用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生hpv33l1蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法。具體地，本發(fā)明公開了產(chǎn)生表達(dá)HPV33L1蛋白的重組漢遜酵母細(xì)胞的方法以及由所述方法產(chǎn)生的重組漢遜酵母細(xì)胞。本發(fā)明還公開了利用所述重組漢遜酵母細(xì)胞產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法以及所產(chǎn)生的HPV33L1蛋白在制備預(yù)防性疫苗中的用途。
【專利說明】用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法，尤其涉及用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一種無包膜的閉環(huán)雙鏈DNA病毒，屬乳多空病毒科多瘤病毒亞科，主要侵犯人體的上皮黏膜組織，進(jìn)而誘發(fā)各種良性及惡性增生病變。
[0003]目前已鑒定出來的不同亞型HPV超過200種，HPV感染具有明顯的組織特異性，不同型別的HPV對(duì)于皮膚和黏膜的嗜向性不同，能誘發(fā)不同的乳頭狀病變，大約有30多種HPV型別與生殖道感染有關(guān)，其中有20多種與腫瘤相關(guān)。根據(jù)HPV誘發(fā)病變的良惡性不同，HPV可大致分為兩類:1)高危型(如 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等):高危型HPV與人類多種組織惡性腫瘤密切相關(guān)，主要引起重度不典型增生和浸潤(rùn)癌；2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等):低危型HPV可引起表皮細(xì)胞良性增殖性性病，如尖銳濕疣和扁平濕撫等。
[0004]HPV主要由病毒外殼和基因組DNA構(gòu)成。基因組長(zhǎng)約7900bp，有8個(gè)病毒蛋白編碼基因。其中6個(gè)ORF編碼的蛋白在病毒復(fù)制的早期表達(dá)，稱為早期蛋白；2個(gè)ORF編碼的蛋白在病毒復(fù)制的晚期表達(dá)，稱為晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外殼蛋白LI及次要外殼蛋白L2,并參與病毒外殼的形成。
[0005]HPV病毒外殼蛋白能夠進(jìn)行自組裝，在多種表達(dá)系統(tǒng)中單獨(dú)表達(dá)的LI蛋白或?qū)I蛋白與L2蛋白共表達(dá)時(shí)均能自組裝成病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP),其中以在酵母系統(tǒng)、桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等產(chǎn)生的VLP更接近天然病毒的結(jié)構(gòu)。利用外源表達(dá)體系生產(chǎn)的VLP免疫后能夠在體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生中和抗體，獲得良好的免疫保護(hù)效果。
[0006]多形漢遜酵母(Hansenula Polymorpha),又稱作Pichia augusta,是當(dāng)前公認(rèn)的最為理想的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。多形漢遜酵母作為單細(xì)胞真核微生物，既具備原核生物生長(zhǎng)快速、易于遺傳操作等特點(diǎn)，又有真核細(xì)胞翻譯后加工和修飾等功能。此外，漢遜酵母還具備安全性好、易于培養(yǎng)、成本低廉、表達(dá)量高及遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，并且能夠克服諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株不穩(wěn)定、產(chǎn)量低及糖基化側(cè)鏈過長(zhǎng)以及畢赤酵母(Pichia Pastoris)外源基因整合拷貝數(shù)較低的問題。目前，應(yīng)用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的藥物(如胰島素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市銷售。
[0007]在中國(guó)發(fā)明專利公開CN102586287A及CN102719453A中公開了應(yīng)用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPV16及HPV18型別LlVLP的方法。然而關(guān)于HPV33型別的LI蛋白是否可在漢遜酵母系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)并組裝成VLP顆粒，目前并沒有公開報(bào)道。在上述2篇已公開的專利申請(qǐng)中，未給出HPV16及HPV18L1的外源基因整合拷貝數(shù)的結(jié)果及提高外源基因拷貝數(shù)的方法。在外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)方面，HPV16及HPV18L1在發(fā)酵罐中的誘導(dǎo)時(shí)間均需超過20小時(shí)，且沒有提供蛋白表達(dá)水平的具體信息。此外，作為一個(gè)重要蛋白純化指標(biāo)，關(guān)于純化過程及純化完成時(shí)外源蛋白HPV16及HPV18L1的純度也沒有公開。
[0008]為實(shí)現(xiàn)HPV33L1蛋白在漢遜酵母中的高效表達(dá)并且能夠純化獲得高純度的HPV33VLP蛋白，在本發(fā)明中，應(yīng)用了 Zeocin抗性篩選結(jié)合G418抗性篩選的雙重篩選策略，特別應(yīng)用了濃度高達(dá)16mg/ml的G418抗性平板篩選傳代并穩(wěn)定后的重組漢遜酵母表達(dá)菌株。通過檢測(cè)，篩選獲得的HPV33高表達(dá)菌株的拷貝數(shù)可超過60個(gè)拷貝。在發(fā)酵誘導(dǎo)過程中，通過提高誘導(dǎo)表達(dá)溫度至35°C可以顯著提高HPV33L1蛋白的表達(dá)水平。此外，針對(duì)VLP純化過程中常用的層析介質(zhì)P0R0S50HS在純化HPV33VLP時(shí)不易洗脫(高濃度NaCl洗脫目標(biāo)蛋白時(shí)仍有50%目標(biāo)蛋白掛柱)的特點(diǎn)，本發(fā)明使用POROS XS層析介質(zhì)，使得目標(biāo)HPV33L1蛋白在高濃度NaCl洗脫時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)80%以上蛋白的洗脫，從而大幅提高了HPV33L1蛋白的產(chǎn)量。
[0009]發(fā)明概述
[0010]在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生表達(dá)HPV33L1蛋白的重組漢遜酵母細(xì)胞的方法，其包含以下步驟:
[0011]a)通過將包含編碼HPV33L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入載體來構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體；
[0012]b)用步驟a)中獲得的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化漢遜酵母細(xì)胞；和
[0013]c)對(duì)步驟b)中獲得的漢遜酵母細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得含有所述外源多核苷酸的重組漢遜酵母細(xì)胞。
[0014]在第二個(gè)方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法產(chǎn)生的重組漢遜酵母細(xì)胞。
[0015]在第三個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法，包括以下步驟:
[0016]i)在適于HPV33L1蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組漢遜酵母細(xì)胞；和
[0017]ii)從培養(yǎng)物中回收并純化HPV33L1蛋白。
[0018]在最后一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的HPV33L1蛋白在制備用于預(yù)防HPV33感染的疫苗中的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1重組漢遜酵母細(xì)胞表達(dá)水平的SDS-PAGE檢測(cè)。1_8:8株不同重組漢遜酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)；9:標(biāo)準(zhǔn)品(10μ g/mL) ；10:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。
[0020]圖2以MOX啟動(dòng)子片段為探針的Southern印跡檢測(cè)結(jié)果。以ATCC26012基因組DNA為對(duì)照。1:對(duì)照(上樣量為100ng) ；2:對(duì)照(上樣量為500ng) ；3:對(duì)照(上樣量為250ng)；4:對(duì)照(上樣量為125ng);5:高表達(dá)重組菌HP_l#/pRMHP2.l_33hp的基因組DNA (上樣量為
7.8ng，其亮度介于500ng和100ng對(duì)照之間)；6:高表達(dá)重組菌HP_2#/pRMHP2.l_33hp的基因組DNA (上樣量為7.8ng，其亮度介于500ng和100ng對(duì)照之間)。
[0021]圖3發(fā)酵過程中HPV33L1蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè)(35°C條件下誘導(dǎo)表達(dá))。1:誘導(dǎo)O小時(shí)；2:誘導(dǎo)I小時(shí)；3:誘導(dǎo)3小時(shí)；4:誘導(dǎo)5小時(shí)；5:誘導(dǎo)7小時(shí)；6:誘導(dǎo)8小時(shí)；7:誘導(dǎo)9小時(shí)；8:誘導(dǎo)10小時(shí)；9:標(biāo)準(zhǔn)品(10 μ g/mL) ；10:預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。
[0022] 圖4A:HPV33L1蛋白的P0R0S50HS純化電泳圖。1:上柱樣品；2:流穿液；3_5:不同濃度NaCl洗脫液；6:清洗液；7:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。
[0023]B:HPV33L1蛋白的POROS XS純化電泳圖。1:上柱樣品；2:流穿液；3_6:不同濃度NaCl洗脫液；7:清洗液；8:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。
[0024]C:HPV33L1蛋白的CHT純化電泳圖。1:上柱樣品；2:流穿液；3，4:不同濃度磷酸鹽洗脫液；5:清洗液；6:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。
[0025]圖5純化的HPV33L1蛋白的透射電鏡觀察結(jié)果。
[0026]發(fā)明詳述
[0027]本發(fā)明人成功地建立了利用漢遜酵母產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法，所產(chǎn)生的HPV33L1蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒，可用于制備預(yù)防HPV感染的疫苗。
[0028]本發(fā)明首先提供了一種產(chǎn)生表達(dá)HPV33L1蛋白的重組漢遜酵母細(xì)胞的方法，其包含以下步驟:
[0029]a)通過將包含編碼HPV33L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入載體來構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體；
[0030]b)用步驟a)中獲得的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化漢遜酵母細(xì)胞；和
[0031]c)對(duì)步驟b)中獲得的漢遜酵母細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得含有所述外源多核苷酸的重組漢遜酵母細(xì)胞。
[0032]本發(fā)明還包括根據(jù)所述方法產(chǎn)生的重組漢遜酵母細(xì)胞。
[0033]來源于不同HPV33病毒株的HPV33L1蛋白的氨基酸序列會(huì)存在差異。本發(fā)明人通過對(duì)數(shù)據(jù)庫中所有的HPV33L1蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，在HPV33L1蛋白每個(gè)氨基酸位置上選取出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基，獲得了示于SEQ ID N0:1的氨基酸序列，該序列是HPV33L1蛋白最具代表性的共有序列。因此，本發(fā)明中的HPV33L1蛋白優(yōu)選具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0034]為了利用漢遜酵母高效地表達(dá)HPV33L1蛋白，發(fā)明人根據(jù)SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，針對(duì)漢遜酵母進(jìn)行核苷酸序列的密碼子優(yōu)化。優(yōu)化原則包括:a)按照漢遜酵母遺傳密碼使用頻率表(http://www.kazusa.0r.jp/codon/cg1-bin/showcodon.cgi ?species=4905)選用使用頻率最高或較高的密碼子；b)避免對(duì)基因轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯有潛在影響的負(fù)調(diào)控元件，如PolyAT區(qū)、PolyGC區(qū)、沉寂子(Sliencer)區(qū)及內(nèi)部剪接位點(diǎn)等；c)對(duì)包含5’端UTR、HPV33L1編碼區(qū)及3’端UTR在內(nèi)的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，避免復(fù)雜RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，使mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能降低；d)在編碼區(qū)上游盡可能采用與漢遜酵母啟動(dòng)子下游天然序列完全一致的5’ UTR區(qū)；e)消除常用的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。經(jīng)過優(yōu)化的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2。本發(fā)明中所使用的編碼HPV33L1蛋白的核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO:2所示的序列。
[0035]本發(fā)明可以應(yīng)用的漢遜酵母表達(dá)載體為申請(qǐng)?zhí)枮?01210021524.X的中國(guó)專利申請(qǐng)中描述的漢遜酵母表達(dá)載體PRMHP2.1 (包含示于SEQ ID NO:9的序列)。通過將包含編碼HPV33L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸克隆進(jìn)PRMHP2.1載體，可以獲得本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體還可以用其它載體構(gòu)建，例如已授權(quán)的中國(guó)專利CN100400665C中所描述的載體。
[0036]為了能在漢遜酵母中表達(dá)，所述表達(dá)構(gòu)建體中的外源多核苷酸可操縱地與啟動(dòng)子和終止子連接。
[0037]如本文所用，“可操縱地連接”指至少兩個(gè)多核苷酸的功能連接。例如，可操縱地連接包括啟動(dòng)子與另一個(gè)多核苷酸之間的連接，其中所述啟動(dòng)子序列起始并介導(dǎo)該另一個(gè)多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。可操縱地連接包括終止子與另一個(gè)多核苷酸之間的連接，其中所述終止子終止該另一個(gè)多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。
[0038]適用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于M0X、FMD、A0X1和DHAS啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子是來自漢遜酵母的MOX啟動(dòng)子。適用于本發(fā)明的終止子包括但不限于來自漢遜酵母的MOX終止子。
[0039]將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至漢遜酵母細(xì)胞可以用多種本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，包括但不限于電穿孔和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
[0040]另外，本領(lǐng)域中已經(jīng)開發(fā)多種用于表達(dá)外源蛋白漢遜酵母菌株，包括但不限于CGMCC2.2498漢遜酵母、ATCC34438漢遜酵母和ATCC26012漢遜酵母細(xì)胞。這些漢遜酵母菌株也可以應(yīng)用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的漢遜酵母細(xì)胞是ATCC26012漢遜酵母細(xì)胞。
[0041]在轉(zhuǎn)化后，可以依據(jù)載體上攜帶的抗性基因來選擇重組漢遜酵母細(xì)胞。合適的抗性基因包括但不限于Zeocin抗性基因和G418抗性基因。依據(jù)所使用的載體，也可能使用營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基來篩選重組漢遜酵母細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，使用Zeocin來選擇重組漢遜酵母細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，使用G418來選擇重組漢遜酵母細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，組合使用Zeocin和G418來選擇重組漢遜酵母細(xì)胞。Zeocin的篩選濃度可以是0.25、
0.5,0.75、1.0或者1.5mg/ml，優(yōu)選0.5mg/ml。使用的G418的篩選濃度可以是2、4、8、10、
12、14、16、18 或 20mg/ml,優(yōu)選 16mg/ml。
[0042]外源多核苷酸在漢遜酵母中的表達(dá)水平與其在漢遜酵母中的拷貝數(shù)正相關(guān)。因此，還可以通過Southern印跡或定量PCR等方法進(jìn)行進(jìn)一步的篩選含有多拷貝外源多核苷酸的重組漢遜酵母細(xì)胞。優(yōu)選外源多核苷酸拷貝數(shù)大于15的重組漢遜酵母細(xì)胞，更優(yōu)選外源多核苷酸拷貝數(shù)大于60的重組漢遜酵母細(xì)胞。
[0043]本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，組合使用Zeocin和G418來選擇重組漢遜酵母細(xì)胞，特別是使用高達(dá)16mg/ml的G418來進(jìn)行選擇能夠獲得外源多核苷酸拷貝數(shù)大于15，特別是大于60的穩(wěn)定的重組漢遜酵母細(xì)胞。
[0044]在另一方面，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法，包括以下步驟:
[0045]i)在適于HPV33L1蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組漢遜酵母細(xì)胞；和
[0046]ii)從培養(yǎng)物中回收并純化HPV33L1蛋白。
[0047]本領(lǐng)域已知可用于培養(yǎng)漢遜酵母的各種培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)需要進(jìn)行選擇或修改。本發(fā)明的重組漢遜酵母表達(dá)菌株的培養(yǎng)根據(jù)所需蛋白量可以在燒瓶進(jìn)行或在不同規(guī)模的生物反應(yīng)器(如30L的發(fā)酵罐)進(jìn)行。根據(jù)所選用的啟動(dòng)子，可以在培養(yǎng)中加入合適的誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)所述HPV33L1蛋白的表達(dá)。在使用MOX或FMD啟動(dòng)子的情況下，可以加入甲醇作為誘導(dǎo)物。酵母發(fā)酵培養(yǎng)常規(guī)在30°C下進(jìn)行，而本發(fā)明人卻令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組漢遜酵母細(xì)胞在35°C進(jìn)行蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)能夠使外源蛋白表達(dá)量顯著提高。
[0048]所產(chǎn)生的HPV33L1蛋白的純化可以使用本領(lǐng)域已知的各種蛋白純化方式，如鹽析、超濾、沉淀、層析等或這些方式的組合。在一個(gè)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案中，首先用層析介質(zhì)POROS XS進(jìn)行初步純化，隨后利用層析介質(zhì)Macro-Pr印陶瓷羥基磷灰石(Type II，40 μ m)
進(jìn)一步純化。
[0049]利用本發(fā)明的方法制備的純化的HPV33L1蛋白可以自組裝成病毒樣顆粒(實(shí)施例9，圖5)，并在小鼠中顯示出良好的免疫原性(實(shí)施例10)，因此本發(fā)明也提供了所述HPV33L1蛋白在制備用于預(yù)防HPV33感染的疫苗中的用途。
實(shí)施例
[0050]下面將通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所描述的實(shí)施例范圍中。
[0051]實(shí)施例1:HPV33L1共有氨基酸序列的分析
[0052]全長(zhǎng)的HPV33L1蛋白由499個(gè)氨基酸組成，經(jīng)過GenBank檢索后，使用Vector NTI軟件AlignX功能進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，獲得最具代表性的HPV33L1共有氨基酸序列(consensus amino acid sequence,即在HPV33L1每個(gè)氨基酸位置均米用出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基的序列)，其序列如SEQ ID NO:1所示。
[0053]實(shí)施例2:HPV33L1編碼基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)及人工合成
[0054]為了利用漢遜酵母高效地表達(dá)HPV33L1蛋白，發(fā)明人根據(jù)SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，針對(duì)漢遜酵母進(jìn)行核苷酸序列的密碼子優(yōu)化。優(yōu)化原則包括:a)按照漢遜酵母遺傳密碼使用頻率表選用使用頻率最高或較高的密碼子山)避免對(duì)基因轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯有潛在影響的負(fù)調(diào)控元件，如PolyAT區(qū)、PolyGC區(qū)、沉寂子(Sliencer)區(qū)及內(nèi)部剪接位點(diǎn)等；c)對(duì)包含5’端UTR、HPV33L1編碼區(qū)及3’端UTR在內(nèi)的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，避免復(fù)雜RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，使mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能降低；d)在編碼區(qū)上游盡可能采用與漢遜酵母啟動(dòng)子下游天然序列完全一致的5’UTR區(qū)；e)消除常用的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。經(jīng)過優(yōu)化的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2。
[0055]根據(jù)以上核苷酸序列，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行的全序列人工合成，克隆于T載體中(命名為T-33hp)，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0056]實(shí)施例3:產(chǎn)生攜帶HPV33L1核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體
[0057]本發(fā)明所應(yīng)用的漢遜酵母表達(dá)載體為申請(qǐng)?zhí)枮?01210021524.X的中國(guó)專利申請(qǐng)中描述的漢遜酵母表達(dá)載體PRMHP2.1(SEQ ID N0:9)。
[0058](I) MOX啟動(dòng)子及MOX終止子的PCR擴(kuò)增
[0059]以漢遜酵母菌株ATCC26012及ATCC34438的混合基因組DNA為模板，用以下引物對(duì)擴(kuò)增獲得大小為1518bp的MOX啟動(dòng)子，同時(shí)在上游引入NotI酶切位點(diǎn)；
[0060]MOX 啟動(dòng)子上游引物:5 ’ -AAGGAAAAAAGCGGCCGCAACGATCTCCTCGAGCTGCTCGC-3，(SEQID N0:3)
[0061]MOX 啟動(dòng)子下游引物:5’-TTTGTTTTTGTACTTTAGATTGATGTC-3’ (SEQ ID N0:4)
[0062]以漢遜酵母菌株ATCC26012及ATCC34438的混合基因組DNA為模板，用以下引物對(duì)擴(kuò)增獲得大小為311bp的MOX終止子，同時(shí)在下游引入BglII酶切位點(diǎn)；
[0063]MOX 終止子上游引物:5’-GGAGACGTGGAAGGACATACCGC-3’ (SEQ ID NO:5)
[0064] MOX 終止子下游引物:5’-GAAGATCTCAATCTCCGGAATGGTGATCTG-3’ (SEQ ID NO:6)
[0065](2)產(chǎn)生攜帶HPV33L1核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體
[0066]以攜帶33hp的重組質(zhì)粒T_33hp為模板，用以下引物對(duì)擴(kuò)增獲得大小為1548bp的HPV33Llhp基因，同時(shí)在上游引入MOX啟動(dòng)子區(qū)3’端的重疊序列，在下游引入MOX終止子5’端的重疊區(qū)；
[0067]33上游引物:
[0068]5’ -CATCAATCTAAAGTACAAAAACAAAATGTCGGTGTGGAGACCATCTGAAG-3’ (SEQ IDN0:7)
[0069]33 下游引物:5，-GCGGTATGTCCTTCCACGTCTCCTTATTTCTTGACTTTCTTTCTCTTGGC-3，(SEQ ID N0:8)
[0070]以MOX啟動(dòng)子、33hp基因、MOX終止子三個(gè)片段為混合模板，用以下引物對(duì)擴(kuò)增獲得大小為3.4Kb的33hp表達(dá)盒，擴(kuò)增產(chǎn)物在上游攜帶NotI酶切位點(diǎn)，在下游攜帶BglII酶切位點(diǎn)。
[0071 ] MOX 啟動(dòng)子上游引物:5 ’ -AAGGAAAAAAGCGGCCGCAACGATCTCCTCGAGCTGCTCGC-3，(SEQID N0:3)
[0072]MOX 終止子下游引物:5’-GAAGATCTCAATCTCCGGAATGGTGATCTG-3’ (SEQ ID N0:6)
[0073]通過Notl+Bglll雙酶切將33hp表達(dá)盒克隆入pRMHP2.1載體中，獲得表達(dá)構(gòu)建體pRMHP2.l-33hp。
[0074]實(shí)施例4:重組漢遜酵母細(xì)胞的產(chǎn)生
[0075]( I)重組表達(dá)構(gòu)建體質(zhì)粒的提取及酶切
[0076]挑取轉(zhuǎn)化入實(shí)施例3中獲得的重組表達(dá)構(gòu)建體質(zhì)粒的大腸桿菌菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit試劑盒(Omega B1-Tek公司)提取質(zhì)粒，并用BglII進(jìn)行單酶切，應(yīng)用E.Z.N.A Gel Extract1n Kit試劑盒(Omega B1-Tek公司)進(jìn)行回收,用50 μ L預(yù)熱至55°C的無菌水進(jìn)行洗脫，通過測(cè)定OD26tl進(jìn)行DNA定量，并將線性化的片段稀釋至10ng/μ 1，保存于-20°C冰箱中，備用。
[0077](2)漢遜酵母細(xì)胞的處理
[0078]挑取漢遜酵母菌株ATCC26012單菌落，接入含5ml的YPD液體培養(yǎng)基的小試管中，30°C培養(yǎng)12小時(shí)；取菌液5ml轉(zhuǎn)接至200ml YPD培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)4-6小時(shí)，至OD6tltol約為 1.0-1.5，于 5000rpm 離心 1min ;用 200ml0.lmol/L 磷酸鹽緩沖液(含 25mmol/L DTT，pH7.5)重懸菌體,充分混勻，于30°C孵育30min, 5000rpm離心1min,棄上清，留菌體。用預(yù)冷的STM溶液200ml洗菌體，菌體吹吸均勻，于4°C 5000rpm離心3min，棄上清，留沉淀。用冰冷的STM溶液10ml重懸菌體，于4°C 5000rpm離心3min，棄上清，留沉淀。根據(jù)菌體量用50-200 μ I冰冷的STM溶液重懸菌體，并將菌液轉(zhuǎn)移至高壓后的離心管中，冰浴，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。
[0079](3)漢遜酵母細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化
[0080]按質(zhì)粒:菌體=1: 2的量加入重組漢遜酵母表達(dá)質(zhì)粒15 μ 1，菌液30 μ 1，充分吹吸均勻，置于冰浴中待轉(zhuǎn)化；將事先用酒精浸泡，且紫外照射后，于-20°C冷藏的電轉(zhuǎn)杯取出，加入質(zhì)粒菌體混合液；按電壓2500V、電阻150 Ω、電容50 μ F的條件進(jìn)行電擊；電擊后迅速加入1ml已平衡至室溫的YPD溶液，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至EP管中；將電轉(zhuǎn)后的菌體于30°C水浴中放置Ih,每間隔15min輕輕顛倒3次；將已孵育2h的菌液,于5000rpm離心1min,棄上清；用200 μ I YPD溶液重懸菌體，以100 μ I/板涂布于含0.5mg/mlZeocin的YPD平板中，于30°C倒置培養(yǎng)3-7天。
[0081](4)重組漢遜酵母表達(dá)菌株的傳代、穩(wěn)定
[0082]挑取Zeocin抗性平板上長(zhǎng)出的重組菌株單菌落，接種于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm搖床培養(yǎng)24-48小時(shí)，至OD值達(dá)50后，以1:1000的比例轉(zhuǎn)接于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值達(dá)50后，再以1:1000的比例轉(zhuǎn)接于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，以此類推，連續(xù)傳10次并進(jìn)行菌種的保存。保存體系為菌液:60%甘油=1:1，根據(jù)需要量保存菌種，通常為500 μ I菌液+500 μ 160% 甘油；
[0083]將傳至10次的重組漢遜酵母表達(dá)菌株接入5ml不含Zeocin抗性的YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm搖床培養(yǎng)至OD值達(dá)50后，以1:1000的比例轉(zhuǎn)接于5ml YI3D液體培養(yǎng)基中，以此類推，在不含Zeocin抗性的YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳5次。
[0084]將穩(wěn)定后的菌液涂布含16mg/ml G418的YPD平板，于30°C倒置培養(yǎng)2-3天。
[0085]實(shí)施例5:重組漢遜酵母菌株的表達(dá)研究
[0086]從含16mg/ml G418的YPD平板中挑取多個(gè)重組漢遜酵母單菌落，接入含5ml的YPG液體培養(yǎng)基的小試管中，30°C培養(yǎng)24小時(shí)；將菌液轉(zhuǎn)接于含30ml YPM誘導(dǎo)培養(yǎng)基的10ml三角瓶中，初始密度為0D_=1，于30°C搖床誘導(dǎo)72小時(shí)，每隔12小時(shí)于菌液中加入終濃度為0.5%的甲醇溶液。
[0087]取1ml誘導(dǎo)后的菌液轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中，于1000rpm離心1min,棄上清；以50ml的細(xì)胞裂解重懸菌體沉淀，充分混勻后，在超聲儀中按“功率60%、時(shí)間20min、開5s、關(guān)5s”的超聲破碎程序進(jìn)行菌體破碎，破碎過程中需保持冰??；將超聲破碎的菌液，于1000rpm離心1min,收集上清后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),誘導(dǎo)結(jié)果(如圖1所示)顯示:高表達(dá)的重組漢遜酵母菌株表達(dá)水平可達(dá)50 μ g/ml以上。
[0088]實(shí)施例6:重組漢遜酵母細(xì)胞的外源多核苷酸拷貝數(shù)檢測(cè)
[0089](I)酵母基因組DNA的提取及定量
[0090]接種2株實(shí)施例5獲得的高表達(dá)酵母菌株到5ml的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)基，30 °C培養(yǎng)16~24h ;取2ml酵母培養(yǎng)液，室溫4500g離心3min收集菌體；應(yīng)用500 μ I SCED溶液(lmol/L山梨醇、10mmol/L檸檬酸鈉、10mmol/L EDTAUOmmoI/L DTT 二硫蘇糖醇)重懸菌體，并加入50mg玻璃珠充分震蕩5min，加入50μ 110mg/ml溶壁酶，37°C溫浴Ih ;加入60 μ I的10%SDS，30 μ I的蛋白酶K，10 μ I的RNaseA酶，室溫放置10分鐘后在55°C的水浴中培養(yǎng)2h ;加入350 μ I飽和酚及350 μ I氯仿，充分混合后于13000rpm，離心10分鐘，收集分層后的上層液；加入等體積(約700 μ I)氯仿，于13000rpm，離心10分鐘，收集分層后的上層液；往上層液中加入140 μ I的3mol/L乙酸鈉溶液，輕輕混勻后再加入700 μ I異丙醇，混勻后室溫放置5min，于13000rpm，離心10分鐘。棄上清，加入1ml70%乙醇進(jìn)行清洗，于13000rpm，離心10分鐘，倒去上清，DNA沉淀置于室溫放置30min后，加入100 μ I TE溶解。通過測(cè)定OD26tlnm進(jìn)行基因組DNA的定量，并將線性化的片段稀釋至lOOng/μ 1，保存于-20°C冰箱中，備用。
[0091] (2) Southern印跡方法進(jìn)行外源多核苷酸拷貝數(shù)的定量
[0092]a:探針制備
[0093]本發(fā)明所應(yīng)用的MOX探針申請(qǐng)?zhí)枮?01210021524.X的中國(guó)專利申請(qǐng)中描述的MOX 探針，應(yīng)用 Roche 公司的 DIG DNA Labeling and Detect1n kit 試劑盒(Cat No:11093657910)進(jìn)行探針制備。具體步驟為:向EP小管中加入10 μ I MOX啟動(dòng)子區(qū)的PCR產(chǎn)物(200ng/l.! 1)，并用封口膜封上，沸水煮沸10分鐘。立即放入預(yù)冷(_20°C)的無水乙醇小盒中(驟然冷卻)。擦干管外壁乙醇，離心(約10s)，依次加入5μ I內(nèi)毒素檢查用水、2 μ IlOxHexanucleotide Mix>2 μ IlOx dTP Labeling Mixture、I μ 17Klenow Enzyme (labelinggrade )，混勻，封口膜封口。37 °C水浴過夜，-20 V保存。
[0094]b: Southern 印跡
[0095]應(yīng)用北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司的地高辛雜交檢測(cè)試劑盒I (Cat No:DI⑶-110)及HyB高效雜交液(Cat No:Hyb_500)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行Southern印跡檢測(cè)。
[0096]Southern印跡檢測(cè)結(jié)果(如圖2所示)顯示:在16mg/ml的g418抗性平板篩選獲得的高表達(dá)重組漢遜酵母HP-l#/pRMHP2.l_33hp菌株及HP_2#/pRMHP2.l_33hp菌株外源多核苷酸拷貝數(shù)超過60個(gè)。表明了應(yīng)用zeocin抗體篩選結(jié)合g418抗性篩選的雙重篩選策略，特別是采用高達(dá)16mg/ml濃度的g418抗性平板篩選有助于獲得高拷貝整合且能進(jìn)行HPV33L1蛋白高表達(dá)的重組菌株。
[0097]實(shí)施例7:HPV33L1重組漢遜酵母表達(dá)菌株的發(fā)酵工藝
[0098]發(fā)酵種子液:取I支凍存甘油菌(HP-l#/pRMHP2.l_33hp)，融化后吸取50 μ I接入5ml YPD培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm搖床培養(yǎng)20_24hr，A6tltol約2_5，檢定合格后各吸取Iml接入2瓶500ml YPD培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm搖床培養(yǎng)20_24hr至A6tltlnm約15-20，檢定合格后作為發(fā)酵種子液待用。
[0099]發(fā)酵工藝:發(fā)酵起始培養(yǎng)基含有酵母粉300g，蛋白胨150g，甘油100g，基礎(chǔ)鹽(K2S04273g，MgSO410 g, 85%H3P04400ml, K0H62g), 10L 純化水充分溶解，加入 30L 發(fā)酵罐中，純化水定容至14L，121°C，30min滅菌，冷卻至30 °C后加入60ml PTMl微量元素液(CuSO4.5Η206.0g, ΚΙ0.088g, MnSO4.Η203.0g, Na2MoO4.2Η200.2g, H3BO30.02g,CoCl2.6Η200.5g, ZnCl220.0g, FeSO4.7H2065.0g, B1tin0.2g,濃 H2S045.0ml，純化水定容至1L，0.22 μ m濾膜過濾除菌)，氨水調(diào)節(jié)pH5.6，接種I瓶500ml發(fā)酵種子液，此時(shí)發(fā)酵體積為15L。起始攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm、空氣流量0.5Nm3/hr、罐壓0.5bar，發(fā)酵中控制溶氧值為20-80%。起始生長(zhǎng)期維持約25hr后，菌液A6tltlnm達(dá)到20左右，溶氧開始快速上升，開始以100ml/hr流速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基(50%甘油(W/V)，12ml PTMl)，此時(shí)進(jìn)入流加生長(zhǎng)期。培養(yǎng)約6-8hr后，菌液A6tltol達(dá)到90左右，停止流加，氨水調(diào)節(jié)pH值至6.0。溶氧開始回升后開始流加甲醇(含12ml/L PTMl)進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)期，誘導(dǎo)期將溫度調(diào)升至35°C，甲醇初始流加速率為50ml/hr，每小時(shí)取樣，甲醇電極測(cè)定甲醇濃度，通過調(diào)節(jié)甲醇流加速率使甲醇濃度控制在< 5g/L。
[0100]下罐離心及表達(dá)量檢測(cè):誘導(dǎo)1hr后下罐，4°C條件下以5000rpm離心30min收集濕菌體，_20°C凍存?zhèn)溆?。另外，?ml發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中，于1000rpm離心lOmin，棄上清，以50ml的細(xì)胞裂解液重懸菌體沉淀，充分混勻后進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎液進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，Western印跡檢測(cè)結(jié)果如圖3所示:整個(gè)誘導(dǎo)周期可在10小時(shí)內(nèi)結(jié)束，HPV33的發(fā)酵液表達(dá)量可達(dá)150μ g/mL以上。
[0101]實(shí)施例8:HPV33L1重組蛋白的純化工藝研究及優(yōu)化
[0102]菌體破碎:取_20°C保存的HPV33表達(dá)濕菌體，按照10ml/g濕菌體的比例加入
0.9%生理鹽水清洗。菌體洗滌后，按20ml緩沖液/g濕菌體加入破碎緩沖液(含0.5mol/LNaCl，0.02%Tween-80,0.05mol/L MOPS)充分溶解，使用高壓勻漿破碎，破碎壓力1500bar，循環(huán)破碎5-8遍，鏡檢破碎率> 90%。菌體破碎液在4°C條件下以1000rpm離心30min，收集上清液，再加入50%硫酸銨,沉淀30min后,4°C條件下1000rpm離心30min,收集上清液。
[0103]層析純化第一步:1)常規(guī)工藝:經(jīng)Iym過濾的菌體破碎上清液，上樣于層析介質(zhì)P0R0S50HS,目的蛋白吸附到層析介質(zhì)上，以0.5M~1.5M NaCl梯度洗脫；2)優(yōu)化工藝:經(jīng)I μ m過濾的菌體破碎上清液，上樣于層析介質(zhì)POROS XS,用0.5M~1.5M NaCl梯度洗脫。應(yīng)用以上2種不同的層析介質(zhì)吸附HPV33L1蛋白，在不同濃度NaCl梯度洗脫后再用0.5MNaOH清洗柱子。SDS-PAGE檢測(cè)層析過程中HPV33L1蛋白的純化情況，結(jié)果如圖4A及圖4B所示:1)應(yīng)用層析介質(zhì)P0R0S50HS，在高濃度NaCl洗脫后，仍殘留有50%以上的HPV33L1蛋白沒有被洗脫下來；2)應(yīng)用層析介質(zhì)POROS XS，在高濃度NaCl洗脫后，僅有不到20%的HPV33L1蛋白沒有被洗脫下來。表明在進(jìn)行HPV33L1蛋白的初步層析純化時(shí)，應(yīng)用層析介質(zhì)POROS XS能有利于HPV33L1蛋白的洗脫，從而大幅提高HPV33L1的得率。
[0104]層析純化第二步:將初步純化后的HPV33L1蛋白上樣于層析介質(zhì)Macro-Prep陶瓷羥基磷灰石(Type II, 40 μ m),目的蛋白結(jié)合于層析介質(zhì)上,用20~200mM磷酸鹽濃度梯度洗脫，目的蛋白與雜質(zhì)分離，收集洗脫的HPV33L1蛋白(見圖4C)。
[0105]實(shí)施例9:透射電鏡觀察純化的HPV33L1重組蛋白
[0106]用無菌水3倍稀釋純化后的HPV33L1蛋白樣品，滴一小滴于臘盤上。取銅網(wǎng)使有支持膜的表面與樣品液表面接觸，靜置Imin取出，取出銅網(wǎng)，用濾紙條吸除多余的液滴，稍晾干。取2%醋酸鈾溶液，滴一小滴于臘盤上。吸附有樣品的銅網(wǎng)放置于染液表面(樣品與染液接觸)，靜置2min。取出銅網(wǎng)，用濾紙條吸除多余的液滴，白熾燈下晾干。應(yīng)用JE0L-1400型號(hào)透射電鏡觀察VLP顆粒形態(tài)并拍照(結(jié)果圖5所示)。
[0107]實(shí)施例10:用漢遜酵母重組制備的HPV33L1VLP的免疫原性研究
[0108]應(yīng)用測(cè)定體液免疫效力ED5tl (半數(shù)有效劑量)的方法評(píng)價(jià)HPV33L1VLP的免疫原性
[0109](I)小鼠的免疫:85只6周齡Balb/c雌性小鼠(購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，清潔級(jí)飼養(yǎng)。共分為6個(gè)組，包括5個(gè)實(shí)驗(yàn)組及I個(gè)對(duì)照組，按所需免疫劑量將HPV33L1蛋白樣品進(jìn)行稀釋(表1)。免疫程序?yàn)?第0、3、6周各免疫一次，最后一次免疫后14天殺鼠并分離血清。
[0110]表1小鼠的分組

【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)生表達(dá)人乳頭瘤病毒33型LI (HPV33L1)蛋白的重組漢遜酵母細(xì)胞的方法，其包含以下步驟: a)通過將包含編碼HPV33L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入載體來構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體； b)用步驟a)中獲得的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化漢遜酵母細(xì)胞；和 c)對(duì)步驟b)中獲得的漢遜酵母細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得含有所述外源多核苷酸的重組漢遜酵母細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述HPV33L1蛋白的氨基酸序列示于SEQID NO:1。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述編碼HPV33L1蛋白的核苷酸序列示于SEQID N0:2。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中在所述表達(dá)構(gòu)建體中所述外源多核苷酸可操縱地連接于啟動(dòng)子和終止子。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述啟動(dòng)子是MOX啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述終止子是MOX終止子。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體包括SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中步驟c)中使用Zeocin和G418篩選重組漢遜酵母細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法,其中Zeocin的濃度是0.5mg/ml。
10.權(quán)利要求8的方法，其中G418的濃度是16mg/ml。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)中通過電穿孔來轉(zhuǎn)化漢遜酵母細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)中的所述漢遜酵母細(xì)胞是ATCC26012漢遜酵母細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組漢遜酵母細(xì)胞含有多拷貝的所述外源多核苷酸。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的重組漢遜酵母細(xì)胞。
15.一種產(chǎn)生HPV33L1蛋白的方法，包括以下步驟: i)在適于所述HPV33L1蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11的重組漢遜酵母細(xì)胞；和 ii)從培養(yǎng)物中回收并純化所述HPV33L1蛋白。
16.權(quán)利要求15的方法，其中步驟i)中包括在35°C誘導(dǎo)所述HPV33L1蛋白表達(dá)。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中步驟ii)中使用POROSXS層析介質(zhì)純化所述HPV33L1 蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的HPV33L1蛋白在制備用于預(yù)防HPV33感染的疫苗中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104164446SQ201310183593
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】王貽杰, 程海, 于躍, 霍燭, 劉娟, 陳丹, 李鼎鋒, 劉勇 申請(qǐng)人:北京安百勝生物科技有限公司, 江蘇瑞科生物技術(shù)有限公司