專利名稱：一種小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法。
背景技術(shù)：
原位雜交(in situ Hybridizztion, ISH)技術(shù)是細(xì)胞學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)成功結(jié)合的產(chǎn)物，目前在外源物質(zhì)鑒定上應(yīng)用最為廣泛，它是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將經(jīng)放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的外源核酸探針與染色體制片上的特異染色體進(jìn)行雜交，并對(duì)雜交信號(hào)放大，通過(guò)放射自顯影或其它檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，以確定某物種的異源染色體或其片段的技術(shù)。具體方法包括:1染色體制片，2探針和封阻DNA制備，3DNA的檢測(cè)，4DNA的剪切，5缺口平移法地高辛標(biāo)記DNA程序，6染色體制片的變性，7雜交洗脫熒光信號(hào)的檢測(cè)，8復(fù)染和封片。原位雜交雖能清楚而準(zhǔn)確的鑒定小麥背景中外源染色體及其片段，但不能具體區(qū)分導(dǎo)入小麥背景中的外源染色體的同源群歸屬。而且此方法程序復(fù)雜投入較大，技術(shù)要求較高。染色體分帶技術(shù)是通過(guò)一定的堿、酸、鹽、溫度等因素對(duì)染色體進(jìn)行處理，借助Giemsa等染料染色，使染色體在一定部位呈現(xiàn)深淺程度不同的染色區(qū)段而形成特定的帶紋，由于其帶紋在各染色體上顯示的位置、寬窄、大小、數(shù)目、濃淡等具有相對(duì)的穩(wěn)定性，故可用來(lái)進(jìn)行染色體的鑒別和分析。具體方法包括:1染色體制片，2染色體預(yù)處理，3Giemsa等染料染色，4洗脫，5封片觀察。染色體分帶根據(jù)其帶紋的不同可區(qū)分外源染色體，分辨同源群關(guān)系，但多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明染色體分帶帶紋模糊且易丟失，對(duì)于不同物種不同染料，染色強(qiáng)弱，溫度，時(shí)間不易把握，且染色體制片技術(shù)要求較高。同工酶是結(jié)構(gòu)不同但功能相同的一類酶。在一定條件下電泳染色，同一遺傳材料可同時(shí)顯示幾條酶帶，而不同的 遺傳材料可具有不同的酶帶。同工酶是基因的直接產(chǎn)物，是基因表達(dá)的結(jié)果。具體方法包括:1取樣，2配制酶提取液，3研磨離心，4電泳。研究同工酶表達(dá)有利于探明外源基因向栽培小麥轉(zhuǎn)移的過(guò)程。隨著電泳技術(shù)的提高，小麥7個(gè)部分同源群染色體長(zhǎng)、短臂的特異性生化標(biāo)記-同工酶位點(diǎn)已確定。但此技術(shù)不易操作，酶提取程序繁瑣，不同的酶在植株不同部位及發(fā)育時(shí)期含量都不同。比較而言，SCAR標(biāo)記技術(shù)是一種快速便捷的鑒定小麥背景中外源遺傳物質(zhì)的方法，為高效篩選外源種質(zhì)提供了可靠保障，從而提高了外源種質(zhì)的利用效率。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法，本發(fā)明利用RAPD引物進(jìn)行華山新麥草特異序列篩選；將特異條帶回收、克隆、測(cè)序、比對(duì)及Southern分析；通過(guò)引物設(shè)計(jì)，進(jìn)行華山新麥草SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化，并利用小麥近源種屬基因組DNA對(duì)SCAR標(biāo)記進(jìn)行特異性檢測(cè)；最終用于鑒定小麥-華山新麥草全套異附加系及未確定同源群關(guān)系的異附加系中華山新麥草整條染色體。該方法為充分利用華山新麥草種質(zhì)資源，簡(jiǎn)化小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法，提高外源種質(zhì)資源的利用效率提供了可靠保障，本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)便易行，適合推廣應(yīng)用。其技術(shù)方案如下:一種小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法，包括以下步驟:I)華山新麥草RAPD特異序列篩選及特異片段回收以華山新麥草和各種小麥近緣種屬基因組DNA為模板，利用RAPDlO堿基隨機(jī)引物共500條進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選華山新麥草特異多態(tài)性條帶并回收該條帶。2)華山新麥草RAro特異序列的克隆根據(jù)T-A克隆法，將回收產(chǎn)物連接、克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，測(cè)序。3)序列比對(duì)分析將測(cè)序結(jié)果提交至NCBIGeneBank利用BLASTn和BLASTx進(jìn)行序列比對(duì)。4) Southren blotting檢驗(yàn)序列的特異性為進(jìn)一步驗(yàn)證華山新麥草特異性序列，以該序列為探針，Ns, ABD, A，AB, AG，AAG,B, C，D, E, H, I, K, M, PPP，B' C'，AtG, R, S，SY, SYff, St, StPY，U, V, W, Y 基因組為模板進(jìn)行 Southren blotting 分析。5) SCAR引物設(shè)計(jì)、驗(yàn)證利用primer ν5.0和oligo ν6.0對(duì)華山新麥草特異性序列設(shè)計(jì)引物，以Ns,ABD,
A,AB, AG, AAG, B, C，D, E, H, I, K, M, PPP，B' C'，AtG, R, S，SY, SYff, St, StPY，U, V，W，Y 基因組為模板擴(kuò)增驗(yàn)證SCAR引物的特異性。6) SCAR標(biāo)記應(yīng)用利用經(jīng)驗(yàn)證的SCAR標(biāo)記，以華山新麥草全套附加系及未確定同源群關(guān)系的附加系為模板擴(kuò)增，檢測(cè)該特異標(biāo)記的應(yīng)用效果。本發(fā)明的有益效果:SCAR標(biāo)記較傳統(tǒng)的鑒定方法有簡(jiǎn)單清晰、特異性高、重復(fù)性強(qiáng)及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。自SCAR標(biāo)記建立以來(lái)，已利用RAPD、AFLP和ISSR等分子標(biāo)記從黑麥、冰草、中間偃麥草、長(zhǎng)穗偃麥草等小麥近緣屬種中篩選出了與其基因組相關(guān)聯(lián)的特異重復(fù)序列，并將其成功的轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，用于追蹤外源染色質(zhì)。本研究成果為高效利用華山新麥草優(yōu)異基因，簡(jiǎn)化小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法提供了可靠依據(jù)。探尋華山新麥草特異重復(fù)序列，并將其轉(zhuǎn)化為華山新麥草特異SCAR標(biāo)記，為小麥-華山新麥草異附加系中間材料的利用提供了快捷的鑒定工具，此方法可對(duì)小麥-華山新麥草雜交后代進(jìn)行早期篩選，提高篩選效率，加速華山新麥草外源種質(zhì)的利用步伐，同時(shí)也為小麥染色體工程育種奠定基礎(chǔ)，對(duì)華山新麥草種質(zhì)資源的利用具有重要意義。


圖1 為 RAPD 引物 OPUlO938 擴(kuò)增結(jié)果，(A) 1，Ns ;2，ABD ;3，A ;4，AB ;5，AG ;6，AAG ；7，B ;8，C ;9，D ;10，E ;11，H ;12，I ;13，Κ ;14，Μ.(B) I, Ns ;2，PPP ；3,B/ C' ;4，AtG ;5，R ;6，S ;7，SY ;8，SYff ；9, St ;10，StPY ;11，U ;12，V ;13，W ;14，Y，箭頭所示為華山新麥草特異擴(kuò)增
產(chǎn)物；
圖2為質(zhì)粒R141酶切結(jié)果，1.質(zhì)粒，2.Ecor I單酶切，3.Pst I單酶切，4.EcorI+Pst I雙酶切，5.回收條帶；M，DNA Maker ；圖 3 為 pHs27 為探針 Southren 雜交結(jié)果，(A) 1，ABD ;2，A ;3，AB ;4，AG ;5，AAG ;6，B ;7，C ;8，D ;9，E ;10，Ns.(B) 1，H ;2，I ;3，K ;4，M ;5，PPP ;6，B' C' ;7，AtG ;8，R ;9，S ;10，Ns.(C) 1，SY ;2，SYff ;3，St ;4，StPY ;5，U ;6，V ;7，W ;8，Y ;9，ABD ;10，Ns ；圖4為SCAR標(biāo)記RHS141在各類基因組中驗(yàn)證結(jié)果，(A) 1，ABD ;2，A ;3，AB ;4，AG ;5，AAG ;6，B ;7，C ;8，D ;9，E ;10，Ns.(B) 1，H ;2，I ;3，K ;4，M ;5，PPP ;6，B' C' ;7，AtG ;8，R ;9，S ;10，Ns.(C) 1，SY ;2，SYff ;3，St ;4，StPY ;5，U ;6，V ;7，W ;8，Y ;9，ABD ;10，Ns ；圖5為SCAR標(biāo)記RHS141在小麥背景中鑒定華山新麥草染色質(zhì)，(A)M, marker ;1，華山新麥草；2，7182 ;3-9，小麥-華山新麥草全套異附加系(lNs-7Ns)。(B)M,marker ；1,ψ山新麥草；2，7182 ;3-17，不確定同源群關(guān)系的附加系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明涉及的遺傳資源華山新麥草(Psathyros tachys huashanica Keng2n = 2x=14, NsNs)采集于中國(guó)陜西省。

一種小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法，包括以下步驟:I華山新麥草RAPD特異序列篩選及特異片段回收以華山新麥草和各種小麥近緣種屬基因組DNA為模板，利用RAPDlO堿基隨機(jī)引物共500條進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選華山新麥草多態(tài)性條帶并將該條帶回收。PCR 反應(yīng)總體系 20 μ L 分別包括:10 X PCR Buffer2 μ L, dNTPs2.5 μ mo I/ml 2 μ L,引物 2.5 μ mol/mll μ L, Mg2+2.5mmol/mll μ L,模板 DNA40_60ng/ μ L2 μ L, Taq 酶 5U/μ L0.2 μ L, ddH2011.8 μ L。反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性4min,94°C變性lmin,34°C退火lmin,72°C延伸lmin,共計(jì)40個(gè)循環(huán)，最后72°C補(bǔ)平10min，4°C保存。結(jié)果顯示RAPD引物0PU10擴(kuò)增出了華山新麥草特異DNA條帶，并將其回收純化，如圖1所示。2華山新麥草RAH)特異序列的克隆根據(jù)T-A克隆法，將回收產(chǎn)物連接、克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)平板培養(yǎng)基藍(lán)白斑初步篩選，挑取白斑轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA。然后將質(zhì)粒DNA分別用Pst I限制性內(nèi)切酶和EcoR I限制性內(nèi)切酶單酶切，以及Pst I和EcoR I雙酶切鑒定。結(jié)果顯示雙酶切片段和回收片段長(zhǎng)度基本一致，說(shuō)明回收條帶已成功構(gòu)建至PMD19-T載體中。最后將成功構(gòu)建的片段選擇3個(gè)陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程公司測(cè)序(簡(jiǎn)稱:上海生工)。10 μ L 連接體系分別包括:目的 DNA3 μ L, pMD19_T Vectorl μ L, ddH201 μ L。Solution 15 μ L。16°C PCR 儀反應(yīng)過(guò)夜。Pst I限制性內(nèi)切酶單酶切反應(yīng)總體系20 μ L包括:質(zhì)粒DNA4 μ L，10Xbuffer2y L, Pst Il μ L，ddH2013 μ L。酶切反應(yīng)溫度:37°C保持 3 小時(shí)。EcoR I限制性內(nèi)切酶單酶切反應(yīng)總體系20 μ L包括:質(zhì)粒DNA4 μ L，10Xbuffer2 μ L，EcoR Il μ L，ddH2013 μ L。酶切反應(yīng)溫度:37°C保持 3 小時(shí)。Pst I限制性內(nèi)切酶和EcoR I限制性內(nèi)切酶雙酶切反應(yīng)總體系20 μ L包括:質(zhì)粒DNA4 μ L, 10Xbuffer2 μ L, Pst Il μ L，EcoR Il μ L，ddH2012 μ L。酶切反應(yīng)溫度:37°C保持3小時(shí)。質(zhì)粒R141酶切結(jié)果如圖2所示。3序列比對(duì)分析經(jīng)上海生工測(cè)序，序列pHs27總長(zhǎng)度938bp并將其提交至NCBIGeneBank利用BLASTn和BLASTx進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有相似序列，說(shuō)明該序列是華山新麥草特異重復(fù)序列。GenBank登錄號(hào)HR614226。RAI3D引物序列和SCAR引物序列分別如 SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示，見 pHs27 序列如 SEQ ID NO:1 所示。4Southren blotting檢驗(yàn)序列的特異性為進(jìn)一步驗(yàn)證序列pHs27的特異性，以序列pHs27為探針，Ns，ABD，A，AB, AG，AAG,
B,C，D, E, H, I, K, M, PPP，B' C'，AtG, R, S，SY, SYff, St, StPY，U, V, W, Y 基因組為模板進(jìn)行Southren blotting分析。結(jié)果顯示只有Ns基因組有明顯雜交信號(hào)，其它基因組材料未見信號(hào)。進(jìn)一步說(shuō)明pHs27是華山新麥草特異重復(fù)序列。Southren blotting操作步驟:37°C下用HindIII消化基因組DNA,消化產(chǎn)物用
0.8%瓊脂糖凝膠電泳，將瓊脂糖凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜(NC膜)或尼龍膜上形成固相DNA,利用Mix DIG-High Prime標(biāo)記探針,雜交,洗漆,加抗體,顯色觀察。Southren blotting 結(jié)`果如圖 3 所不。5SCAR引物設(shè)計(jì)、驗(yàn)證利用primer ν5.0和oligo ν6.0對(duì)序列pHs27設(shè)計(jì)引物,命名為RHS141。以Ns,ABD, A, AB, AG, AAG, B, C，D, E, H, I, K, M, PPP，B' C'，AtG, R, S，SY, SYff, St, StPY，U, V, W,Y基因組為模板擴(kuò)增。結(jié)果顯示只有華山新麥草擴(kuò)增到明顯的條帶，證明RHS141為華山新麥草基因組特異SCAR引物。PCR 反應(yīng)總體系 20 μ L 分另U 包括:10 X PCR Buf fer2 μ L, dNTPs2.5 μ mol/mil.6 μ L,引物 2.5 μ mol/ml2 μ L, Mg2+2.5mmol/mll.6 μ L,模板 DNA40_60ng/ μ L2.5 μ L,Taq 酶 5U/ μ L0.2 μ L, ddH2010.1 μ L。反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性4min,94°C變性lmin, 60°C退火lmin, 72°C延伸lmin,共計(jì)40個(gè)循環(huán)，最后72°C補(bǔ)平10min，4°C保存。RHS141驗(yàn)證各物種基因組結(jié)果如圖4所示。6應(yīng)用SCAR標(biāo)記RHS141驗(yàn)證華山新麥草附加系利用SCAR標(biāo)記RHS141，以華山新麥草全套附加系及未確定同源群關(guān)系的附加系為模板擴(kuò)增，結(jié)果顯示RHS141在華山新麥草本身、華山新麥草全套附加系及未確定同源群關(guān)系的附加系中都擴(kuò)增出了明顯的條帶，而在母本7182中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，成功證明該標(biāo)記可用于小麥背景中華山新麥草遺傳物質(zhì)的鑒定。PCR 反應(yīng)總體系 20 μ L 分別包括:10 X PCR Buffer 包括 Mg2+2 μ L, dNTPs2.5 μ mol/mil.6 μ L,引物 2.5 μ mol/ml2 μ L,模板 DNA40_60ng/ μ L2.5 μ L, Taq 酶 5U/ μ L0.2 μ L,ddH2011.7 μ L。反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性4min,94°C變性lmin, 60°C退火lmin, 72°C延伸lmin,共計(jì)40個(gè)循環(huán)，最后72°C補(bǔ)平10min，4°C保存。RHS141檢測(cè)華山新麥草附加系結(jié)果如圖5所示。以上所述，僅為本發(fā)明最佳實(shí)施方式，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。 ·
權(quán)利要求
1.一種小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法，包括以下步驟: 1)華山新麥草RAro特異序列篩選及特異片段回收 以華山新麥草和各種小麥近緣種屬基因組DNA為模板，利用RAPDlO堿基隨機(jī)引物共500條進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選華山新麥草特異多態(tài)性條帶并回收該條帶。
2)華山新麥草RAH)特異序列的克隆 根據(jù)T-A克隆法，將回收產(chǎn)物連接、克隆到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，測(cè)序。
3)序列比對(duì)分析 將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI GeneBank利用BLASTn和BLASTx進(jìn)行序列比對(duì)。
4)Southren blott ing檢驗(yàn)序列的特異性 為進(jìn)一步驗(yàn)證華山新麥草特異性序列，以該序列為探針，Ns, ABD, A，AB, AG，AAG, B，C，D，E，H，I，K，M，PPP，B' C'，AtG, R，S，SY, SYff, St, StPY, U，V, W, Y 基因組為模板進(jìn)行Southren blott ing 分析。
5)SCAR引物設(shè)計(jì)、驗(yàn)證 利用primer v5.0和oligo v6.0對(duì)華山新麥草特異性序列設(shè)計(jì)引物，以Ns, ABD, A,AB, AG, AAG, B, C，D, E, H, I, K, M, PPP，B' C'，AtG, R, S，SY, SYff, St, StPY，U, V, W, Y 基因組為模板擴(kuò)增驗(yàn)證SCAR引物的特異性。
6)SCAR標(biāo)記應(yīng)用 利用經(jīng)驗(yàn)證的SCAR標(biāo)記，以華山新麥草全套附加系及未確定同源群關(guān)系的附加系為模板擴(kuò)增，檢測(cè)該特異標(biāo)記的應(yīng)用效果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法，本發(fā)明利用RAPD引物進(jìn)行華山新麥草特異序列篩選；將特異條帶回收、克隆、測(cè)序、比對(duì)及Southern分析；通過(guò)引物設(shè)計(jì)，進(jìn)行華山新麥草SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化，并利用小麥近源種屬基因組對(duì)SCAR標(biāo)記進(jìn)行特異性檢測(cè)；最終用于鑒定小麥-華山新麥草全套異附加系及未確定同源群關(guān)系的異附加系中華山新麥草整條染色體。該方法為充分利用華山新麥草種質(zhì)資源，簡(jiǎn)化小麥基因組中華山新麥草外源物質(zhì)的鑒定方法，提高外源種質(zhì)資源的利用效率提供了可靠保障，本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)便易行，適合推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103243164SQ201310171848
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者武軍, 杜萬(wàn)里, 陳新宏, 趙繼新, 楊群慧, 劉淑會(huì), 王婧, 龐玉輝 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)