編碼gpc-3嵌合抗原受體蛋白的核酸及表達gpc-3嵌合抗原受體蛋白的t淋巴細胞的制作方法
【專利摘要】編碼表達于人T淋巴細胞表面的嵌合抗原受體蛋白的核酸，所述嵌合抗原受體蛋白包含順序連接的胞外結合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)，其中所述胞外結合區(qū)包含特異性識別GPC3的C末端表位的單鏈抗體scFv(GPC3)。
【專利說明】編碼GPC-3嵌合抗原受體蛋白的核酸及表達GPC-3嵌合抗 原受體蛋白的T淋巴細胞

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤細胞治療領域，更具體地，涉及對特異性表達GPC3的上皮來源的 腫瘤的轉基因 T淋巴細胞治療領域。

【背景技術】
[0002] 磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3, GPC3,又稱 DGSX，GTR2-2, MXR7, 0CI-5， SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一種細胞表面蛋白，屬于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基 因編碼產生70-kDa左右的前體核心蛋白，該前體蛋白能夠被弗林蛋白酶（furin)剪切產生 40-kDa左右的可溶性的能夠進入血液的氨基端（N末端）肽和30-kDa左右含有2個硫酸 乙酰肝素（HS)糖鏈的膜結合的羧基端（C末端）肽。GPC3蛋白通過糖基磷脂酰肌醇（GPI) 錨依附在細胞膜上。
[0003] GPC3高度表達于胎兒肝臟，而不表達于正常成年人的肝組織，但在肝細胞肝癌中 恢復表達，與肝癌的發(fā)生發(fā)展有十分密切的關系，不僅在肝癌發(fā)生的早期檢出率較高，而且 隨著肝癌的發(fā)展，其檢出率也隨之增高。而GPC3的表達在肝腺癌，膽管細胞癌，肝轉移癌和 12種常見實體瘤和21種非肝癌細胞系中均未檢測出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢 透明細胞癌、卵黃囊瘤、神經母細胞瘤等腫瘤中表達。考慮到GPC3在肝細胞肝癌，黑色素瘤 等腫瘤中特異性的高表達，其被認為是腫瘤免疫治療的一個候選靶標。
[0004] 利用抗GPC3抗體進行肝癌檢測和利用抗GPC3抗體的抗體依賴的（ADCC)或補體 依賴的（CDC)細胞毒性研究方案已有報道。一般用于治療的抗體識別的是GPC3蛋白的C 末端。然而，抗體治療存在著抗體在體內血液循環(huán)中半哀期的限制，一般來說，半哀期大多 在23天以內。因此，持續(xù)給藥和/或增大給藥劑量是腫瘤抗體治療所要求的，這導致患者 治療成本的增加，以及某些情況下，甚至不得已終結治療。另外，治療性抗體作為異源蛋白， 還有可能在體內產生過敏反應及針對該治療性抗體的中和性抗抗體的風險。
[0005] T淋巴細胞在腫瘤免疫應答中的作用日益受到重視?；赥淋巴細胞的過繼性 免疫治療在部分腫瘤中取得了一定的效果，并且該種免疫治療方法可以克服抗體治療的 上述缺陷，但在大多數腫瘤的療效仍不能令人滿意[Grupp SA，et al. Adoptive cellular therapy.Curr Top Microbiol Immunol.，.2011;344:149-72·]。近年來，根據 CTL 對革巴 細胞的識別特異性依賴于T淋巴細胞受體（T Cell Rec印tor，TCR)的發(fā)現，將針對腫瘤細 胞相關抗原的抗體的scFv與T淋巴細胞受體的CD3 ζ或Fc ε RI γ等胞內信號激活基序融 合成嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor, CAR),并將其通過如慢病毒感染等方式 基因修飾在T淋巴細胞表面。這種CAR T淋巴細胞能夠以主要組織相容性復合物（Major Histocompatibility Complex, MHC)非限制性方式選擇性地將T淋巴細胞定向到腫瘤細 胞并特異性地殺傷腫瘤。CAR T淋巴細胞是腫瘤免疫治療領域的一個新的免疫治療策略 [Schmitz M,et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol,2010, doi ：10. 1155/2010/956304.]〇
[0006] 嵌合抗原受體包括胞外結合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)。通常胞外區(qū)包含能夠識別 腫瘤相關抗原的scFv，跨膜區(qū)采用CD8，CD28等分子的跨膜區(qū)，胞內信號區(qū)采用免疫受體酪 氨酸活化基序（ITAM)⑶3 ζ或Fc ε RI γ及共刺激信號分子⑶28、⑶137、⑶134等的胞內信 號區(qū)。
[0007] 胞內信號區(qū)僅包含ΙΤΑΜ的為第一代CAR Τ淋巴細胞，其中嵌合抗原受體各部分 按如下形式連接：scFv-TM-ITAM。該種CAR T可以激發(fā)抗腫瘤的細胞毒性效應，但是細 胞因子分泌比較少，并且在體內不能激發(fā)持久的抗腫瘤效應[Zhang T.et al. Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res2007,67 (22)： 11029-11036.]。
[0008] 隨后發(fā)展的第二代CAR T淋巴細胞加入了⑶28或⑶137(又名4-1BB)的胞內 信號區(qū)，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：scFv-TM-⑶28-ITAM或scFv-TM-/ ⑶137-ITAM。胞內信號區(qū)發(fā)生的B7/⑶28或4-1BBL/⑶137共刺激作用引起T淋巴細胞的持 續(xù)增殖，并能夠提高T淋巴細胞分泌IL-2和IFN- γ等細胞因子的水平，同時提高CAR T在 體內的存活周期和抗腫瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011,121 (5) ： 1822-1826. ]〇
[0009] 近些年發(fā)展的第三代CAR T淋巴細胞，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連 接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 或 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，進一步提高了 CAR T 在體 內的存活周期和其抗腫瘤效果[Carpenito C·，et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains. PNAS，2009,106(9) :3360-3365.]。
[0010] 盡管CAR T淋巴細胞在腫瘤免疫治療中具有誘人的前景，但一些潛在的風險亦需 要考慮。比如，由于某些/種正常組織低表達CAR所能識別的特異性抗原可能造成CAR T 淋巴細胞對表達相應抗原的正常組織的損傷。如，針對腎細胞癌患者腫瘤細胞上表達的抗 原碳酸酐酶IX (CAIX)是第一個用于臨床的CAR T淋巴細胞過繼治療的案例，也是第一個 報道含CAR細胞的脫靶效應的案例。病人在多次輸入CAR T淋巴細胞后出現2-4級肝毒 性。分析原因為肝膽管上皮細胞低表達CAIX，原臨床試驗被迫中斷同時排除了病人治療效 果的任何評價[Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX ：first clinical experience. J clin oncol，2006,24 (13) ：e20-e22. ；Ngo MC.，et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics，2011，Rl-R7]。另外，CAR中過多的共刺激信號會降低效應細胞激 活所需的閾值，使得基因修飾的T淋巴細胞在低水平抗原或沒有抗原觸發(fā)的條件下也可 能會被活化，導致大量細胞因子的釋放以致可能引發(fā)所謂的"細胞因子風暴"。這種信號 外漏（singnal leakage)會導致脫祀細胞毒性，從而產生非特異性的組織損傷。例如，在 采用針對Her2的第三代CAR臨床治療一個具有肝和肺轉移的晚期結腸癌患者的過程中 由于正常肺組織中低表達Her2而引發(fā)所謂的"細胞因子風暴"致病人猝死[Morgan RA.， et al. Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy，2010,18(4) :843-851.]。
[0011] 因此，本領域存在著對克服上述缺陷的編碼GPC3嵌合抗原受體蛋白的淋巴細胞 腫瘤治療方案的強烈需求。


【發(fā)明內容】

[0012] 本發(fā)明的第一方面涉及編碼一種表達于T淋巴細胞表面的GPC3嵌合抗原受體蛋 白的核酸，其表達的嵌合抗原受體蛋白使得表達該受體的T淋巴細胞針對高表達GPC3的腫 瘤細胞具有高度特異性的細胞毒性作用。所述GPC3嵌合抗原受體蛋白包含順序連接的胞 外結合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)，其中所述胞外結合區(qū)包含特異性識別GPC3的C末端表位 的單鏈抗體scFv (GPC3)。上述嵌合抗原受體蛋白的胞外結合區(qū)通過⑶8鉸鏈區(qū)與⑶8或者 CD28的跨膜區(qū)相連接，跨膜區(qū)后緊接胞內信號區(qū)。
[0013] 本發(fā)明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發(fā)明 的編碼嵌合抗原受體蛋白氨基酸序列的核酸密碼子可以是簡并的，即編碼同一氨基酸序 列的多種簡并核酸序列都包含在本發(fā)明的范圍之中。編碼對應氨基酸的簡并核酸密碼子是 本領域公知的。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變 異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異 體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸 的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
[0014] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%，最佳地至少90 %或至少95 %相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及 在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指： (1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如〇. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C ;或（2)雜 交時加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或⑶僅 在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交 的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO :22-25之一所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活 性。
[0015] 特異性識別人GPC3的C末端表位的單克隆抗體已被公開在例如，中國專利文獻 CN101186650A 中外制藥株式會社），此外據文獻 Advances in Liver Cancer Antibody Therapies ：A Focus on Glypican_3and Mesothelin, BioDrugs. 2011 Octoberl ；25 (5)： 275-284其他已知特異性識別C末端表位的單克隆抗體包括GC33和hGC33也分別被報道， 其針對GPC3的抗原決定簇位于C端524-563位氨基酸殘基，同時被報道的還包括GPC3-C02 和1G12等單克隆抗體。這些被公開的單克隆抗體可以用于制備本發(fā)明的核酸所編碼的嵌 合抗原受體蛋白中的單鏈抗體部分。其他識別GPC3的C末端表位的單克隆抗體也可以合 適的方式運用于本發(fā)明。
[0016] 單鏈抗體scFv (GPC3)可以根據上述公開的GPC3單克隆抗體的序列通過基因工程 方法或化學合成方法制備。本發(fā)明中使用的術語"單鏈抗體（scFv)片段"指的是通過如下 定義的抗體片段，其是包含通過接頭（linker)連接的重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VL) 的重組蛋白，接頭使得這兩個結構域相關聯，以最終形成抗原結合位點。scFv的大小一般是 一個完整抗體的1/6。單鏈抗體優(yōu)選是由一條核苷酸鏈編碼的一條氨基酸鏈序列。本發(fā)明 使用的單鏈抗體可單獨或聯合使用本領域已知的常規(guī)技術，例如氨基酸缺失、插入、取代、 增加、和/或重組以及/或其他修飾方法作進一步修飾。根據一種抗體的氨基酸序列在其 DNA序列中引入這種修飾的方法對本領域技術人員來說是眾所周知的；見例如，Sambrook， 分子克?。簩嶒炇謨裕珻old Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修飾優(yōu)選在核 酸水平上進行。上述單鏈抗體還可以包括其衍生物。本發(fā)明中"抗體的衍生物"包括例如 當通過噬菌體展示技術獲得所述抗體的衍生物時，可使用如BIAcore系統(tǒng)中使用的表面等 離子共振技術來增加與GPC3抗原表位結合的噬菌體抗體的效率（Schier，人抗體雜交瘤 7 (1996)，97-105 ;Malmborg，免疫學方法雜志 183 (1995)，7-13)。還包括，例如 W089/09622 中描述的嵌合抗體的產生的方法，EP-A10239400和W090/07861中描述的人源化抗體產生 的方法，W091/10741，W094/02602和W096/33735中有描述的產生異種抗體例如小鼠中的人 抗體的方法所產生的抗體的衍生物。
[0017] 本發(fā)明的術語"特異性識別"的意思是本發(fā)明的雙特異性抗體不與或基本上不與 目標抗原以外的任意多肽交叉反應。其特異性的程度可以通過免疫學技術來判斷，包括但 不限于免疫印跡，免疫親和層析，流式細胞分析等。在本發(fā)明中，特異性識別優(yōu)選通過流式 細胞技術來確定，而具體情況下特異性識別的標準可由本領域一般技術人員根據其掌握的 本領域常識來判斷。
[0018] 嵌合抗原受體的跨膜區(qū)可以選自⑶8或⑶28等蛋白的跨膜區(qū)。⑶8或⑶28是T 淋巴細胞表面的天然標記物。人⑶8蛋白是個異二聚體，由α β或者Υ δ兩條鏈組成。 在本發(fā)明的一個實施方案中，跨膜區(qū)選自CD8a或者CD28的跨膜區(qū)。此外，CD8a鉸鏈區(qū) (hinge)是一個柔性區(qū)域，因此，CD8或CD28和跨膜區(qū)加上鉸鏈區(qū)被用于將嵌合抗原受體 CAR的靶點識別結構域scFv和胞內信號區(qū)連接起來。
[0019] 胞內信號區(qū)可以選自⑶3 ζ，Fc ε RIY，⑶28,⑶137,⑶134蛋白的胞內信號區(qū)，及 其組合。⑶3分子由五個亞單位組成，其中⑶3 ζ亞單位（又稱⑶3zeta，簡稱Z)含有3個 ITAM基序，該基序是TCR-⑶3復合體中重要的信號轉導區(qū)。⑶3 δ Z是截短的不具有ITAM 基序的CD3(序列，在本發(fā)明實踐中一般作為陰性對照的構建。Fee RIY主要分布在肥大 細胞和嗜堿性粒細胞表面，其含有一個ITAM基序，在結構、分布及功能上與CD3(類似。此 外如前所述，CD28, CD137, CD134是共刺激信號分子，在與各自配體結合后其胞內信號區(qū)段 產生的共刺激作用引起T淋巴細胞的持續(xù)增殖，并能夠提高T淋巴細胞分泌IL-2和IFN- γ 等細胞因子的水平，同時提高CAR T淋巴細胞在體內的存活周期和抗腫瘤效果。
[0020] 本發(fā)明的核酸所編碼的GPC3嵌合抗原受體蛋白可以選自按如下方式順序連接的 嵌合抗原受體蛋白：
[0021] scFv(GPC3)-CD8-CD3 ζ，
[0022] scFv (GPC3)-CD8-CD137-CD3 ζ，
[0023] scFv(GPC3)-CD28a-CD28b_CD3 ζ，
[0024] scFv (GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3 ζ，
[0025] 及其組合，其中相關嵌合抗原受體蛋白中⑶28a代表⑶28分子的跨膜區(qū)，⑶28b代 表CD28分子的胞內信號區(qū)。上述各種抗GPC3嵌合抗原受體統(tǒng)稱為scFv (GPC3) -CAR。
[0026] 在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的核酸具有如SEQ ID NO :18?21所述的序 列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸是編碼具有如SEQ ID NO :22-25之一的 嵌合抗原受體蛋白的核酸。
[0027] 本發(fā)明的第二方面包括包含上述編碼表達于T淋巴細胞表面的嵌合抗原受體 蛋白的核酸的載體。在一個具體實施方案中，本發(fā)明使用的載體是一種慢病毒質粒載體 pPWT-eGFP。該質粒屬于第三代自滅活慢病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)共有三個質粒即編碼蛋 白Gag/Po 1、編碼Rev蛋白的包裝質粒psPAX2 ;編碼VSV-G蛋白的包膜質粒PMD2. G ;及 空載體pPWT-eGFP，其可以用于重組引入目的核酸序列，即編碼CAR的核酸序列?？蛰d體 pPWT-eGFP(其本身為后續(xù)試驗中的mock)中由延長因子-la (elongation factor-la, EF-1 a)啟動子調控增強型綠色突光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP) 的表達。而包含編碼CAR的目的核酸序列的重組表達載體pWPT-eGFP-F2A-CAR是通過由 來自口蹄疫病毒（food-and-mouth disease virus，FMDV)的核糖體跳躍序列（ribosomal skipping sequence2A)(簡稱F2A)實現eGFP與CAR的共表達的。在一個具體實施方案中， 本發(fā)明的載體具有如SEQ ID NO :27-30之一的核酸序列。
[0028] 本發(fā)明的第三方面包括包含上述載體的病毒。本發(fā)明的病毒包括包裝后的具有感 染力的病毒，也包括包含包裝為具有感染力的病毒所必需成分的待包裝的病毒。本領域內 已知的其他轉導T淋巴細胞的病毒及其對應的質粒載體也可用于本發(fā)明。
[0029] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重組載體 (即含有scFv(GPC3)-CAR)的慢病毒。
[0030] 本發(fā)明的第四方面包括一種轉基因 T淋巴細胞，其被轉導有本發(fā)明的核酸或被轉 導有本發(fā)明的上述包含所述含有該核酸的重組質粒，或包含該質粒的病毒。本領域常規(guī) 的核酸轉導方法，包括非病毒和病毒的轉導方法都可以用于本發(fā)明?；诜遣《镜霓D導 方法包括電穿孔法和轉座子法。近期Amaxa公司研發(fā)的nucleofector核轉染儀能夠直 接將外源基因導入細胞核獲得目的基因的高效轉導。另外，基于睡美人轉座子（Slewing Beauty system)或PiggyBac轉座子等轉座子系統(tǒng)的轉導效率較普通電穿孔有較大提 高，將nucleofector轉染儀與睡美人轉座子系統(tǒng)聯合應用已有報道[Davies JK.，et al.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010,70(10) :0F1-10.]，該方法既具有較高的轉導效率又能夠實現目的基因的定點整合。 在本發(fā)明的一個實施方案中，實現嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的轉導方法是基 于病毒如逆轉錄病毒或慢病毒的轉導方法。該方法具有轉導效率高，外源基因能夠穩(wěn)定表 達，且可以縮短體外培養(yǎng)T淋巴細胞到達臨床級數量的時間等優(yōu)點。在該轉基因 T淋巴細 胞表面，轉導的核酸通過轉錄、翻譯表達在其表面。通過對各種不同的培養(yǎng)的腫瘤細胞進行 體外細胞毒實驗證明，本發(fā)明的表面表達嵌合抗原受體的轉基因 T淋巴細胞具有高度特異 性的腫瘤細胞殺傷效果（亦稱細胞毒性）。因此本發(fā)明的編碼嵌合抗原受體蛋白的核酸，包 含該核酸的質粒，包含該質粒的病毒和轉導有上述核酸，質粒或病毒的轉基因 T淋巴細胞 可以有效地用于腫瘤的免疫治療。
[0031] 在一個實施方案中，本發(fā)明的T淋巴細胞，其表面表達一種嵌合抗原受體，所述嵌 合抗原受體由SEQ ID NO :18-21之一的核酸編碼表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉 基因 T淋巴細胞表面表達一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列選自SEQ ID NO :22-25 之一。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1顯示的是作為示例的本發(fā)明的包含編碼CAR序列的慢病毒載體 pWPT-eGFP-F2A-CAR的結構示意圖。
[0033] 圖2顯示的是作為示例的包含在慢病毒載體中的本發(fā)明的CAR的不同區(qū)之間連接 關系的示意圖，其中由核糖體跳躍序列F2A連接的eGFP和svFv(GPC3)特異性嵌合抗原受 體。
[0034] 圖3顯示的是Mlul和Sail雙酶切鑒定實施例1的慢病毒質粒的核酸電泳圖。其 中Ml是DS2000分子量標記物（廣州東盛生物科技有限公司）；M2是Hind III標記物（廣 州東盛生物科技有限公司）。泳道1-5分別是
[0035] 1 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-δ Ζ ；
[0036] 2 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-Z ；
[0037] 3 ：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ ；
[0038] 4：pffPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z ；
[0039] 5 :pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ。
[0040] 圖4顯示的是本發(fā)明實施例2的病毒感染CTL(細胞毒性T淋巴細胞）后細胞表 達的eGFP的流式細胞技術檢測結果。
[0041] 圖5顯示的是本發(fā)明實施例2的表達不同嵌合抗原受體（CAR+)的CTL細胞的體 外生長情況。圖中顯示在病毒感染后第9天，表達不同嵌合抗原受體的CTL細胞體外擴增 20?40倍。

【具體實施方式】
[0042] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不能理解為用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中如未注明具體條件的實驗方法， 則按照常規(guī)條件如Sambrook等，"分子克?。簩嶒炇謨裕∟ew York :Cold Spring Harbor laboratory Press，1989) "中所述的條件，而在實施例中明確說明有試劑公司說明書時，貝lj 按照說明書所建議的條件進行。
[0043] 實施例1.表達本發(fā)明核酸編碼的嵌合抗原受體蛋白的慢病毒質粒的構建及病毒 包裝
[0044] 下表1解釋了本發(fā)明示例的嵌合抗原受體各部分的連接順序，該連接還可參見圖 2中所示。表1
[0045]

【權利要求】
1. 編碼表達于人T淋巴細胞表面的抗GPC3嵌合抗原受體蛋白的核酸，所述抗GPC3嵌 合抗原受體蛋白包含順序連接的胞外結合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)，其中所述胞外結合區(qū) 包含特異性識別GPC3的C末端表位的單鏈抗體scFv(GPC3)。
2. 權利要求1所述的核酸，其中跨膜區(qū)選自包含CD8或CD28的跨膜區(qū)和鉸鏈區(qū)的序 列。
3. 權利要求1或2的核酸，其中胞內信號區(qū)選自⑶3 ζ，Fc ε RI Y，⑶28,⑶137,⑶134 的胞內信號區(qū)序列，及其組合。
4. 權利要求3的核酸，其中所述嵌合抗原受體蛋白是選自包含順序連接的胞外結合 區(qū)，跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)的如下順序連接的嵌合抗原受體蛋白： scFv(GPC3)-CD8-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3 ζ， scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3 ζ， 及其組合，其中相關嵌合抗原受體蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜區(qū)，CD28b代表 CD28分子的胞內信號區(qū)。
5. 權利要求1的核酸，選自編碼具有SEQ ID NO :22?25之一序列的嵌合抗原受體蛋 白的核酸。
6. 權利要求1的核酸，具有SEQ ID NO :18-21之一的序列。
7. 包含權利要求1-6之一所述的核酸的載體。
8. 權利要求7所述的載體，該載體來自慢病毒質粒pWPT-eGFP，并具有如SEQ ID NO : 27-30之一的核酸序列。
9. 包含權利要求7或8所述載體的病毒。
10. -種基因修飾的T淋巴細胞，其被轉導有權利要求1-6之一的核酸或權利要求7或 8所述的載體或權利要求9所述的病毒。
11. 一種轉基因 T淋巴細胞，其表面表達一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體由SEQ ID NO :18-21之一的核酸編碼表達。
12. -種基因修飾的T淋巴細胞，其表面表達一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體的 氨基酸序列選自SEQ ID NO :22-25之一。
【文檔編號】C12N15/867GK104140974SQ201310164725
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月8日 優(yōu)先權日:2013年5月8日
【發(fā)明者】李宗海, 高慧萍, 蔣華, 石必枝, 王華茂, 李克桑, 王紅陽, 楊勝利, 顧健人 申請人:上海益杰生物技術有限公司