基于顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測人感染甲型h7n9流感病毒基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，流感檢測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，哨點(diǎn)醫(yī)院等用于對發(fā)熱病人咽拭子等標(biāo)本的人甲型H7N9流感病毒HA基因和NA基因的檢測和監(jiān)測。具體是應(yīng)用基于顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，通過計(jì)算機(jī)軟件分析人甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)出六條引物完全與識別基因靶序列中八個結(jié)合區(qū)匹配，并于反應(yīng)前加入HNB(羥基萘酚藍(lán))染料，只需一步就可完成在63℃等溫環(huán)境中擴(kuò)增1.5小時，最后用肉眼觀察顏色變化和管底的白色沉淀判定檢測結(jié)果，與傳統(tǒng)的RT-PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢。
【專利說明】基于顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測人感染甲型 H7N9流感病毒基因 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是用基于HNB顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測人感染甲型H7N9流 感病毒的H7基因和N9基因。用于各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，流感檢測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，哨點(diǎn)醫(yī)院 對人感染甲型H7N9流感病毒的檢測和監(jiān)測。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] H7N9流感病毒是一種新型的重組甲型流感病毒，其基因是來自于東亞地區(qū)野鳥和 中國上海、浙江、江蘇雞群的基因重配型。該病毒之前僅發(fā)現(xiàn)于鳥禽間，但是2013年3月底 在上海和安徽兩地全球首次報(bào)道了人感染H7N9流感病毒病例。這種病毒的傳播途徑主要 經(jīng)呼吸道傳播，也可通過接觸帶病毒禽類分泌物或排泄物等被感染，直接接觸病毒也可被 感染，但是目前還尚無人與人之間傳播的確切證據(jù)。易感人群以與禽類養(yǎng)殖、銷售、宰殺、力口 工以及在發(fā)病前1周內(nèi)接觸過禽類的成年人為主。截止2013年5月6日，全國（含臺灣?。?已確診甲型H7N9流感130例，31人死亡，42人痊愈。病例分布于北京、上海、江蘇、浙江、安 徽、山東、河南、臺灣、福建等地。鑒于我國甲型H7N9流感疫情不斷擴(kuò)大的局面，為有效阻止 疫情的更大范圍傳播和疫情及時應(yīng)急處置，根據(jù)衛(wèi)生部應(yīng)對甲型H7N9流感疫情防控要求， 我國已決定在各地增加病毒檢測實(shí)驗(yàn)室和哨點(diǎn)醫(yī)院，擴(kuò)大監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的覆蓋范圍。將網(wǎng)絡(luò)實(shí) 驗(yàn)室擴(kuò)大到整個地市一級，目標(biāo)是使全國300多個地市都具備能夠進(jìn)行病毒檢測的能力， 及早發(fā)現(xiàn)和確診甲型H7N9病例，尤其嚴(yán)密監(jiān)測其人傳人流行性調(diào)查，切實(shí)有效地做到早發(fā) 現(xiàn)、早報(bào)告、早處置。本專利成功建立的基于顏色的RT-LAMP檢測人甲型H7N9流感病毒基 因方法，將為提高我國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室和哨點(diǎn)醫(yī)院的監(jiān)測能力，實(shí)現(xiàn)對發(fā)熱病人的快 速篩查提供了有力的技術(shù)保障。
[0004] 與傳統(tǒng)基因分子診斷方法相比，基于顏色的RT-LAMP技術(shù)在RNA病毒檢測方面有 著無法比擬的優(yōu)勢，尤其在可操作性和設(shè)備要求方面。這種優(yōu)勢的存在主要是因?yàn)镽T-LAMP 技術(shù)如下幾個方面的特點(diǎn)：第一，檢測時間短靈敏度高。整個檢測時間可縮短至1?1. 5小 時內(nèi)，靈敏度可與實(shí)時熒光定量PCR媲美。第二，特異性高。所設(shè)計(jì)的六條特異性引物，只 在其與識別靶序列中八個結(jié)合區(qū)完全匹配的情況下擴(kuò)增才能順利進(jìn)行，因此這很大程度上 減少了非特異性擴(kuò)增反應(yīng)的可能，從而使檢測特異性更為可靠。第三，設(shè)備要求簡單。擴(kuò)增 反應(yīng)在60?65°C恒溫條件下進(jìn)行，無核酸變復(fù)性過程，除了應(yīng)用一些常用聚合酶外，對硬 件設(shè)備基本無特殊要求，普通級別下的生物實(shí)驗(yàn)室即可完成檢測和結(jié)果判斷。第四，污染機(jī) 會低。在實(shí)施過程中只需一步就可完成實(shí)驗(yàn)操作，減少了污染機(jī)會并方便了實(shí)驗(yàn)過程中的 質(zhì)控工作。同時，該技術(shù)于反應(yīng)前加入顯色染料，避免了常規(guī)RT-LAMP的后續(xù)開蓋行為，有 效地防止了氣溶膠污染。第五，結(jié)果可視化。RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)過程中可產(chǎn)生大量副產(chǎn)物焦 磷酸鎂白色沉淀，或在擴(kuò)增前加入一定量羥基萘酚藍(lán)（HNB)，使得陽性反應(yīng)管中出現(xiàn)可視的 白色混濁物或反應(yīng)管內(nèi)顏色變化，從而實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的直接可視化判定。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 1.本發(fā)明是對目前對RNA病毒檢測技術(shù)手段的改進(jìn)和補(bǔ)充，它具有安全、特異、靈 敏、便捷的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，檢測時間短靈敏度高。整個檢測時間 可縮短至1?1.5小時內(nèi)，靈敏度可與實(shí)時熒光定量PCR媲美。其次，特異性高。所設(shè)計(jì) 的六條特異性引物，只在其與識別靶序列中八個結(jié)合區(qū)完全匹配的情況下擴(kuò)增才能順利進(jìn) 行。然后，所有的擴(kuò)增過程都可在63°C等溫下完成，無需PCR儀，降低了對實(shí)驗(yàn)硬件的要求。 最后，污染機(jī)會低和結(jié)果可視化。。
[0006] 2.選擇人感染甲型H7N9流感HA基因 （GISAID :EPI439507)的288?483位和NA 基因 （GISAID :EPI439509)的151?352位的相對保守區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)的RT-LAMP引物，針對每 個基因分別包括兩條外引物（F3、B3)和兩條內(nèi)引物（FIP、BIP)，兩條環(huán)結(jié)合引物（Loopl、 Loop2)。所有引物的具體序列見表1和表2。
[0007] 表1 :RT-LAMP檢測人感染甲型H7N9流感H7基因的引物序列
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于人感染甲型H7N9流感病毒HA基因和ΝΑ基因檢測的基于HNB (羥基萘酚 藍(lán)）顏色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP)，其中包括：用于人感染H7N9流感病毒 H7基因檢測的6條寡核苷酸引物、N9基因檢測的6條寡核苷酸引物和HNB (羥基萘酚藍(lán)） 染料。
2. 權(quán)力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒檢測的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (RT-LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每種序列的互補(bǔ)序列或變體。
3. 權(quán)力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒檢測的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (RT-LAMP)包括人感染甲型H7N9流感病毒及其變異株。
4. 權(quán)力要求3所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，流感檢測網(wǎng)絡(luò)實(shí) 驗(yàn)室，哨點(diǎn)醫(yī)院用于人感染甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因的檢測和監(jiān)測。
5. 權(quán)力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因檢測的基于HNB顏 色的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP)的反應(yīng)程序和檢測程序。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152577SQ201310178859
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月15日
【發(fā)明者】馬學(xué)軍, 舒躍龍, 聶凱, 王大燕, 丁雄 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所