專利名稱：產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用透明顫菌血紅蛋白基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中表達提高豐加霉素產(chǎn)量的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豐加霉素是一種新型核苷類抗生素，分子式為C12H13N5O4,核糖C1連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環(huán)，核心結(jié)構(gòu)為吡咯嘧啶核苷類似物。作用機理主要是通過抑制微生物的轉(zhuǎn)錄而影響菌體的生長，其生物活性研究報道主要集中在臨床醫(yī)學領(lǐng)域。近期有研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素對多種植物疫病具有良好的防治效果，長期使用不會造成環(huán)境污染，而且對植物生長也具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有的應(yīng)用潛力。相對于化學合成法，生物法合成豐加霉素以可再生資源為原料，具有反應(yīng)條件溫和、污染少以及成本低廉等優(yōu)點，因此，生物合成法是目前豐加霉素工業(yè)化生產(chǎn)比較經(jīng)濟有效的方法。豐加霉素屬于次級代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中菌絲結(jié)構(gòu)稠密，發(fā)酵液粘稠導致溶氧水平受到限制，導致豐加霉素合成水平較低，生產(chǎn)能耗較大，難以規(guī)模化生產(chǎn)。解決該問題的現(xiàn)有方法一般都局限于通過通入純氧、通氣/攪拌優(yōu)化配置等方式來提高細胞生長環(huán)境中的氧氣傳遞性質(zhì)，增加了生產(chǎn)成本。透明顫菌血紅蛋白(VHb)是目前為止研究最為透徹的原核生物血紅蛋白，許多研究均表明它在細胞中處于限氧條件下促進細胞生長、提高細胞培養(yǎng)密度和蛋白質(zhì)合成能力。抗生素的生產(chǎn)是一個好氧的過程，由于VHb在微氧條件下可以提高細胞的溶氧水平，促進細胞的生長以及提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此VHb在抗生素生產(chǎn)中受到廣泛的研究和應(yīng)用。安德榮等SOE-PCR (S plicing by overlap extension PCR)技術(shù)構(gòu)建含紅霉素抗性基因啟動子和vgb結(jié)構(gòu)基因融合片段的整合型表達載體pJDlOO，利用接合轉(zhuǎn)移法將vgb基因整合到瑞拉菌素產(chǎn)生菌委內(nèi)瑞拉鏈霉菌秦嶺變種中，使工程菌株的效價提高，但其中獲得基因融合片段的過程操作復雜，易產(chǎn)生移碼突變。陳文青等基于質(zhì)粒PWQ2005中的硫鏈絲菌素誘導啟動子啟動vgb的表達,利用接合轉(zhuǎn)移法將vgb基因整合到泰樂菌素的生產(chǎn)菌株弗氏鏈霉菌中，但由于啟動子受到硫鏈絲菌素誘導，發(fā)酵過程中添加對菌體生長不利。載體PIB139是在鏈霉菌整合型質(zhì)粒PSET152的多克隆位點加入啟動子PermY^構(gòu)建而成的鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，便于基因在鏈霉菌中的高效表達，同時由于其中具有用于接合轉(zhuǎn)移的orn功能區(qū)域，鏈霉菌篩選標記-安普抗性基因(mpD,整合酶基因，鏈霉菌溫和噬菌體OC31的WiP位點。因此，PIB139可利用簡便高效的屬間接合轉(zhuǎn)移法導入鏈霉菌，并可通過特異性重組整合在鏈霉菌染色體的禮位點上，隨著宿主染色體的復制而復制并賦予安普抗性。趙廣榮等將vgb基因置于pIB139中的下游，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入鏈霉菌中。但是其中原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化操作復雜，需要原生質(zhì)體的制備，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化還存在宿主的限制性修飾系統(tǒng)而導致轉(zhuǎn)化效率較低，同時趙廣榮等并未考察重組菌中vgb表達對菌株合成目的代謝產(chǎn)物的影響。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌^Streptomyces dias ta tochromogenes) 1628 是一株拮抗放線菌，其發(fā)酵液對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，經(jīng)分離提取，確定其主要有效成分為豐加霉素，尚未見淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的遺傳表達體系的研究報道。本發(fā)明以綠色熒光蛋白基因(gfp)作為報告基因，成功構(gòu)建了含有/κ /ΤΒΕ*啟動子的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌重組表達載體pIB139-gfp，對其在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中啟動子活性進行研究后發(fā)現(xiàn)，在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中啟動子可有效啟動外源基因的表達。在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了攜帶有來源于透明顫菌血紅蛋白基因vgb的表達質(zhì)粒pIB139-vgb，并通過接合轉(zhuǎn)移法將其整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628染色體上?！N產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌，它的染色體上整合有來源于透明顫菌的血紅蛋白基因Fg力，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌i^treptomyces dias ta tochromogenes)1628更高的豐加霉素合成能力。所述的產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌的構(gòu)建方法，過程如下:
O構(gòu)建表達載體pIB139-Vgb ；
2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。所述的方法，利用pIB139載體上的啟動子pernm啟動vgb基因的表達，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體PIB139-V gb特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(51 trep tomycesdi as ta tochromoge nes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌生產(chǎn)豐加霉素的用途，將重組菌1628-VHB進行發(fā)酵，與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高了 21.2%，菌濃提高了 11.6%。本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途，得到了整合血紅蛋白基因Vgb的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌后使其合成豐加霉素的能力比原始菌提高了21.2%，菌濃提高了 11.6%。為進一步改善發(fā)酵法生產(chǎn)豐加霉素過程中溶氧的問題奠定了基礎(chǔ)。


圖1重組質(zhì)粒pIB139_gfp的構(gòu)建示意圖。圖2質(zhì)粒pET28_gfp的酶切電泳驗證圖。其中，M1: λ DNA///i/ d III Marker, M2:DL2000 Marker, 1: pET28a-^-y7 /i C(9Rl+Η η III 雙酶切；2: pMD18_ -gfp/BcoR l+Η η III 雙酶切；3:貧的 PCR 產(chǎn)物
圖3質(zhì)粒pIB139-gf/7的酶切電泳驗證圖。其中，M:DL2000 Marker; 1: ^\^~gfp/Xba Ι+Μ Ι 雙酶切；2: pIB139A aIWoiI雙酶切；
圖4重組菌1628-GFP的PCR電泳驗證圖。其中，1-4:以重組菌1628-GFP為模板PCR擴增貧f/7基因；5:以1628為模板PCR擴增貧令；M: DL2000 Marker 圖5啟動子轉(zhuǎn)錄活性測定圖。其中，出發(fā)菌株1628和重組菌1628-GFP的綠色熒光檢測:A.出發(fā)菌株1628; B.重組菌株1628- GFP
圖6重組質(zhì)粒PIB139-F.#的構(gòu)建示意圖。圖7重組質(zhì)粒pET28a-1^^的酶切電泳驗證圖。其中，1:pET28a-K^/^coR l+Η η III雙酶切；2: pET28a/^boR l+Η η III雙酶切；M: DL2000.圖8重組質(zhì)粒ρΙΒ139-ι^6的酶切電泳驗證圖。Μ: DL2000; 1: pIB139/ Nde l+Not I雙酶切；2: pIB139-^/ Nde !+Not I雙酶切.圖9重組菌1628-VHB的PCR電泳驗證圖。其中，1-4:以重組菌1628-VHB為模版PCR擴增a/ττ基因；5:以原始菌1628為模板PCR擴增apr基因；6_9:以重組菌1628-VHB為模版PCR擴增vgb基因；10:以原始菌1628為模板 PCR 擴增 vgb 基因；M:DL2000 Marker。圖10重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB的CO差光譜圖。
具體實施例方式實施例1:以綠色熒光蛋白基因gfp作為報告基因的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌遺傳表達體系的構(gòu)建:
以質(zhì)粒pCAMBIA1302為模板，以 gfp EcoR I和Pg/pR Hindlll為引物PCR獲得含有I與歷fldIII兩個酶切位點的片段，與pMD18-T Vector連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-^//7 iEcoR Ι+Η η ΙΙΙ) 0 將克隆載體 pMD18-T-^f/ 0boR I+ HindII )轉(zhuǎn)化至厶coli JM109受體菌，涂布·于含Amp、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)過夜后，平板上長出許多白色菌落。隨機挑取白色克隆酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司測序用EcoR I與#i/7dIII雙酶切得到含有I與Hind III兩個酶切位點的片段，與同樣酶切的pET28a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后在Kan抗性LB平板篩選得到轉(zhuǎn)化子，獲到質(zhì)粒pET28a-^f/7。然后用Xba I與Afoi I雙酶切pET28a_^f/7，與同樣酶切的pIB139連接轉(zhuǎn)化，涂布阿泊拉霉素抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子，酶切驗證，即獲得重組質(zhì)粒pIB139-g//7 (圖1)。根據(jù)GenBank公布的綠色突光蛋白基因貧令序列，設(shè)計引物,通過PCR技術(shù)從質(zhì)粒pCAMBIA1302中擴增出序列。引物設(shè)計如下:
PgfpF BcoR 1:5’ -ACGTtXlGiATGGTAGATCTGACTAGPgfpR NindlI1:5’ -ACGg^m^CCCGATCTAGTAAC
如圖2和3所示，分別為重組質(zhì)粒pET28a-^f/7和pIB139_^f/7酶切驗證結(jié)果。重組質(zhì)粒pET28a-g//7經(jīng)&oR I與歷/ dIII雙酶切后獲得約1.1kb和5.3kb的DNA片段，分別與基因片段和質(zhì)粒pET28a的大小一致(圖2)。重組質(zhì)粒pIB139_^f/7經(jīng)油a I與I雙酶切后獲得約1.1kb和5.9kb的DNA片段，分別與基因片段和質(zhì)粒pIB139的大小一致(圖3)。以上結(jié)果證明重組質(zhì)粒pIB139-貧f/7構(gòu)建正確。提取質(zhì)粒pIB139-g//7，用接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌。在阿泊拉霉素抗性平板上隨機挑取若干菌落于CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取染色體。PCR實驗均能擴增出gfp基因(圖4)，證明重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-GFP構(gòu)建成功。實施例2:以綠色熒光蛋白基因作為報告基因的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌遺傳表達體系的初步評價:
挑取在含50 μ g/mL阿泊拉霉素的平板生長的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌落接種CP培養(yǎng)基，28 0C , 180 r/min振蕩過夜，然后再以1:50的接種量分別接種于裝有50 mL新鮮CP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，細胞干重(DCW)約為0.3 g/L, 6000 r/min離心收集菌絲體，用PBS緩沖液洗滌菌絲體2次后，重懸于30 mL PBS中。取5 -10 μ L菌液涂片，在Olympus BX50突光顯微鏡下觀察，同時用SONY 3CO)的Color Video Camera拍照。以野生菌作為對照，選擇激發(fā)濾光片為485 nm，發(fā)射濾光片為520 nm，確定啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示重組菌1628-GFP菌絲能發(fā)出穩(wěn)定的明亮的綠色熒光(圖5)，而對照無熒光，說明在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628中啟動子能有效啟動外源基因的表達。實施例3:透明顫菌血紅蛋白基因vgb在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中的表達:
重組質(zhì)粒PIB139-F.#的構(gòu)建如圖6所示,步驟與重組質(zhì)粒PIB139-F.#的構(gòu)建方法類似。如圖7和圖8所示，分別為重組質(zhì)粒pET28a-1^^和ρΙΒ139_ι^6酶切驗證結(jié)果。重組質(zhì)質(zhì)粒pET28a-r#經(jīng)&oR I與歷雙酶切后獲得約0.5kb和5.3kb的DNA片段，分別與vgb基因片段和質(zhì)粒pET28a的大小一致。重組質(zhì)粒pIB139-r#經(jīng)與Not I雙酶切后獲得約0.6kb的DNA片段，與vgb基因片段的大小一致。以上結(jié)果證明重組質(zhì)粒pIB139_Fg^構(gòu)建正確。 提取質(zhì)粒pIB139-r#，用接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628。在阿泊拉霉素抗性平板上隨機挑取若干菌落于CP培養(yǎng)基中多次培養(yǎng)后，提取染色體。PCR實驗均能擴增出vgb基因和阿泊拉霉素抗性基因apr (圖9)，證明質(zhì)粒pIB139-r#成功的整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的染色體上，且遺傳穩(wěn)定，重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB構(gòu)建成功。成功獲得重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB后，對其進行VHb的表達研究，并通過CO差光譜法測定了 VHb的表達量。如圖10所示，以原始淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628做對照，重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB,與CO結(jié)合后在419nm處均出現(xiàn)吸收峰，證明vgb基因以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌為宿主細胞，在啟動子作用下，能表達出具有活性的血紅蛋白。將重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，180 r/min發(fā)酵96h。對照組為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌出發(fā)株。發(fā)酵結(jié)束后，分別測定了菌濃，豐加霉素產(chǎn)量。如下表I所示，重組菌株的產(chǎn)素水平較出發(fā)菌株提高了 21.2%，菌濃提高了 11.6%，且重復性良好。說明VHb的表達有利于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌體的生長和豐加霉素的合成。表I VHb表達對1628菌體生長和豐加霉素生物合成的影響
Ii體 I豐加霉素產(chǎn)量(mg/L) I細胞干重(g/L)
1628134.97_0.43_
1628-VHB 1163.52|θ.49
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌，其特征在于，它的染色體上整合有來源于透明顫菌的血紅蛋白基因，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌i^treptomycesdiastatochromogenes) 1628更高的豐加霉素表達能力。
2.一種如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，過程如下: O構(gòu)建表達載體pIB139-vgb ； 2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用PIB139載體上的啟動子permE*啟動vgb基因的表達，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-vgb特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌{Streptomyces di as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。
4.一種利用如權(quán)利要求1所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌生產(chǎn)豐加霉素的用途，其特征在于，將重組菌1628-VHB進行發(fā)酵，與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高了.21.2%，菌濃提 高了 11.6%ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途。它的染色體上整合有來源于透明顫菌的血紅蛋白基因vgb，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628更高的豐加霉素表達能力。構(gòu)建過程如下1)構(gòu)建表達載體pIB139-vgb；2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。利用pIB139載體上的啟動子permE*啟動vgb基因的表達，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-vgb特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高21.2%，菌濃提高了11.6%。
文檔編號C12P19/40GK103243062SQ201310170658
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者馬正, 俞曉平, 劉金秀, 申屠旭萍, 邊亞琳, 郝培應(yīng), 許益鵬 申請人:中國計量學院