急性白血病病理演變前期Evi-1mRNA原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與急性白血病早期病理演變有密切相關Evi-1的方法，包括以下步驟：(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在RNA水平上檢測Evi-1表達量，比現(xiàn)有的臨床生化檢測指標更早期，能實現(xiàn)真正的白血病前期RNA水平篩查，同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低，便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應用。
【專利說明】急性白血病病理演變前期Evi-lmRNA原位雜交檢測試劑盒 及檢測方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及急性白血病病理演變RNA表達改 變（病理演變過程）的相關檢測技術。

【背景技術】
[0002] 研究人員發(fā)現(xiàn)了導致急性白血病復發(fā)的一個基因，如果能找到抑制該基因發(fā)揮作 用的方法，就有可能防止急性白血病的復發(fā)。急性白血病患者中有70 %到80 %的人都會復 發(fā)。其原因是數(shù)量極少的白血病干細胞反復分裂，使白血病細胞大量增殖?？拱┧幬镫m然 能夠殺滅白血病細胞，但難以殺滅其中的白血病干細胞，造成急性白血病屢治屢發(fā)。研究證 實急性白血病復發(fā)患者體內(nèi)的基因"Evi-Ι"在造血干細胞中非?；钴S，這一基因作用于白 血病干細胞，使其不斷分裂，導致白血病細胞大量增殖。研究人員從患白血病的實驗鼠體內(nèi) 取出白血病細胞，去除了"Evi-Ι"基因后再移植到10只健康實驗鼠體內(nèi)。研究小組還給另 外10只健康實驗鼠完整移植了白血病細胞（含"Evi-Γ'）。結果發(fā)現(xiàn)，前一組實驗鼠比后 一組實驗鼠平均晚發(fā)病一個月；而在殺滅兩組實驗鼠體內(nèi)的白血病細胞后，前一組實驗鼠 沒有復發(fā)急性白血病，后一組卻再次發(fā)病。研究人員認為，對照實驗已經(jīng)說明，"Evi-Γ'對 急性白血病的發(fā)作和復發(fā)有推動作用，而這與它作用于白血病干細胞有直接關系。本發(fā)明 人在實驗研究中對急性白血病患者的外周血白細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)Evi-Ι基因過度表達， 表明Evi-Ι基因是急性白血病干細胞的轉(zhuǎn)移源頭，檢測Evi-Ι基因能預測急性白血病患者 復發(fā)的可能，檢測Evi-Ι基因就可能預測急性白血病復發(fā)幾率。
[0003] 隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，為 了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預防癌癥，已取得長足進步。至今，我們已有可能 在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物（mRNA水平或microRNA)上做更精確的早期篩查和診斷，在急 性白血醫(yī)治后的早期就可以預測復發(fā)的風險。
[0004] 本發(fā)明采用核酸原位雜交技術和免疫組化方法對Evi-Ι急性白血病復發(fā)的早期 預警進行檢測分析。
[0005] 本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)Evi-Ι作為急性白血病復發(fā)的預警有非常重要的臨床診 斷意義。Evi-Ι在急性白血病復發(fā)前期有高表達。他作于急性白血病復發(fā)前期的篩查有非 常重要的臨床意義。
[0006] 發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床 診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已?。òl(fā)病后診治），要做到預防性診治，做到治 已病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā) 明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的RNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了 創(chuàng)新。特別是篩選臨床標本（正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者），突破了正常組織與腫瘤 組織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)癌前變的RNA水平，與癌癥早期基因病理生理 學演變密切相關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的 預防性診治，其中包括急性白血病及急性白血病復發(fā)的早期預測，爭取了腫瘤診治的時間 和空間，達到預防占位性癌癥和急性白血病。
[0007] 目前，Evi-Ι表達譜檢測方法用Northern雜交、表達芯片、實時熒光定量PCR和 Solexa測序等分析技術，而這些方法多用于科研方面，不適應臨床應用，而檢測RNA比基因 分析更科學（DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性體現(xiàn)），比蛋白分析更可靠 (RNA與蛋白轉(zhuǎn)錄有時候不同步）。根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料采用原位雜交技術和組化免疫方法 檢測Evi-lmRNA水平表達量的檢測技術及試劑盒未見報道。
[0008] 本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，用原位雜交技術進行檢測，結果表明急性白 血病患者經(jīng)治療后Evi-Ι高表達，病患存在高度復發(fā)風險，應為患者的白血病干細胞在造 血系統(tǒng)中大量存在，表明Evi-Ι可用為急性白血病復發(fā)前期篩查的重要標志物。
[0009] 原位雜交技術（in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合 起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使 含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈（即探針），在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單 鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在 細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
[0010] 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（雖不明 確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子），探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探 針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加 以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常 用的同位素標記物有 3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu) 點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同 位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是 極其靈敏的。
[0011] 根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和 顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針（RNA)和檢測的靶RNA是采用堿基互 補（雜交互補）的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒 有影響。
[0012] 綜上所述，本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交 檢測探針和標記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于急性白血病復發(fā)前期篩查。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術方案如下： 本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的 雜交探針分別具有序列表SEQ ID NO. 1所示序列號：X54989,核苷酸序列長度是3570bp， ⑶S是268. . . 3423bp，位于染色體5q32 "上，本發(fā)明的探針是⑶S中的一段序列，從 901. · · 1201bp，全長 360bp。
[0014] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標記物選自放射性物質(zhì)、化學發(fā)光或顯 色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
[0015] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。
[0016] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。
[0017] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。
[0018] 本發(fā)明的癌變前期Evi-Ι篩查試劑盒應用價值在于，急性白血病前期復發(fā)的篩 查。
[0019] 本發(fā)明還提供一種Evi-Ι原位雜交的檢測方法，包括以下步驟： (1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和 (2) 檢測所述雜交復合體。
[0020] 本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為： 核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16-24小時。
[0021] 本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
[0022] 本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以Evi-Ι為檢 測對象，合成探針是Evi-Ι序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞RNA的表達量。原位雜 交技術的顯示方法能提供Evi-Ι的半定量或定量表達程度判定。
[0023] 本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括： 1) .將待測標本放入反應槽中； 2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液； 3) .儀器自動棄去液體，自動后固定； 4) .儀器自動棄去液體，自動預雜交（42°C ); 5) .儀器自動棄去液體，自動清洗； 6) .儀器自動棄去液體，自動雜交（42°C ); 7) .儀器自動棄去液體，自動清洗； 8) ·儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)（室溫）； 9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色； 10) .取出封片鏡檢。
[0024] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是：以Evi-Ι合成的核酸探針用地高辛標記（地 高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素 標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點），將該雜交探針與人體血 液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA的存在和 定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的RNA的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交 技術，該方法通過檢測底物細胞中的Evi-Ι表達量，用來確定急性白血病病理演變前期的 RNA變化量，預警急性白血病患者治療后是否復發(fā)。
[0025] -個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
[0026] 本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測急性白血病患者治療后復發(fā)的幾率。。
[0027] 此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測 方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。 附圖的簡單說明
[0028] 圖1是本發(fā)明Evi-Ι原位雜交實施例圖（核酸原位雜交技術流程圖）。
[0029] 圖2是本發(fā)明實施例中急性白血病患者Evi-Ι表達圖片。
[0030] 圖3是本發(fā)明實施例中正常人Evi-Ι表達圖片。

【具體實施方式】
[0031] 下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應該理解，下面的實施例用于說明 而非限定本
【發(fā)明內(nèi)容】
，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。
[0032] 實施例1 按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以Evi-Ι設計的雜交探 針、標記物、說明書，其中： 本實施例的探針標記物選用地高辛。 試劑盒雜交液組成： 消化液 100 μ L/管 1管/盒 無色透明液體 保護液 100μ?7管 1管/盒 無色透明液體 預雜交液 1300 μ?7管2管/盒 無色透明液體 正義雜交液 1〇μ?7管 1管/盒 無色透明液體 反義雜交液 1〇μ?7管 1管/盒 無色透明液體 封閉液 1000 μ!7管1管/盒 無色透明液體 堿性磷酸酶抗 體 1μ?7管 1管/盒 無色透明液體 顯色劑Α 175μ?7管 1管/盒 黃色液體 顯色劑Β 320 μ L/管 1管/盒 無色透明液體 淺黃色或無色透明液 緩沖液I 90mL/瓶 1瓶/盒 體 淺黃色或無色透明液 緩沖液II 80mL/瓶 1瓶/盒 體 淺黃色或無色透明液 緩沖液III 20mL/瓶 3瓶/盒 體 淺黃色或無色透明液 緩沖液IV 90mL/瓶 1瓶/盒 體 固定液 90mL/瓶 1瓶/盒 無色透明液體 陽性對照標本6片/盒 配制試劑使用濃度 1) .將10X緩沖液I用三蒸水按1 : 10稀釋成IX緩沖液I ; 2) .將20X緩沖液II用三蒸水按1 : 10稀釋成2X緩沖液II ; 按1 : 100稀釋成0.2X緩沖液II;按1 : 200稀釋成0.1 X緩沖液II; 3) .將10X緩沖液III用三蒸水按1 : 10稀釋成IX緩沖液III ; 4) . 10 X緩沖液IV用三蒸水按1 : 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10mL，力口 水至100mL既可）。
[0033] 實施例2 應用核酸原位雜交檢測方法對急性白血病患者血液標本和正常人Evi-Ι表達量的實 施過程： 1) .取待測標本兩張； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加 IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度）50ml，37°C水浴預熱10min，放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗5min ; 3) .用0.2%的保護液（保護液lml加 IX緩沖液I，99ml即為使用濃度）洗lOmin，三 蒸水洗5min (以上過程都在玻璃缸進行），取出玻片，讓其自然干燥； 4) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預雜交液25 μ L/片（加在有細胞的地方），蓋上蓋玻片， 蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70^^90^^95 %的乙醇各洗 2min，取出，自然干燥； 6) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25 μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ; 7) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)： 在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min ; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min ; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ; 8) .用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0. 5%封閉液（1ml封閉液加5mllX緩沖液III) 100 μ L/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。（此步驟不需加蓋玻片）； 10) .取出玻片，用IX緩沖液ΠΙ洗30s，自然干燥； 11) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加 X-AP抗體（取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入 1.811111\緩沖液111)10(^17片，蓋緊保濕盒在室溫下作用3〇1^11，時間不能過長，否則會 產(chǎn)生假陽性（此步驟不需加蓋玻片）； 12) .取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min; 13) .用1 X緩沖液IV洗2min，加顯色劑（顯色劑A73. 3 μ L，顯色劑B157. 5 μ L加到 30mLl X緩沖液IV中，混勻），室溫避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的IX緩沖液I混勻）封片鏡檢。
[0034] 本發(fā)明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下 觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的RNA的表達量。
【權利要求】
1. 一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針分 別具有序列表SEQ ID NO :X54989所示的序列CDS中一段序列，從901. . . 1261bp。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質(zhì)、化學發(fā)光 或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6. -種Evi-Ι基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 在權利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物 中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和 (2) 檢測所述雜交復合體。
7. 如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件 為：核酸雜交的溫度為42C ;核酸雜交的時間為16-24小時。
8. 如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9. 如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液標本（白血病患者、正常人 標本）。
10. 如權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述包括臨床上的急性白血病患者病 理演變過程，以及白血病經(jīng)治療后的復發(fā)病理演變過程。
【文檔編號】C12Q1/68GK104141001SQ201310167925
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月9日 優(yōu)先權日:2013年5月9日
【發(fā)明者】張云福, 裘建英, 裘霖, 張玉麗 申請人:嘉興瑞康生物科技有限公司