專利名稱：龜甲dna檢測(cè)試劑盒及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材鑒定技術(shù)，具體地說(shuō)是一種龜甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法。
背景技術(shù)：
龜甲為龜科動(dòng)物烏龜chinemysreevesii (Gray)的干燥腹甲及背甲。龜甲中含動(dòng)物膠、角蛋白、脂肪、骨膠原、氨基酸，及鈣、磷、鍶、鋅、銅等多種常量及微量元素，性平。有滋陰潛陽(yáng)，益腎強(qiáng)骨，養(yǎng)血補(bǔ)心之功效；用于陰虛潮熱，骨蒸盜汗，血虛偽黃，失眠健忘等癥。為常用貴重藥材。其藥材主產(chǎn)于湖北、安徽、湖南、江蘇、浙江等地。近年來(lái)，由于市場(chǎng)需求量大，貨緊價(jià)高等原因，一些產(chǎn)自東南亞國(guó)家的龜甲也通過(guò)這種渠道匯入我國(guó)，致使基源混亂的現(xiàn)象呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，直接影響到龜甲臨床用藥的安全、療效。因此，開展科學(xué)的中藥鑒定對(duì)于中藥的臨床及中藥現(xiàn)代化事業(yè)的發(fā)展具有重大的意義。傳統(tǒng)鑒定方法主要是性狀、顯微、理化鑒定等。性狀鑒定主要是形、色、氣、味、質(zhì)地等，該方法簡(jiǎn)便、快捷。顯微鑒別是通過(guò)顯微鏡觀察藥材組織、細(xì)胞及后含物等特征來(lái)區(qū)分各類中藥。對(duì)性狀相似多來(lái)源生藥及丸、散、片、丹等中成藥方劑的鑒定有獨(dú)到之處。對(duì)于有效成分或特征成分明確的中藥則可運(yùn)用理化鑒定的方法進(jìn)行，通過(guò)物理或化學(xué)方法對(duì)藥及其制劑中所含有的主要化學(xué)成分或特征成分進(jìn)行定性和定量分析，用以達(dá)到鑒定藥材真?zhèn)蔚哪康摹＝陙?lái)，在薄層色譜、高效液相色譜、紅外光譜、紫外光譜、氣相色譜、質(zhì)譜等方法廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)上，氣-質(zhì)聯(lián)用、各種色譜-光譜聯(lián)用技術(shù)也被用于中藥的理化鑒定。但是由于我國(guó)中藥材種類繁多，許多藥材的化學(xué)成分仍不明確，還有一些近緣物種的化學(xué)成分十分相似，這些藥材在進(jìn)行理化鑒定時(shí)仍有一定的局限性。分子遺傳標(biāo)記技術(shù)開始與中藥領(lǐng)域滲透，并快速融合、發(fā)展，其中DNA指紋圖譜在中藥材(除礦物藥外)的鑒定方面具有專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，從分子水平解決了以前中藥鑒定中宏觀鑒定水平上的不完善?，F(xiàn)代分子生物學(xué)在中藥的質(zhì)量控制領(lǐng)域逐步擴(kuò)大，方法逐漸完善，大大加快了中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。線粒體是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種細(xì)胞器，線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀的遺傳物質(zhì)，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于分離、拷貝數(shù)高、突變率高、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無(wú)組織特異性、高保守性等特點(diǎn)。其中細(xì)胞色素b (Cytochrome b, Cyt b)基因和細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 I (Cytochrome c oxidase subunitI，Cox I)基因存在于所有動(dòng)物中，進(jìn)化速度適中，較短的一個(gè)片段就能包含從種內(nèi)到種間信息，且其DNA序列很少存在插入和缺失，能夠保證足夠變異，是分析種內(nèi)和近緣種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)?shù)腄NA片段，可應(yīng)用于生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究。這兩個(gè)片段的基因可被作為動(dòng)物中物種鑒定標(biāo)記進(jìn)行研究，因此，以線粒體DNA分子特征為遺傳標(biāo)記的中藥鑒定更為準(zhǔn)確、可靠。我們依托吉林省科技廳(2008年I月立項(xiàng))和吉林省教育廳資助課題(2010年I月立項(xiàng)):《中藥DNA指紋檢測(cè)試劑盒的研究與開發(fā)》(2012年5月吉林省科技廳鑒定成果)，基于線粒體DNA建立動(dòng)物中藥 材的DNA指紋特征，成功開發(fā)出紹心、鹿鞭和鹿茸三種中藥材DNA鑒定試劑盒。課題組在發(fā)現(xiàn)貂心線粒體DNA的全部基因組前提下，利用貂心mtDNA獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用DNA擴(kuò)增技術(shù)及測(cè)序技術(shù)研究貂心線粒體DNA的基因組部分序列，設(shè)計(jì)的寡核苷酸片段可特異鑒定雞心、鴨心、鵝心和兔心，成功發(fā)明了一種簡(jiǎn)便、快速、特異的鑒定貂心專利技術(shù)(貂心DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法，發(fā)明專利:ZL200810051643.3 ;2011.4授權(quán))。相關(guān)成果發(fā)表在吉林大學(xué)學(xué)報(bào)《貂組織線粒體DNA及細(xì)胞色素b鑒定及特征》[2008,34(5):790-793]，中國(guó)藥學(xué)雜志《貂心線粒體mtDNA鑒定及特征分析》[2008,4(3):182-185]。時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥雜志《貂心與其偽品的脫氧核糖核酸指紋特征研究》2010年04期在此基礎(chǔ)上，課題組應(yīng)用分子生物學(xué)與中藥鑒定的相融合的理論對(duì)龜甲的鑒定技術(shù)進(jìn)行研究，主要應(yīng)用線粒體DNA的Cyt b高保守性及特異性對(duì)龜甲進(jìn)行鑒定。采用鹽析法方法從龜甲中提取線粒體DNA，利用Genbank中的相關(guān)信息，根據(jù)龜甲與其他相關(guān)動(dòng)物的線粒體DNA序列的差異,選取Cyt b基因序列,應(yīng)用primer premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)龜甲一對(duì)特異性引物，進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，此方法可從分子水平對(duì)龜甲鑒定提供依據(jù)。相關(guān)成果發(fā)表在中國(guó)藥學(xué)雜志《中藥材龜甲細(xì)胞色素b特異性鑒定研究》[2012，4(3):182-185]。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)對(duì)細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (Cytochrome c oxidase subunit
I,Cox I)基因序列對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物Cox I基因序列種內(nèi)變異很小，種間存在較多的變異位點(diǎn)，可以作為DNA標(biāo)記鑒別龜甲崔麗娜，杜鶴，孫佳明等:基于COI條形碼序列的龜甲及其混偽品的DNA分子鑒定[J].吉林中醫(yī)藥，2012年第02期；王川易，郭寶林，肖培根.中藥分子鑒定方法評(píng)述[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(3) =237-242.;劉中權(quán)，王義權(quán)，周開亞，等.中藥材龜甲及原·動(dòng)物的高特異性PCR鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34 (12):941-945.。但是，單獨(dú)選擇一個(gè)位點(diǎn)不能避免突變導(dǎo)致的變異。劉忠權(quán)等人利用位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)，配合測(cè)序技術(shù)鑒別龜甲及其同科動(dòng)物劉忠權(quán)，王義權(quán)，周開亞，等.中藥材龜甲及原動(dòng)物的高特異性PCR鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34 (12):941 945.;吳平，周開亞，徐珞珊，等.中藥材龜甲的分子鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998，33 (4) =304-309.;劉忠權(quán)，周材權(quán)，王義權(quán)，等.分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在中藥材鑒定中的應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2001，3 (5):26-28.。實(shí)驗(yàn)證明了龜甲一些基因位點(diǎn)可以通過(guò)特異性PCR和測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒別。本發(fā)明專利基于同時(shí)選擇兩個(gè)特異位點(diǎn)用于龜甲鑒別。從GenBank中下載正品龜甲源動(dòng)物烏龜(AY676201.1)及其常見偽品源動(dòng)物緬甸陸龜(DQ080043.1)，凹甲陸龜(EF661586.1)黃喉擬水龜(DQ453753.1)，三線閉殼龜(YP004062152.1)和黃額閉殼龜(YP003595317.1)Co I基因和Cyt b基因序列，進(jìn)過(guò)DNA Star7.0軟件比對(duì)后，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)龜甲特異性引物，采用高通量技術(shù)分析兩個(gè)基因具有鑒別序列片段作為鑒別點(diǎn)，再利用NCBI中的在線軟件Primer-BLAST對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)估。建立多重引物PCR(又稱復(fù)合PCR)反應(yīng)體系。多重PCR具有高效性特點(diǎn)，即在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種目的基因，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一個(gè)樣本就可檢測(cè)多種項(xiàng)目。由于龜甲型別較多，種間存在較多的變異位點(diǎn)，多重PCR可提高其檢出率并同時(shí)鑒定其型別及突變等。此外，多重PCR具有經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性特性，多種目的基因在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支。對(duì)中藥材鑒定具有節(jié)約樣本等優(yōu)勢(shì)，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本和提高效率的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)龜甲線粒體DNA基因組進(jìn)行篩選，利用Genbank中的相關(guān)信息，根據(jù)龜甲與其他相關(guān)動(dòng)物的線粒體DNA序列的差異，選取Cox I和Cyt b基因序列,應(yīng)用Primer premier5.0設(shè)計(jì)軟件,設(shè)計(jì)可有效地區(qū)分龜甲和偽品的特異性DNA序列，利用多重PCR技術(shù)在一個(gè)反應(yīng)體系中加入二對(duì)特異性引物，針對(duì)一個(gè)模板可擴(kuò)增二個(gè)具有差異的目的片段。提供一種能夠準(zhǔn)確鑒別龜甲和偽品特異性分子標(biāo)志，使用方便的龜甲和偽品多重PCR檢測(cè)試劑盒，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本和提高效率的特點(diǎn)，并提供其簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠的鑒定方法。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種鑒別龜甲和偽品多重PCR檢測(cè)試劑盒(體積自行決定)，其特征是，它包含:1.樣本前處理體系(I)樣本清洗液無(wú)菌去離子水。(2)脫鈣液 0.5mol/L ρΗ8.0EDTA。2.線粒體DNA提取體系(I)裂解液 15m mol/L Tris-HCl (ρΗ7.6)，15m mol/L Na2EDTA, 50m mol/L NaCl,2% SDS,20y g/mL 蛋白酶 K。(2)沉淀液飽和NaAC，異丙醇。

(3)洗滌液70%乙醇。3.PCR反應(yīng)體系(a)鑒定反應(yīng)體系總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM龜甲Cox I引物和Cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水；(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM龜甲Cox I引物和Cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，龜甲DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水；(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系總體系為IOOyL,含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM龜甲Cox I引物和Cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA中2 5 μ L,余為雙蒸懼水；4.結(jié)果觀察體系(I)觀察載體1.5瓊脂糖凝膠。(2)標(biāo)準(zhǔn)分子量100 2000bp的DNA Marker (其它種類不限定，必須包含IOObp和 400bp)。一種龜甲DNA鑒定方法，其特征是，它包含以下步驟:1.檢測(cè)樣本前處理每個(gè)樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48h 60h，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫鈣液。脫隹丐后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。2.線粒體DNA提取(I)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。(2)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻，6，000r/min4°C離心lOmin，吸取上清，棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置20 30min, 12, 000r/min4°C離心 20min,棄上清，留沉淀。(3)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀干燥，溶于滅菌雙蒸水中，-SO0C保存，作為檢測(cè)DNA模板。3.PCR引物設(shè)計(jì)與合成(I)設(shè)計(jì)龜甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，含有龜甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (Cox I)5' CTAATCTGATACATCATGC 3'5' CGATAATTGGCCAGATAAGTC 3'Primer2 (Cyt b)5' ACATGGACCATTACCAC 3'·
5' TCGGAGATTAATACCAGAGTA 3'(2)人工合成龜甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，委托上海生工或其它專業(yè)生物公司完成。4.建立PCR反應(yīng)(I)鑒定反應(yīng)總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，
0.1mM引物I和引物2各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水。(2)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM龜甲COX I引物和Cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，龜甲DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水。(3)陰性對(duì)照反應(yīng)總體系為100 μ L，含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，
0.1mM龜甲COX I引物和Cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA中2 5 μ L,余為雙蒸懼水。(4)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別龜甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各100 μ L加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:94°C 預(yù)變性 3-7min，94°C 30s，退火溫度 56 °C lmin_30s，72 °C lmin_30s，40 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 5-8min，4°C。5.結(jié)果判定產(chǎn)物用1.5-1.8 %瓊脂糖凝膠(市場(chǎng)有售)電泳，分子量100_2000bp的DNAMarker (標(biāo)準(zhǔn)分子量，市場(chǎng)有售)作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)(市場(chǎng)有售，可購(gòu)買)觀察和分析結(jié)果。同時(shí)出現(xiàn)IOObp和400bp條帶為正品龜甲，只出現(xiàn)一條或不出現(xiàn)均為偽品龜甲(圖1)。本發(fā)明的鑒別龜甲和偽品鑒定試劑盒是利用鑒別龜甲和偽品線粒體DNA與細(xì)胞色素b和c具有的種屬特異性位點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確同時(shí)區(qū)別鑒別龜甲和偽品的特異性；建立的多重PCR鑒定方法具有簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為龜甲DNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中:1.為標(biāo)準(zhǔn)分子量；2.為正品龜甲結(jié)果，表現(xiàn)出IOObp和400bp ；3.為陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果，表現(xiàn)出IOObp和400bp ；4.為陰性對(duì)照結(jié)果圖2實(shí)施例 一龜甲試劑盒檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中:M:為標(biāo)準(zhǔn)分子量；Control:為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)擴(kuò)增出IOObp和400bp ；1.為正品龜甲結(jié)果，表現(xiàn)出IOObp和400bp ；2為凹甲陸龜龜甲；3為黃額閉殼龜龜甲；4為馬來(lái)閉殼龜龜甲；5.為陰性對(duì)照。圖3實(shí)施例二對(duì)市售鱉甲藥材進(jìn)行鑒定結(jié)果示意圖。其中:1.為標(biāo)準(zhǔn)分子量；2.為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增出IOObp和400bp ；3.為正品龜甲結(jié)果，擴(kuò)增出IOObp和400bp ；4-9:市售樣品；10.鱉甲樣品；11:為陰性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，下面實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例一1.檢測(cè)樣本前處理檢測(cè)樣品(四種，I為龜甲正品，2為凹甲陸龜龜甲；3為黃額閉殼龜龜甲；4為馬來(lái)閉殼龜龜甲，均為偽品，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供并鑒定)，每份取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48hh，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫I丐液。脫I丐后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。2.線粒體DNA提取(I)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。(2)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻，6，000r/min4°C離心IOmin,吸取上清,棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置30min,12，000r/min4°C離心20min,棄上清，留沉淀。(3)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀干燥，溶于滅菌雙蒸水中，-SO0C保存，作為檢測(cè)DNA模板。3.PCR引物設(shè)計(jì)與合成(I)設(shè)計(jì)龜甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，含有龜甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (Cox I)5' CTAATCTGATACATCATGC 3'5' CGATAATTGGCCAGATAAGTC 3'Primer2 (Cyt b)5' ACATGGACCATTACCAC 3'5' TCGGAGATTAATACCAGAGTA 3'(2)人工合成龜甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成儀。(委托上海生工完成)4.建立PCR反應(yīng)(a)鑒定反應(yīng)總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 μ L，0.1mM引物I和引物2各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，待測(cè)樣品DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 μ L,
0.1mM龜甲COX I引物和Cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，龜甲DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。

(C)陰性對(duì)照反應(yīng)總體系為100 μ L，含有緩沖液10 μ L, 12.5mM dNTP4y L,0.1mM龜甲COX I引物和Cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，偽品DNA中2 μ L，余為雙蒸餾水。(4)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別龜甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各100 μ L加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:94°C預(yù)變性 3-7min，94°C 30s，退火溫度 56°C 30s，72°C lmin，40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min, 4°C。5.結(jié)果判定PCR產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳，標(biāo)準(zhǔn)分子量100_2000bp的DNA Marker作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果(圖2)。實(shí)施例二對(duì)市售龜甲藥材進(jìn)行鑒定1.材料:市售龜甲樣品6種(標(biāo)號(hào)4-9)。鱉甲樣品I種(標(biāo)號(hào)10)，龜甲正品I種(均由吉林市藥品檢定所提供并鑒定)。2.方法2.1檢測(cè)樣本前處理每份檢測(cè)樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比1: 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48hh，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫韓液。脫韓后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。 2.2線粒體DNA提取(I)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。(2)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻，6，000r/min4°C離心IOmin,吸取上清,棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置30min,12，000r/min4°C離心20min,棄上清，留沉淀。(3)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀干燥，溶于滅菌雙蒸水中，-SO0C保存，作為檢測(cè)DNA模板。2.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成(I)設(shè)計(jì)龜甲線粒體DNA 二對(duì)特異寡核苷酸引物，含有龜甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (Cox I)5' CTAATCTGATACATCATGC 3'5' CGATAATTGGCCAGATAAGTC 3'Primer2 (Cyt b)5' ACATGGACCATTACCAC 3'5' TCGGAGATTAATACCAGAGTA 3'(2)人工合·成龜甲線粒體DNA二對(duì)特異寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成儀(委托上海生工完成)。2.4建立PCR反應(yīng)(a)鑒定反應(yīng)總體系為100 μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 μ L，0.1mM引物I和引物2各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，待測(cè)樣品DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mM dNTP4 μ L,0.1mM龜甲COX I引物和Cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，龜甲DNA2 μ L，余為雙蒸餾水。(C)陰性對(duì)照反應(yīng)總體系為100 μ L，含有緩沖液10 μ L, 12.5mM dNTP4y L,0.1mM龜甲COX I引物和Cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，偽品DNA中2 μ L，余為雙蒸餾水。(4)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序分別將鑒別龜甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各100 μ L加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行:94°C預(yù)變性 5min，94°C 30s，退火溫度 56°C 30s, 72°C lmin，40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min, 4°C。3.結(jié)果判定PCR產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳，標(biāo)準(zhǔn)分子量100_2000bp的DNA Marker作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種龜甲DNA檢測(cè)試劑盒，其特征是，它包含樣本前處理液及脫鈣液、線粒體DNA提取體系、PCR反應(yīng)體系、結(jié)果觀察體系。
(1)樣本前處理液及脫鈣液 (a)前處理液去離子水。(b)脫鈣液0.5mol/L ρΗ8· OEDTA0 (2)線粒體DNA提取體系(a)裂解液10mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· O)，IOm mol/L EDTA(ρΗ8· 0)，100m mol/L NaCl，2% SDS,40y g/ml 蛋白酶 K，0. 039mol/L DTT。
(b)沉淀液飽和NaAC。
(c)洗滌液70%乙醇。
(3)PCR反應(yīng)體系 (a)鑒定反應(yīng)體系總體系為100μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12. 5mM dNTP4 10 μ L，0.ImM龜甲COX I引物和cyt b引物各I. 5 4. O μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水； (b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mMdNTP4 10μ L,0. ImM龜甲COX I引物和cyt b引物各I. 5 4. O μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中華龜龜甲DNA2 5μ L，余為雙蒸餾水； (c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系總體系為100μ L，含有緩沖液10 μ L，12. 5mM dNTP4 10 μ L，0.ImM龜甲COX I引物和cyt b引物各I. 5 4. O μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA中2 5 μ L,余為雙蒸懼水； (4)結(jié)果觀察體系 (a)瓊脂糖凝膠1·5%瓊脂糖。
(b)標(biāo)準(zhǔn)分子量100 2000bp的DNAMarker (可以選用其它種類的標(biāo)準(zhǔn)分子量，要求最大的不能超過(guò)2000bp，要顯示出IOObp和400bp)。
2.龜甲DNA鑒定方法，其特征是，它包含檢測(cè)樣本前處理、線粒體DNA提取、PCR引物設(shè)計(jì)與合成、建立PCR反應(yīng)、結(jié)果判定五個(gè)步驟。
(1)檢測(cè)樣本前處理 每個(gè)樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質(zhì)量體積比I : 20加入相應(yīng)體積脫鈣液，56°C水浴48h 60h，轉(zhuǎn)速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫鈣液。脫隹丐后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。
(2)線粒體DNA提取 (a)樣本裂解向經(jīng)過(guò)前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)速 100r/min。
(b)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻,6，000r/min4°C離心lOmin，吸取上清，棄沉淀。向上清中加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，低溫放置20 30min, 12, 000r/min4°C離心 20min,棄上清，留沉淀。
(c)洗滌使用洗滌液洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀干燥，溶于滅菌雙蒸水中，-80°C保存，作為檢測(cè)DNA模板。(3)PCR引物設(shè)計(jì)與合成 (a)設(shè)計(jì)龜甲線粒體DNA二對(duì)特異寡核苷酸引物,含有龜甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl(COX I) .5' ATACATCCGATACAACAGC 3' .5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2(cyt b) .5' ATCATCCGATCAATAACAG 3' .5' AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3' (b)人工合成龜甲線粒體DNA二對(duì)特異寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成儀。(委托上海生工完成) (4)建立PCR反應(yīng) (a)鑒定反應(yīng):總體系為100μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM弓丨物I和引物2各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測(cè)樣品DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水。
(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng):總體系為100μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，.0.1mM龜甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中華龜龜甲DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水。
(c)陰性對(duì)照反應(yīng):總體系為100μ L，含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM龜甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA中2 5 μ L,余為雙蒸懼水。
(d)設(shè)計(jì)反應(yīng)程序 分別將鑒別龜甲和偽品PCR檢測(cè)試劑盒的(a)鑒定反應(yīng)體系、(b)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系和(c)陰性對(duì)照反應(yīng)體系的總體系各100 μ L加入反應(yīng)管中，置于PCR反應(yīng)儀(市場(chǎng)有售，任意型號(hào))中按下列程序進(jìn)行: .94°C 預(yù)變性 3-7min，94°C 30s，退火溫度 56 °C 30s, 72 °C lmin，40 個(gè)循環(huán)，72 °C 延伸.5_8min,4°C。
(5)結(jié)果判定 產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠電泳，分子量100-2000bp的DNA Marker (標(biāo)準(zhǔn)分子量，市場(chǎng)有售)作參照，凝膠成像分析系統(tǒng)(市場(chǎng)有售，可購(gòu)買)觀察和分析結(jié)果。同時(shí)出現(xiàn)IOObp和.400bp條帶為正品龜甲，只出現(xiàn)一條或不出現(xiàn)均為偽品龜甲。
3.如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的一種龜甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法，其特征是，所述龜甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法為烏龜?shù)母稍锔辜准氨臣住?br> 4.如權(quán)利要求2所述的龜甲DNA檢測(cè)試劑盒的鑒定方法，其特征是，結(jié)果鑒定是利用比較樣品PCR擴(kuò)增片段DNA大小與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量的相同，根據(jù)出現(xiàn)判定標(biāo)準(zhǔn)完全一致對(duì)龜甲樣品進(jìn)行真?zhèn)舞b定。
5.一種權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的一種龜甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法，可應(yīng)用于龜甲樣品的真?zhèn)舞b定。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種龜甲DNA檢測(cè)試劑盒及鑒定方法。一種龜甲DNA檢測(cè)試劑盒包括樣本前處理液及脫鈣液，線粒體DNA提取體系，PCR反應(yīng)體系，結(jié)果觀察體系四部分組成。一種龜甲DNA鑒定方法，包括檢測(cè)樣本前處理，線粒體DNA提取，PCR引物設(shè)計(jì)與合成，建立PCR反應(yīng)，結(jié)果判定五步。判斷標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)出現(xiàn)100bp和400bp條帶為正品龜甲，只出現(xiàn)一條或不出現(xiàn)均為偽品龜甲本發(fā)明建立的多重PCR鑒定方法具有簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確同時(shí)區(qū)別鑒別龜甲和偽品的特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255220SQ20131017885
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月4日
發(fā)明者李明成, 苑廣信, 張麗華, 夏薇, 王冰梅, 傅桂蓮 申請(qǐng)人:吉林市雷博科技有限公司