專利名稱：一種利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于胚胎體外培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
胚胎體外培養(yǎng)經(jīng)歷了胚胎與單獨專用培養(yǎng)液培養(yǎng)、不同培養(yǎng)液序貫共培養(yǎng)、與單層輔助細(xì)胞(Helper Cell)共培養(yǎng)、與不同單層輔助細(xì)胞序貫共培養(yǎng)等階段。胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)的研究為胚胎體外操作提供了可能。體外胚胎培養(yǎng)有力促進(jìn)了育種學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)及胚胎工程學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。近年來隨著胚胎培養(yǎng)液的不斷改進(jìn)，胚胎的體外發(fā)育率也得到了很大提高。但由于脫離母體環(huán)境，胚胎的發(fā)育率及質(zhì)量仍有很多問題。如體外生產(chǎn)的胚胎染色體倍型異常率較高，rRNA基因的活性明顯降低，許多蛋白因子基因的表達(dá)存在一定的差異，胚胎冷凍保存的效果較差體。外培養(yǎng)系統(tǒng)缺陷是導(dǎo)致胚胎吸收、死亡、流產(chǎn)、死胎或出生后死亡、以及胎兒過大綜合癥(Overgrowth Syndromes)的一個重要原因。哺乳動物早期胚胎的發(fā)育始于輸卵管，然后進(jìn)入子宮，最終在子宮發(fā)育為胎兒。因此更近似地模擬體內(nèi)發(fā)育程序和發(fā)育環(huán)境是提高體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育率和發(fā)育質(zhì)量的有效方法。目前，胚胎體外共培養(yǎng)研究僅限于某種單層培養(yǎng)細(xì)胞與胚胎一直共培養(yǎng)到囊胚，這種體系雖然提高了胚胎體外發(fā)育率及發(fā)育質(zhì)量，但輸卵管上皮細(xì)胞或子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在體內(nèi)處于緊密排列的柱狀三維狀態(tài)，而體外單層培養(yǎng)的這些細(xì)胞則呈鋪路石狀無序排列，因此其在形態(tài)和生理功能上與體外仍然有很大差異，不能很好地模擬體內(nèi)發(fā)育環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上問題，本發(fā)明實施例提供了一種利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法。本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法，該方法包括以下步驟:步驟一、制備I型液態(tài)鼠尾膠原；步驟二、分離新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系；步驟三、分離新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系；步驟四、傾去輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)；步驟五、傾去子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將發(fā)育至桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。
進(jìn)一步、分離獲得的新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞接種后采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2-3天。進(jìn)一步、分離獲得的新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞接種后采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2-3天。進(jìn)一步、小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)時間為24-30小時。進(jìn)一步、桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至囊胚階段。本發(fā)明提供的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法利用細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)，使在體外培養(yǎng)的輸卵管上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與體內(nèi)狀態(tài)接近，將胚胎先在輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系共培養(yǎng)，然后再在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞三維培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)，從而在程序和發(fā)育環(huán)境上建立了一種更近似模擬體內(nèi)生理環(huán)境的胚胎體外培養(yǎng)方法，可顯著提高小鼠胚胎的體外發(fā)育率，改善發(fā)育質(zhì)量。


圖1是本發(fā)明實施例提供的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法流程圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。 圖1示出了本發(fā)明提供的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法的流程。為了便于說明，僅僅示出了與本發(fā)明相關(guān)的部分。如圖1所示，本發(fā)明的實施例提供的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法包括以下步驟:步驟一、制備I型液態(tài)鼠尾膠原；步驟二、分離新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系；步驟三、分離新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系；步驟四、傾去輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)；步驟五、傾去子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將發(fā)育至桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，分離獲得的新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞接種后采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2-3天。作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，分離獲得的新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞接種后采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2-3天。
作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)時間為24-30小時。作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至囊胚階段。下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。本發(fā)明實施例提供的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法利用細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)，使在體外培養(yǎng)的輸卵管上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與體內(nèi)狀態(tài)接近，將胚胎先在輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系共培養(yǎng)，然后再在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞三維培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)。本發(fā)明實施例提供的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法具體方法分以下步驟:1、制備I型液態(tài)鼠尾膠原。2、分離新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上用DMEM培養(yǎng)液原代培養(yǎng)2-3天， 建立輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系。3、分離新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上用DMEM培養(yǎng)液原代培養(yǎng)2-3天，建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系。4、傾去輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中DMEM培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)24-30小時；之后傾去子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中DMEM培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將發(fā)育至桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至囊胚階段。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 步驟一、制備I型液態(tài)鼠尾膠原； 步驟二、分離新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系； 步驟三、分離新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系； 步驟四、傾去輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)； 步驟五、傾去子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將發(fā)育至桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述 的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法，其特征在于，分離獲得的新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞接種后采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2-3天。
3.如權(quán)利要求1所述的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法，其特征在于，分離獲得的新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞接種后采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2-3天。
4.如權(quán)利要求1所述的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法，其特征在于，小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)時間為24-30小時。
5.如權(quán)利要求1所述的利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法，其特征在于，桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至囊胚階段。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用三維序貫共培養(yǎng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)的方法，該方法步驟如下制備I型液態(tài)鼠尾膠原；分離新西蘭大白兔的輸卵管上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系；分離新西蘭大白兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，接種于I型液態(tài)鼠尾膠原上，培養(yǎng)建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系；傾去輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將小鼠受精卵置于輸卵管上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)；傾去子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液，換成CZB為培養(yǎng)液，將發(fā)育至桑葚胚階段的小鼠胚胎轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。本發(fā)明可顯著提高小鼠胚胎的體外發(fā)育率，改善發(fā)育質(zhì)量。
文檔編號C12N5/073GK103232970SQ201310171828
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者宋宇軒, 曹斌云, 安小鵬 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)