn)而能夠顯著增強(qiáng)植物的持續(xù)分蘗能力，提高其后代植株分蘗數(shù)目，從而能夠有效提高植物產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103255149SQ20131016337
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者張耕耘, 全志武, 鄒洪鋒, 倪雪梅 申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司