一種干擾Survivin基因表達(dá)的siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種干擾Survivin基因表達(dá)的siRNA分子及其應(yīng)用，所述siRNA分子包括正義鏈和反義鏈，其中正義鏈的核苷酸序列為5′-CGUCAUCUGGCUCCCAGCCUUCCX-3′，反義鏈的核苷酸序列為5′-GGAAGGCUGGGAGCCAGAUGACGX-3′，上述X代表tt、TT或UU，t代表脫氧胸腺嘧啶。其中，反義鏈可特異性地與Survivin基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞分裂、降低腫瘤的細(xì)胞的耐藥性、抑制腫瘤血管的生成，達(dá)到抑制腫瘤的目的。本發(fā)明所述的siRNA采用人工化學(xué)合成方法制備，可以用作抗腫瘤的藥物。
【專利說明】—種干擾Survivin基因表達(dá)的s iRNA分子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可干擾凋亡抑制因子survivin基因的小分子干擾RNA(SiRNA),及其抗腫瘤的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是當(dāng)前威脅人類生命健康的主要?dú)⑹种?，盡管各種的治療方法不斷出現(xiàn)，但目前還沒有找到真正有效的根治方法，腫瘤的治療一直是長期困擾醫(yī)學(xué)界的世界性難題。逃避凋亡是所有腫瘤的特征，它使得腫瘤細(xì)胞在異常生長刺激下存活，并抵抗化療和放療。抗凋亡蛋白通過與凋亡信號(hào)作用成為新的最有潛能的治療靶標(biāo)來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
[0003]凋亡抑制基因survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的一種重要的腫瘤相關(guān)基因，該基因是在人類基因組文庫中篩選克隆到的，它定位于17q25，全長15KB，含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，基因編碼產(chǎn)物為由142個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子量16.2KD,具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的雙重功能，是聯(lián)系細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡界面的重要因子。該基因具有兩個(gè)突出的特點(diǎn):(I)幾乎在所有種類的腫瘤組織中特異性地表達(dá)，而正常組織幾乎沒有表達(dá)；
(2)具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)有絲分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、參與血管形成和放化療耐受多種功能于一體，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子。Survivin功能復(fù)雜，具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且參與細(xì)胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生等作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Survivin基因在胚胎組織及惡性腫瘤中普遍表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、腎癌、黑色素癌、腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞癌和卵巢癌等；但在分化成熟的組織(除胎盤、增殖期子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi)膜有微量表達(dá)外)及癌旁正常組織中無表達(dá)。它的這一特性，使得Survivin成為免疫治療、基因治療和小分子抗腫瘤藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)。
[0004]RNA干擾(RNA interference,縮寫為RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA(double-strtlnded RNA, dsRNA)誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，其原理是:以RNase III核酶家族的Dicer，與雙鏈RNA結(jié)合，將其剪切成21_23nt及3’端突出的小干擾RNA (small interfering RNA, si RNA)，隨后siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合在靶mRNA上并將其切斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。
[0005] RNAi技術(shù)是上世紀(jì)末到本世紀(jì)初發(fā)展的一項(xiàng)嶄新技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為疾病治療尤其是癌癥的治療開辟了全新的途徑，為科研工作者提供了一個(gè)全新的基因治療理念。用siRNA干擾特定基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。應(yīng)用RNA干擾技術(shù),用祀向至Survivin基因的siRNA作為祀向藥物,在基因的轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行干擾，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)的血管形成和降低腫瘤細(xì)胞放化療的耐受性，對(duì)腫瘤進(jìn)行抑制，在不久的將來可能成為一種新的腫瘤治療方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，本發(fā)明公開了一種通過siRNA分子庫技術(shù)篩選出的高效祀向Survivin基因的雙鏈siRNA分子,其由下述正義鏈和反義鏈組成:
[0007]正義鏈5' -CGUCAUCUGGCUCCCAGCC UUCCX-3'，(SEQ ID NO:1)
[0008]反義鏈5' -GGAAGGCUGGGAGCCAGAU GACGX-3'，(SEQ ID NO:2)其中 X 代表 tt、TT或uu，t代表脫氧胸腺嘧啶。
[0009]換句話說，該雙鏈siRNA分子的主干序列為
[0010]正義鏈:5'-CGUCAUCUGGCUCCCAGCCUUCC-3'
[0011]反義鏈:5'-GGAAGGCUGGGAGCCAGAUGACG-3'，
[0012]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述序列中3'端的“X”是兩個(gè)脫氧胸腺嘧啶dTdT。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0014]體外實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與Survivin基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞分裂、抑制腫瘤血管的生成，達(dá)到治療腫瘤的目的。本發(fā)明所述的siRNA采用人工化學(xué)合成方法制備，可以用作抗腫瘤的藥物。
[0015]為方便起見，在下文中，術(shù)語“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互換，它們表不的意思和范圍相同。
[0016]其中，siRNA序列可以是單鏈結(jié)構(gòu)，也可以是雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0017]本發(fā)明的siRNA分子來源于針對(duì)Survivin基因開放閱讀框的功能保守區(qū)而制備的siRNA分子庫。
[0018]siRNA的制備可采用多種方法，比如:化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長鏈dsRNA、載體表達(dá)siRNA、PCR合成siRNA表達(dá)元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。
[0019]本發(fā)明的SiRNA分子可以作為抗腫瘤藥物的有效成分。腫瘤疾病包括肝癌、肺癌、白血病、胃癌、宮頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚鱗癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤。
[0020]出于應(yīng)用目的，可將siRNA分子、表達(dá)siRNA分子的DNA表達(dá)框、或者包含siRNA分子表達(dá)框的質(zhì)粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如腫瘤組織。表達(dá)所述siRNA的質(zhì)粒還可以用于制備沉默Survivin基因的試劑盒。
[0021]本發(fā)明還公開了一種沉默細(xì)胞Survivin基因的方法，具體包括以下步驟:
[0022]I)將細(xì)胞按IXlO4/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)；
[0023]2)用Opt1-MEM分別稀釋RNA分子和Lipofectamine RNAiMAX,將兩者混合，室溫下孵育10-20分鐘。
[0024]3)將第2)步所得的混合物加入第I)步培養(yǎng)細(xì)胞中，在37°C孵育24_48小時(shí)。
[0025]本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。比如，對(duì)于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。
[0026]任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞后實(shí)時(shí)定量PCR檢測Survivin mRNA表達(dá)量柱形圖，縱坐標(biāo)表示Survivin相對(duì)于GAPDH的mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示四個(gè)處理實(shí)驗(yàn)組，其中s-siRNA-Ι為本發(fā)明的siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組。
[0028]

【具體實(shí)施方式】
[0029]下述實(shí)施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0030]實(shí)施例1:化學(xué)合成siRNA驗(yàn)證Survivin沉默效果
[0031]1.主要儀器、試劑和材料.
[0032]1.1儀器:核酸合成儀(GE公司)、PCR儀(ABI公司);實(shí)時(shí)定量PCR儀(B1-Rad)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)等。
[0033]1.2 材料和試劑:RNAiMAX?(invitrogen), DMEM 培養(yǎng)基(Gibco), TurboCapturemRNA kit (QIAGEN), SensiMix? one-Step Kit (Quantace)等。其他生化試劑均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
[0034]1.3PCR引物(百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成):
[0035]Survivin 正向引物:5' -AGAACTGGCCCTTCTTGGAGG-3'
[0036]Survivin 反向引物:5' -CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3'
[0037]GAPDH 正向引物；5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'
[0038]GAPDH 反向引物:5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'
[0039]2.化學(xué)合成制siRNA
[0040]根據(jù)survivin基因的核苷酸序列,設(shè)計(jì)小分子干擾s_siRNA_l:
[0041 ]正義鏈:5' -CGUCAUCUGGCUCCCAGCCUUCC dTdT-3'
[0042]反義鏈:5'-GGAAGGCUGGGAGCCAGAUGACG dTdT-3'
[0043]將該序列在人類EST數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，確定沒有與它相同的其它基因序列。siRNA的合成利用百奧邁科生物技術(shù)有限公司擁有的核酸合成儀(美國GE公司)。同時(shí)也合成了文獻(xiàn)(J Controlled release，146 (2010) 378-387 和 MolecularPharm，3 (5) 579-588)中報(bào)道的兩種常用survivin siRNA作為正對(duì)照組,序列分別為:
[0044]s-siRNA-2:
[0045]正義鏈:5’-GGA CCA CCG CAU CUC UACA dTdT-3’ (SEQ ID NO:3)
[0046]反義鏈:5，-UGUAGA GAU GCG GUG ⑶CC dTdT-3’ (SEQ ID NO:4)
[0047]s-siRNA-3:
[0048]正義鏈:5，-GGCUGG CUU CAU CCA CUGC dTdT-3’ (SEQ ID NO:5)
[0049]反義鏈:5，-GCAGUG GAU GAA GCC AGCC dTdT-3’ (SEQ ID NO:6)
[0050]3.沉默效率驗(yàn)證
[0051]3.1細(xì)胞培養(yǎng):癌細(xì)胞U20S和A549在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0052]3.2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞按IXlO4/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照RNAiMAX?的說明書轉(zhuǎn)染，s-siRNA-Ι按50nM/孔加入。同時(shí)用轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX?將兩個(gè)正對(duì)照s-siRNA-2、s-siRNA-3 以及負(fù)對(duì)照 siRNA 轉(zhuǎn)入 U20S 與 A549 細(xì)胞。
[0053]3.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測Survivin基因mRNA水平:用mRNA提取純化試劑盒TurboCapture mRNA kit提取純化細(xì)胞RNA,操作按試劑盒說明書進(jìn)行,用80 μ L無RNase水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。
[0054]用基因特異性引物檢測樣本中Survivin mRNA表達(dá)水平，同時(shí)擴(kuò)增看家基因GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行。建立如下25 μ L反應(yīng)體系:4 μ L模板RNA，12.5 μ L2X SensiMix one-step, I μ L5 ;正向引物(6 μ Μ)，0.5 μ L50X SYBR Green I，用無RNase水補(bǔ)足體系至25 μ L。反應(yīng)條件:40°C反轉(zhuǎn)錄30min，95°C預(yù)變性7min，95°C變性20sec，6(TC退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環(huán) 45 次。
[0055]3.4結(jié)果分析:用實(shí)時(shí)定量PCR2_" "et法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖1所示，結(jié)果顯示祀向至Survivin基因的s_siRNA_l~3的沉默效果，本發(fā)明的設(shè)計(jì)的s-siRNA-Ι的沉默效果要明顯優(yōu)于文獻(xiàn)中報(bào)道的s-siRNA-2和s-siRNA-3。
[0056]實(shí)施例2 =Survivn基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響
[0057]1.材料及儀器
[0058]肺癌細(xì)胞A549 、骨肉瘤細(xì)胞U20S、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、MTT、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀。
[0059]2、方法
[0060]2.1細(xì)胞培養(yǎng):肺癌細(xì)胞A549、骨肉瘤細(xì)胞U20和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0061]2.2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞按IXlO4/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照RNAiMAX?的說明書轉(zhuǎn)染，s-siRNA-Ι按50nM/孔加入。
[0062]2.348小時(shí)后觀察細(xì)胞時(shí)相和細(xì)胞增殖情況。
[0063]3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0064]結(jié)果顯示:本發(fā)明設(shè)計(jì)的祀向survivin基因的s_siRNA_l作用后的腫瘤細(xì)胞株肺癌A549、骨肉瘤U20S、乳腺癌MDA-MB-231分裂明顯減少、細(xì)胞的生長也受到明顯抑制，小分子干擾RNA在20nM至10nM對(duì)，作用48小時(shí)后，MTT法檢測的對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率結(jié)果，見表1.
[0065]表ls-siRNA-Ι作用于腫瘤細(xì)胞48小時(shí)的抑制率
[0066]
__20nM_50nM_10nM
A549 (%) 51.4±1.2 61.8± 0.7 73.7 ±2.5 U20S (%) 22.7±1.8 39.2±3.2 41.5土0.9 ΜΡΑ-ΜΒ-231(%)25.8±3.1_34.3±1.8_48.3±1.7
[0067]由于細(xì)胞株Α549、細(xì)胞株U20和細(xì)胞株MDA-MB-231分別為肺癌細(xì)胞株、骨肉瘤細(xì)胞株和乳腺癌細(xì)胞株，所以本發(fā)明所述的s-siRNA-Ι可以用于肺癌、骨肉瘤和乳腺癌的治療。
【權(quán)利要求】
1.一種雙鏈SiRNA分子，其特征是由下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成: 正義鏈 5' -CGUCAUCUGGCUCCCAGCC UUCCX-3'， 反義鏈 5' -GGAAGGCUGGGAGCCAGAU GACGX-3'，其中 X 代表 tt、TT 或 UU，t 代表脫氧胸腺嘧啶。
2.—種siRNA表達(dá)質(zhì)粒,其特征在于,所述質(zhì)粒包含權(quán)利要求1所述的雙鏈siRNA分子的脫氧核糖核酸序列。
3.一種Survivin基因沉默試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求權(quán)利要求1所述的雙鏈siRNA分子，或者包含權(quán)利要求2所述的siRNA表達(dá)質(zhì)粒。
4.一種沉默細(xì)胞Survivin基因表達(dá)的方法,包括以下步驟: 1)將細(xì)胞按IX 14/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。 2)用Opt1-ΜΕΜ分別稀釋權(quán)利要求1所述的siRNA分子和LipofectamineRNAiMAX,將兩者混合，室溫下孵育10-20分鐘。 3)將第2)步所得的混合物加入第I)步培養(yǎng)細(xì)胞中，在37°C孵育24-48小時(shí)。
5.權(quán)利要求1所述的siRNA分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為肝癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、白血病、皮膚鱗癌、胃癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤、骨肉瘤、黑色素瘤中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104164434SQ201310180793
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月16日
【發(fā)明者】王天有, 余波, 唐鎖勤, 周晨光, 李劍光 申請(qǐng)人:首都兒科研究所, 杭州普施康生物科技有限公司, 中國人民解放軍總醫(yī)院