專利名稱：用于高密度培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及用于高密度培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)海洋環(huán)境下微生物資源的開發(fā)如今已形成相當?shù)囊?guī)模。但極端環(huán)境下的海洋微生物資源的開發(fā)還處在逐步發(fā)展的階段，嗜熱海洋微生物就是來源于地熱含油地質(zhì)層、深?；鹕侥?、深海熱液口等特殊生境的一類微生物資源。嗜熱菌因其對高溫獨特的適應(yīng)性而備受人們關(guān)注，一般是指最適生長溫度大于45°C的一類微生物，目前已有約70個屬140種嗜熱菌得到了鑒定，而嗜熱海洋微生物因來源海洋而往往具有特殊性。目前嗜熱菌的研究主要集中在資源研究、耐熱機制研究和工業(yè)應(yīng)用研究等方面。深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.1j，是由是由中國海洋第三研究所分離得到的、來源于深海、最適生長溫度在60°C的一類中度嗜熱微生物。由于其來源于深海這一極端環(huán)境，對溶氧、高鹽、高溫、高壓等環(huán)境條件可能會有特殊的生理相應(yīng)，因此可以進行很多新穎性研究和探索。如在應(yīng)用方面，可探索用其生產(chǎn)相關(guān)嗜熱酶，也可以克隆其相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入其他細菌以生產(chǎn)某種工業(yè)產(chǎn)品，或作為宿主菌表達某些特殊工業(yè)用酶或活性物質(zhì)。但隨著研究的深入，提高相應(yīng)菌體密度以滿足研究需求就顯得必不可少。然而,對于嗜熱菌Geobacillus sp.1j而言,菌體密度成為各項研究的瓶頸,特別在其規(guī)?；囵B(yǎng)領(lǐng)域，如果不能有效提高其菌體密度，就很難進行相應(yīng)的研究和工業(yè)化生產(chǎn)過程。因此通過優(yōu)化其培養(yǎng)環(huán)境、改善其發(fā)酵工藝已成為當務(wù)之急。培養(yǎng)基是微生物生長的基質(zhì)，開發(fā)一種用于深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.1j提高菌體密度的新型培養(yǎng)基是目前工作的重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其制備方法及應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括以下組分:可溶性淀粉4_20g/L ；酵母粉2-10g/L ；蛋白胨2-10g/L;氯化鈉5_20g/L ；無水硫酸鎂0.1-5g/L;氯化鎂2_20g/L;氯化鉀0.01_2g/L;
氯化鈣0.01-lg/L;磷酸氫二鉀0.02_2g/L;硫酸亞鐵銨0.001-0.lg/L ;和氯化鎳0.0001-0.001g/L。在一個優(yōu)選例中，所述的深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.是Geobacillus sp.Uo在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基包括以下組分:可溶性淀粉6_18g/L ；酵母粉3_8g/L;蛋白胨3_8g/L;氯化鈉6_16g/L ；無水硫酸鎂0.8-4g/L ；氯化鎂5_15g/L ；氯化鉀0.1-1.5g/L ；

氯化鈣0.05-0.5g/L ；磷酸氫二鉀0.Ι-lg/L ；硫酸亞鐵銨0.005-0.05g/L ;和氯化鎳0.0003-0.00lg/L。在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基包括以下組分:可溶性淀粉12g/L ；酵母粉5g/L ；蛋白胨5g/L;氯化鈉10g/L ；無水硫酸鎂1.669g/L ；氯化鎂8.92g/L ；氯化鉀0.33g/L ；氯化鈣0.lg/L ；磷酸氫二鉀0.183g/L ；硫酸亞鐵銨0.01g/L;和氯化鎳0.0005g/L ；其中，各組分在培養(yǎng)基中的含量可在±10%(更佳地±5%)范圍內(nèi)浮動。在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中，還含有有效量(適于細菌生長的量)的微量元素；較佳地，微量元素含量為:氨三乙酸0.0128-0.256g/L ；四水合氯化亞鐵0.001-0.02g/L ；四水合氯化錳0.0005-0.01g/L ；四水合氯化鈷0.0003-0.006g/L ；二水合氯化銅0.00005-0.00lg/L ；鑰酸鈉0.00005-0.00lg/L ；
硼酸0.00002-0.0004g/L ;和六水合氯化鎳0.00002-0.0004g/L。在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中，各組分配制于水(較佳地，所述的水是去離子水)中；和/或所述培養(yǎng)基的pH值6.35 ±0.5。在本發(fā)明的另一方面，提供前面任一所述的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.，獲得高密度菌體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備前面任一所述的深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基的方法,其特征在于,所述方法包括:(a)將所述可溶性淀粉進行糊化，冷卻；(b)將所述酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨混合；(c)將上述兩步驟得到的溶液混合均勻，添加氯化鎳溶液以及可選的微量元素；其中，各組分的用量按照前面任一所述。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述糊化為用少量水(較佳地為去離子水)將所述可溶性淀粉制成懸濁液，然后緩慢倒入90-10(TC去離子水并不斷攪拌，制成半透明狀液體。在另一優(yōu)選例中 ，步驟(C)之后，進一步包括:將pH調(diào)至6.35±0.5，在121°C滅菌20_30mino在本發(fā)明的另一方面，提供一種培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的方法，所述方法包括:利用前面任一所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.，從而獲得高密度菌體。在一個優(yōu)選例中，將深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.按體積比1_3%的接種量接種入前面任一所述的培養(yǎng)基，60°C、靜置于高溫恒溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)72-96h，每隔12h進行一次振蕩處理，使菌液混合均勻；培養(yǎng)60-96h。在另一優(yōu)選例中，用于接種的種子液的0D_為1.8-2.4，菌落數(shù)密度約為3.6Χ106-4.8X106CFU/ml。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的試劑盒，所述試劑盒中包括:前面任一所述的培養(yǎng)基。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，研究開發(fā)了一種新的適合于高密度培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)的培養(yǎng)基配方。本發(fā)明的培養(yǎng)基，適合于深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的生長，且可大大地提聞最終獲得的菌體
山/又ο如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
術(shù)語“本發(fā)明的深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基”指含有可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨、氯化鎳和可選的微量元素的組合物；或基本上由可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨、氯化鎳和可選的微量元素組成的組合物。在組合物中，所述的可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨、氯化鎳和可選的微量元素占培養(yǎng)基總重量的80-100%，較佳地占 90-100%，更佳地占 95-100%，如 98%，99%。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的深海海洋嗜熱細菌Geobacillussp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)培養(yǎng)基的各組分的用量如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括以下組分: 可溶性淀粉4-20g/L ； 酵母粉2-10g/L ； 蛋白胨2-10g/L; 氯化鈉5-20g/L ； 無水硫酸鎂0.l-5g/L ； 氯化鎂2-20g/L ； 氯化鉀0.01-2g/L ； 氯化鈣0.ΟΙ-lg/L ； 磷酸氫二鉀0.02-2g/L ； 硫酸亞鐵銨0.001-0.lg/L ;和 氯化鎳0.0001-0.001g/L。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括以下組分: 可溶性淀粉6-18g/L ； 酵母粉3-8g/L ； 蛋白胨3-8g/L; 氯化鈉6-16g/L ； 無水硫酸鎂0.8-4g/L ； 氯化鎂5-15g/L ； 氯化鉀0.1-1.5g/L ； 氯化鈣0.05-0.5g/L ； 磷酸氫二鉀0.Ι-lg/L ； 硫酸亞鐵銨0.005-0.05g/L ;和 氯化鎳0.0003-0.001g/L。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括以下組分: 可溶性淀粉12g/L ； 酵母粉5g/L ； 蛋白胨5g/L ; 氯化鈉10g/L ； 無水硫酸鎂1.669g/L ； 氯化鎂8.92g/L ； 氯化鉀0.33g/L ； 氯化鈣0.lg/L ； 磷酸氫二鉀0.183g/L ； 硫酸亞鐵銨0.0 lg/L ;和 氯化鎳0.0005g/L ； 其中，各組分在培養(yǎng)基中的含量可在±10%圍內(nèi)浮動。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中，還含有有效量(適于細菌生長的量)的微量元素；較佳地，微量元素含量為: 氨三乙酸0.0128-0.256g/L ； 四水合氯化亞鐵0.001-0.02g/L ； 四水合氯化錳0.0005-0.01g/L ； 四水合氯化鈷0.0003-0.006g/L ； 二水合氯化銅0.00005-0.00lg/L ； 鑰酸鈉0.00005-0.00lg/L ； 硼酸0.00002-0.0004g/L ;和 六水合氯化鎳0.00002-0.0004g/L。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中，各組分配制于水中；和/或 所述培養(yǎng)基的pH值6.35 ± 0.5。
6.權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillussp.，獲得高密度菌體。
7.一種制備權(quán)利要求1-5任一所述的深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)將所述可溶性淀粉進行糊化，冷卻； (b)將所述酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨混合； (C)將上述兩步驟得到的溶液混合均勻，添加氯化鎳溶液以及可選的微量元素； 其中，各組分的用量按照權(quán)利要求1-5任一所述。
8.—種培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的方法,其特征在于,所述方法包括:利用權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.，從而獲得高密度菌體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,將深海海洋嗜熱細菌Geobacillussp.按體積比1-3%的接種量接種入權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基，60°C、靜置于高溫恒溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)72-96h，每隔12h進行一次振蕩處理，使菌液混合均勻；培養(yǎng)60-96h。
10.一種用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp.的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中包括:權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于高密度培養(yǎng)深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨、氯化鎳。本發(fā)明的培養(yǎng)基，適合于深海海洋嗜熱細菌Geobacillus sp的生長，且可大大地提高最終獲得的菌體密度。
文檔編號C12N1/20GK103243048SQ20131017044
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者周祥山, 蔣濤, 蔡孟浩, 張元興 申請人:華東理工大學