專利名稱：一種副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備，屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌病又稱豬格拉瑟氏病，纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，為革蘭氏陰性小桿菌，呈散發(fā)性的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；曫B(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用和飼養(yǎng)高度密集，以及突發(fā)新的呼吸道綜合癥等因素存在，使得該病日趨流行，危害日漸嚴(yán)重。近兩年來，我國副嗜血桿菌在養(yǎng)豬場引起豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道屢見不鮮，特別是規(guī)?；i場在受到藍(lán)耳病、圓環(huán)病等感染之后免疫功能下降時(shí)，副豬嗜血桿菌病伺機(jī)暴發(fā)，導(dǎo)致較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前副豬嗜血桿菌的大規(guī)模培養(yǎng)存在諸多亟待改善之處，比如營養(yǎng)需求高、培養(yǎng)困難、培養(yǎng)基成本高等。副豬嗜血桿菌生活力不強(qiáng)，生長依賴外源NAD，在培養(yǎng)過程中生長緩慢；用特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的同時(shí)，一旦污染雜菌很快雜菌即成為優(yōu)勢菌種，副豬嗜血桿菌培養(yǎng)即告失??；目前所用于培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基,成本高,生長活菌數(shù)不穩(wěn)定，甚至有時(shí)由于培養(yǎng)液活菌數(shù)過低而倒罐，無法用于疫苗的常規(guī)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有培養(yǎng)基成本較高、效果不好的缺陷，篩選出一種高性能的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基既能保證副豬嗜血桿菌生長旺盛，還能提高生長速度，縮短培養(yǎng)時(shí)間，可用于副豬嗜血桿菌 疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明制備的培養(yǎng)基是一種成本低廉，活菌數(shù)較高，生產(chǎn)周期較短的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，活菌數(shù)可達(dá)25 30億，生產(chǎn)周期為8 10h。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分及配比為，按重量/體積計(jì):酵母粉10 30g/L，大豆胨 riOg/L,麥芽糖 riOg/L, NaCl 2 10g/L，K2HPO4I 10g/L ;按體積比計(jì)
0.0019Π).010NAD (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和2°/Γ Ο%牛血清，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0 7.4。作為優(yōu)選方案，本發(fā)明的培養(yǎng)基的組分及配比為:按重量/體積計(jì):酵母粉15 20g/L，大豆胨4 8g/L，麥芽糖4 8g/L，NaCl 5 8g/L，K2HP042 8g/L ；按體積比計(jì)
0.0029Π).008NAD和4°/Γ8%牛血清，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的ρΗ7.0-7.4。作為優(yōu)選方案，本發(fā)明的培養(yǎng)基的組分及配比為:按重量/體積計(jì):酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，麥芽糖5g/L，NaCl 5g/L，K2HP045g/L ;按體積比計(jì)0.005NAD和5%牛血清，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的PH7.0-7.4。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基通過下列方法制備:A.取酵母粉l(T30g/L，大豆胨I 10g/L，NaCl2 10g/L，K2HPO4I 10g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
B.取fIOg麥芽糖，加蒸餾水定容至1000ml，配制成麥芽糖溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
C.按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液f10%，過濾除菌的牛血清2°/Γ Ο%，NAD0.0019Γ0.01%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的特點(diǎn)是:本發(fā)明的培養(yǎng)基以酵母粉作為主要的氮源，還可提供各種微生物所需的維生素、生長素等營養(yǎng)，降低了成本，更有利于被副豬嗜血桿菌吸收和利用。本發(fā)明以麥芽糖為主要的碳源，水解速度較慢，在培養(yǎng)一段時(shí)間內(nèi)可提供穩(wěn)定的代謝碳源，同時(shí)還可以維持培養(yǎng)基的滲透壓平衡。因此，該培養(yǎng)基比商業(yè)培養(yǎng)基TSB更適于副豬嗜血桿菌的生長，可更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。


圖1:副豬嗜血桿菌在商業(yè)培養(yǎng)基TSB中的生長曲線(對(duì)照)。圖2:副豬嗜血桿菌在本發(fā)明的最佳實(shí)施例制備的培養(yǎng)基中的生長曲線。注:商業(yè)TSB成分組成:胰酪蛋白胨17g/L ;大豆胨3g/L ； NaCl 5g/L;K2HP042.5g/L ;葡萄糖2.5g/L。
具體實(shí)施方式
:
實(shí)施例1:
培養(yǎng)基的制備:
(O取酵母粉10g/L，大豆胨lg/L，NaCl 2g/L，K2HP04lg/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(2)取fIOg麥芽糖，加蒸餾水定容至1000ml，配制成麥芽糖溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(3)按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液1%，過濾除菌的牛血清2%，NAD0.001%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例2:優(yōu)化培養(yǎng)基的制備
(O取酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，NaCl 5g/L，K2HP045g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(2)取flOg麥芽糖，加蒸懼水定容至1000ml,配制成麥芽糖 溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(3)按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液5%，過濾除菌的牛血清5%，NAD0.005%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例3:優(yōu)化培養(yǎng)基的制備
(1)取酵母粉30g/L，大豆胨10g/L，NaCl10g/L, K2HPO4 10g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(2)取fIOg麥芽糖，加蒸餾水定容至1000ml，配制成麥芽糖溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；(3)按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液10%，過濾除菌的牛血清10%，NAD0.01%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施方案4:優(yōu)化培養(yǎng)基的制備
(O取酵母粉15g/L，大豆胨4g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4 2g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(2)取fIOg麥芽糖，加蒸餾水定容至IOOOml，配制成麥芽糖溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(3)按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液4%，過濾除菌的牛血清4%，NAD0.002%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例5:優(yōu)化培養(yǎng)基的制備
(1)取酵母粉20g/L，大豆胨8g/L，NaCl8 g/L，K2HPO4 8g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(2)取fIOg麥芽糖，加蒸餾水定容至1000ml，配制成麥芽糖溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(3)按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液8%，過濾除菌的牛血清8%，NAD0.008%,余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例6:優(yōu)化培養(yǎng)基的制備
(1)取酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，NaCl5 g/L，K2HPO4 5g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(2)取fIOg麥芽糖，加蒸餾水定容至1000ml，配制成麥芽糖溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(3)按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液5%，過濾除菌的牛血清5%，NAD0.005%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例7:優(yōu)化培養(yǎng)基的制備
(1)取酵母粉18g/L，大豆胨7g/L，NaCl7 g/L，K2HPO4 2.5g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(2)取flOg麥芽糖，加蒸懼水定容至1000ml,配制成麥芽糖 溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ；
(3)按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液7%，過濾除菌的牛血清6%，NAD0.006%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。表1:副豬嗜血桿菌5L發(fā)酵罐試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基組分及配比，按照重量/體積計(jì)，酵母粉l(T30g/L，大豆胨I 10g/L，麥芽糖I 10g/L，NaCl 2 10g/L，K2HPO4riOg/L ;按體積比計(jì)0.0019Γ0.0lONAD和2°/Γ Ο%牛血清，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的ρΗ7.0-7.4。
2.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基的組分及配比為:按重量/體積計(jì):酵母粉15 20g/L，大豆胨4 8g/L，麥芽糖4 8g/L，NaCl 5 8g/L，K2HPO4 2 8g/L ;按體積比計(jì)0.0029Γ0.008NAD和4°/Γ8%牛血清，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的ρΗ7.0-7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基的組分及配比為:按重量/體積計(jì):酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，麥芽糖5g/L，NaCl 5g/L，K2HP045g/L ;按體積比計(jì)0.005NAD和5%牛血清，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0-7.4。
4.一種副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，其特征包括下列步驟: A.取酵母粉l(T30g/L，大豆胨I 10g/L，NaCl2 10g/L，K2HPO4 I 10g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ； B.取fIOg麥芽糖，加蒸餾水定容至1000ml，配制成麥芽糖溶液，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌2(T30min ； C.按體積比計(jì)，取步驟B的麥芽糖溶液f10%，過濾除菌的牛血清29TlO%，NAD0.001°Γθ.01%，余量為滅過菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述`的培養(yǎng)基在副豬嗜血桿菌的高密度發(fā)酵中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法。該培養(yǎng)基包括以下組分按照重量/體積計(jì)，酵母粉10~30g/L，大豆胨1~10g/L，麥芽糖1~10g/L，NaCl2~10g/L，K2HPO41~10g/L；按體積比計(jì)0.001%~0.010NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和2%~10%牛血清，余量是水，pH7.0-7.4。本發(fā)明有利于副豬嗜血桿菌的高密度發(fā)酵，在短時(shí)間內(nèi)獲得較大菌量，成本低廉，可用于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/21GK103232962SQ20131016718
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者單虎, 段笑笑, 韓先杰, 張傳美, 秦志華, 蔡秀磊 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)