專利名稱：一種能快速分解棉稈的復合菌劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能快速分解棉桿的復合菌劑及其制備方法。
背景技術：
棉花收獲后會殘留大量副產(chǎn)物一棉桿。棉桿的主要成分是天然木質(zhì)纖維素(由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組成)，是具有開發(fā)潛力的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源，通過生物分解轉(zhuǎn)化，可開發(fā)生物燃料(如乙醇、氫氣和沼氣等)、動物飼料、有機肥和用作食用菌栽培料

在農(nóng)作物秸桿中，棉桿比水稻秸桿、小麥秸桿和玉米秸桿等質(zhì)地更加堅硬，更難分解。目前，由于缺乏對棉桿具有高效分解能力的微生物(或酶)，其生物轉(zhuǎn)化(包括能源化、飼料化等)效率很低，棉桿的生物利用多局限于直接還田利用。然而，棉桿直接還田也存在問題，即因棉桿本身極難分解，自然腐熟度低，很難當年成肥，還田后不僅對土壤培肥效果不明顯，還因攜帶病蟲害而影響來年作物種植。大部分未被利用的棉桿，農(nóng)民只能采用直接露天焚燒的方法處理，其釋放的煙塵嚴重影響環(huán)境和公共交通。因此，亟待開發(fā)棉桿的轉(zhuǎn)化利用途徑。棉桿極難分解是其生物轉(zhuǎn)化高附加值產(chǎn)品的瓶頸，其關鍵環(huán)節(jié)就是獲得能高效分解棉桿木質(zhì)纖維素的微生物?，F(xiàn)在多利用單一菌種分解，單一菌種分解能力弱，適應性不強，難以培養(yǎng)，發(fā)酵周期較長，容易被雜菌污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述技術現(xiàn)狀，旨在提供一種發(fā)酵分解時間短、的能快速分解棉桿的復合菌劑及其制備方法。本發(fā)明目的的實現(xiàn)方式為，一種能快速分解棉桿的復合菌劑，由菌株保藏編號為ATCC 27405的熱纖梭菌、菌株保藏編號為ACCC 00424脫硫腸狀菌、菌株保藏編號為CCREMSDMCC120012嗜熱地衣芽孢桿菌、菌株保藏編號為DSM 3071溶纖維丁酸弧菌、菌株保藏編號為ACCC 01179枯草芽孢桿菌和菌株保藏編號為ACCCl 1073嗜熱乳桿菌復合成；熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在復合菌劑中的細胞數(shù)含量分別為10-20%、5-15%、5-35%、5-20%, 25-35%和10-20% ；菌株在復合菌劑中的細胞數(shù)含量的含義是指復合菌中各菌株細胞數(shù)占復合菌總細胞數(shù)的百分含量。一種快速分解棉桿的復合菌劑的制備方法，制備棉桿快速分解復合菌劑的載體為棉桿，制作步驟是:①復合菌發(fā)酵:準備混合菌和培養(yǎng)液，將相當于培養(yǎng)液體積3-5%的混合菌液接種于PCS培養(yǎng)液中，50-60°C保溫靜止培養(yǎng)3-5天；熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱乳桿菌在混合菌種中的細胞數(shù)含量分別為10-20%、5-15%、5-35%、5-20%, 25-35%和10-20% ；②載體制備:將80°C烘干的棉桿粉碎后過0.4 mm篩子備用；③吸附發(fā)酵:在棉桿粉中加入占棉桿重量2-3%的尿素、0.1-0.5%的魚粉、
0.1-0.3%的酵母粉和45-55%的自來水，邊攪拌邊噴灑占棉桿粉1-2%的預發(fā)酵好的復合菌液置于發(fā)酵缸內(nèi)于50-60°C保溫培養(yǎng)，每天攪拌1-2次，每3-4天噴灑I次同樣的菌液，第5次噴灑菌液量為棉桿粉重的10-20%，噴灑后立即60-70°C烘干，當總體水分含量為20-25%時即刻停止干燥，即成制品并包裝。本發(fā)明復合菌劑所選擇的6株菌中任何菌株在同樣條件下單獨培養(yǎng)均沒有明顯分解功能，只有將它們組合在一起才能通過它們之間的協(xié)同功能發(fā)揮整體分解活性。復合菌劑的組成菌株均可通過購買商業(yè)菌株而獲得，對棉桿具有很好的適應能力，特別能對棉桿天然木質(zhì)纖維素中的纖維素和半纖維素實現(xiàn)高效分解。分解6天，棉桿總分解率達34.7%，半纖維素分解64.2%，纖維素分解43.1%，木質(zhì)素損失11.2% ;經(jīng)12天分解，棉桿總分解率達51.7%，半纖維素分解84%，纖維素分解67%，木質(zhì)素損失21%。本復合菌劑可用于對棉桿進行預分解處理后制作食用菌培養(yǎng)料、用于棉桿能源轉(zhuǎn)化和飼料化等用途，也適于棉桿有機肥生產(chǎn)的發(fā)酵工藝中，提高棉桿制作有機肥的質(zhì)量。
具體實施例方式本發(fā)明的復合菌劑由菌株保藏編號為ATCC 27405的熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)、菌株保藏編號為 ACCC 00424 脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum putei)、菌株保藏編號為CCREMSDMCC120012嗜熱地衣芽孢桿菌(Geobacillus thermoleovo)、菌株保藏編號為DSM 3071溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、菌株保藏編號為ACCC 01179枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和菌株保藏編號為ACCC11073嗜熱乳桿菌(Lactobacillus acidoph ilus)復合成。熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱乳桿菌在復合菌劑中的細胞數(shù)含量分別為10-20%、5-15%、5-35%、5-20%、25-35%、10-20%，最佳為 15%、7%、30%、12%、25% 和 11%。本復合菌劑由優(yōu)化組合的6株嗜酸細菌和吸附用棉桿載體構成，組成復合菌劑的菌熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)在厭氧條件下對纖維素具有分解能力，但是在復合菌劑培養(yǎng)的同等條件下卻沒有明顯分解能力?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)純培養(yǎng)時雖然具有半纖維素分解活性，但是在復合菌劑培養(yǎng)的同等條件下對棉桿也沒有分解能力。脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum putei)、嗜熱地衣芽抱桿菌(Geobacillus thermoleovo)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)本身不具備纖維素或者半纖維素分解活性，因此在復合菌劑培養(yǎng)的同等條件下對棉桿也沒有分解能力，這三株菌參與復合菌劑的分解代謝過程，主要作用是為木質(zhì)纖維素分解菌創(chuàng)造厭氧分解環(huán)境，消耗分解抑制物質(zhì)，輔助木質(zhì)纖維素分解菌分解秸桿。因此，6株組成菌中任何菌株在同樣條件下單獨培養(yǎng)均沒有明顯分解功能，只有組合在一起才能通過它們之間的協(xié)同功能發(fā)揮整體分解活性。制備方法是將熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱乳桿菌6株細菌進行混合發(fā)酵，待生長和分解能力旺盛時，進行棉桿快速分解復合菌劑制備，載體為棉桿，加入酵母粉等，噴灑菌液，烘干數(shù)次即得。下面以具體實例詳述本發(fā)明。實例一(I)復合菌發(fā)酵:準備混合菌液和PCS培養(yǎng)液，將相當于培養(yǎng)液體積3%的混合菌液接種于PCS培養(yǎng)液中，50°C保溫靜止培養(yǎng)3天；所述的PCS培養(yǎng)液為改良PCS培養(yǎng)基，其配制方法為:NaCl 5 g，CaCO3 2.5 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 I g, K2HPO4 I g, MgSO4.7H20 0.35 g，干棉桿 1.5 g、蒸懼水 I I, pH
7.0，121°C滅菌 20 min。所述熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在混合菌種中的細胞數(shù)含量分別為10%、5%、35%、5%、35%和10%。(2)棉桿載體制備:將80°C烘干的棉桿粉碎后過0.4 mm篩子備用；(3)吸附發(fā)酵:在棉桿粉中加入占棉桿重量3%的尿素、0.1%的魚粉、0.1%的酵母粉和45%的自來水，邊攪拌邊噴灑占棉桿粉1%的預發(fā)酵好的復合菌液置于發(fā)酵缸內(nèi)50°C保溫培養(yǎng)，每天攪拌1-2次，每3-4天噴灑I次同樣的菌液，第5次噴灑菌液量為棉桿粉重的15%，噴灑后立即60·°C烘干，當總體水分含量為20%時即刻停止干燥，即成制品并包裝。實例二(I)復合菌發(fā)酵:準備混合菌和Mandels培養(yǎng)液，將相當于培養(yǎng)液體積4%的混合菌液接種于Mandels培養(yǎng)液中，60°C保溫，靜止培養(yǎng)5天；所述復合菌中，熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在混合菌種中的細胞數(shù)含量分別為15%、12%、5%、20%、25%、20%。所述Mandels 培養(yǎng)液組成為:蛋白胨 2.5g, (NH4)2SO4 1.4g，MgSO4.7H20 0.3g,KH2PO4 2g, FeSO4.7H20 5mg, MnSO4 1.6mg, ZnCl2 1.7mg, CoCl2 1.7mg, CaCO3 2g，干棉桿 2g，蒸懼水 I L, pH 7.00(2)棉桿載體制備:將80°C烘干的棉桿粉碎后過0.4 mm篩子備用；吸附發(fā)酵:在棉桿粉中加入占棉桿重量2.5%的尿素、0.35%的魚粉、0.2%的酵母粉和50%的自來水，邊攪拌邊噴灑占棉桿粉2%的預發(fā)酵好的復合菌液置于發(fā)酵缸內(nèi)于60°C保溫培養(yǎng)，每天攪拌1-2次，每3-4天噴灑I次同樣的菌液，第5次噴灑菌液量為棉桿粉重的17%，噴灑后立即70°C烘干，當總體水分含量為25%時即刻停止干燥，即成制品并包裝。實例三、同實例一，不同的是，復合菌發(fā)酵:準備混合菌原種和梭菌增殖培養(yǎng)液，將相當于培養(yǎng)液體積4%的菌種原液接種于梭菌增殖培養(yǎng)液中，60°C保溫靜止培養(yǎng)5天；所述梭菌增殖培養(yǎng)基組成為:胰蛋白胨10.0g,酵母提取物3g, NaCl 5.0g,半胱氨酸鹽酸鹽0.5g,醋酸鈉3.0g,碳酸韓3g,干棉桿2.5 g,蒸懼水I L, pH 7.0。吸附發(fā)酵:在棉桿粉中加入占棉桿重量2%尿素、0.5%的魚粉、0.3%的酵母粉和55%的自來水，邊攪拌邊噴灑占棉桿粉2%的預發(fā)酵好的復合菌液置于發(fā)酵缸內(nèi)于60°C保溫培養(yǎng)，每天攪拌1-2次，每3-4天噴灑I次同樣的菌液，第5次噴灑菌液量為小麥秸桿粉重的10%，噴灑后立即70°C烘干，當總體水分含量為25%時即刻停止干燥，即成制品并包裝。實例四、同實例一，不同的是，所述復合菌中，熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在混合菌種中的細胞數(shù)含量分別為15%、7%、30%、12%、25%和11%。將相當于培養(yǎng)液體積3%的混合菌種原液接種于PCS培養(yǎng)液中，保溫55°C靜止培養(yǎng)4天。第5次噴灑菌液量為棉桿粉重的20%，噴灑后立即60°C烘干，當總體水分含量為23%時即刻停止干燥。本發(fā)明以上述實例一的復合菌劑為例說明復合菌劑對棉桿的分解性能。利用該復合菌劑分解棉桿6天后棉桿總分解率達34.7%，半纖維素分解64.2%，纖維素分解43.1%，木質(zhì)素損失11.2% ;經(jīng)12天分解，棉桿總分解率達51.7%，半纖維素分解84%，纖維素分解67%，木質(zhì)素損失21%。本發(fā)明的微生物吸附載體主要為棉桿等木質(zhì)纖維素廢棄物，它們對本復合菌劑具有很高的吸附性能，吸附后經(jīng)冷凍、干燥后均能保持穩(wěn)定、高效的分解功能。本復合菌劑曾用于對棉桿進行預分解處理后制作食用菌培養(yǎng)料，與未經(jīng)本菌劑處理的棉桿相比，經(jīng)本菌劑處理后，食用菌菌絲生長更快，形成子實體的時間更短。該復合菌劑還可用于對棉桿進行適當分解后，用于棉桿能源轉(zhuǎn)化和飼料化等生產(chǎn)，棉桿經(jīng)本復合菌劑適當分解處理后，天然木質(zhì)纖維素結構被打破，有利于棉桿能源轉(zhuǎn)化過程中纖維素酶的水解,也使棉桿飼料質(zhì)地更加柔軟,適口性增強。本復合菌劑也適于棉桿有機肥生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，在棉桿堆肥發(fā)酵過程中添加本復合菌劑后，可使堆體溫度提升更快，棉桿分解更迅速，有機肥腐熟速度加 快，提高棉桿有機肥生產(chǎn)進程和質(zhì)量。
權利要求
1.一種快速分解棉桿的復合菌劑,其特征在于由菌株保藏編號為ATCC 27405的熱纖梭菌、菌株保藏編號為ACCC 00424脫硫腸狀菌、菌株保藏編號為CCREMSDMCC120012嗜熱地衣芽孢桿菌、菌株保藏編號為DSM 3071溶纖維丁酸弧菌、菌株保藏編號為ACCC 01179枯草芽孢桿菌和菌株保藏編號為ACCCl 1073嗜熱乳桿菌復合成； 熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在復合菌劑中的細胞數(shù)含量分別為10-20%、5-15%、5-35%、5-20%、25-35%和10-20% ； 菌株在復合菌劑中的細胞數(shù)含量的含義是指復合菌中各菌株細胞數(shù)占復合菌總細胞數(shù)的百分含量。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種快速分解棉桿的復合菌劑，其特征在于熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在復合菌劑中的細胞數(shù)含量分別為15%、7%、30%、12%、25%和11%。
3.制備權利要求I所述的一種快速分解棉桿的復合菌劑的方法，其特征在于制備棉桿快速分解復合菌劑的載體為棉桿，制作步驟是 ①復合菌發(fā)酵準備混合菌和培養(yǎng)液，將相當于培養(yǎng)液體積3-5%的混合菌液接種于培養(yǎng)液中，50-60°C保溫靜止培養(yǎng)3-5天； 熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱乳桿菌在混合菌種中的細胞數(shù)含量分別為10-20%、5-15%、5-35%、5-20%、25-35%和10-20% ； 所述培養(yǎng)液為PCS培養(yǎng)液、Mandels培養(yǎng)液或梭菌增殖培養(yǎng)基； ②載體制備將80°C烘干的棉桿粉碎后過O.4 _篩子備用； ③吸附發(fā)酵在棉桿粉中加入占棉桿重量2-3%的尿素、O.1-0. 5%的魚粉、O. 1-0. 3%的酵母粉和45-55%的自來水，邊攪拌邊噴灑占棉桿粉1-2%的預發(fā)酵好的復合菌液置于發(fā)酵缸內(nèi)于50-60°C保溫培養(yǎng)，每天攪拌1-2次，每3-4天噴灑I次同樣的菌液，第5次噴灑菌液量為棉桿粉重的10-20%，噴灑后立即60-70°C烘干，當總體水分含量為20-25%時即刻停止干燥，即成制品并包裝。
4.根據(jù)權利要求3所述的制備權利要求I所述的一種快速分解棉桿的復合菌劑的方法，其特征在于所述PCS培養(yǎng)液為改良PCS培養(yǎng)基，其配制方法為NaCl 5 g，CaCO3 2.5g，蛋白胨 5 g，酵母粉 I g, K2HPO4 I g, MgSO4 ·7Η20 O. 35 g，干棉桿 I. 5 g、蒸懼水 I L,pH7. 0，121°C 滅菌 20 min。
5.根據(jù)權利要求3所述的制備權利要求I所述的一種快速分解棉桿的復合菌劑的方法，其特征在于所述Mandels培養(yǎng)液組成為蛋白胨2. 5g，(NH4)2SO4 I. 4g，MgSO4 · 7H20O.3g, KH2PO4 2g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 5mg, MnSO4 I. 6mg, ZnCl2 I. 7mg, CoCl2 I. 7mg, CaCO3 2g，干棉桿2 g,蒸懼水I L, pH 7.0。
6.根據(jù)權利要求3所述的制備權利要求I所述的一種快速分解棉桿的復合菌劑的方法，其特征在于所述梭菌增殖培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物3g，NaCl 5. Og,半胱氨酸鹽酸鹽O. 5g,醋酸鈉3. Og,碳酸韓3g,干棉桿2. 5 g,蒸懼水I L, pH 7.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能快速分解棉稈的復合菌劑及其制備方法，菌劑由熱纖梭菌、脫硫腸狀菌、嗜熱地衣芽孢桿菌、溶纖維丁酸弧菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌等6株細菌構成，各細胞數(shù)含量分別為10-20%、5-15%、5-35%、5-20%、25-35%和10-20%。制備方法將上述6株細菌進行混合發(fā)酵，待生長和分解能力旺盛時，進行棉稈快速分解復合菌劑制備，載體為棉稈，加入酵母粉、魚粉等，噴灑菌液，烘干數(shù)次即得。本發(fā)明將六株細菌組合在一起，通過它們之間的協(xié)同功能發(fā)揮整體分解活性，對棉稈等具有很好的適應能力，對棉桿中的纖維素和半纖維素實現(xiàn)高效分解，棉桿經(jīng)6天分解，總分解率達34.7%，半纖維素分解64.2%，纖維素分解43.1%，木質(zhì)素損失11.2%；本復合菌劑還可用于棉稈能源轉(zhuǎn)化和飼料化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/23GK103255091SQ201310167520
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權日2012年5月9日
發(fā)明者郭鵬, 周明, 楊德, 李露, 高虹, 薛淑靜, 陳明利, 史德芳, 程薇, 王少華 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所