分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物的分子菌種鑒定領(lǐng)域，涉及一種分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應(yīng)用。其中，rpsA基因應(yīng)用在分枝桿菌的菌種鑒定中，所述rpsA基因可通過包括正向引物和反向引物的通用引物對擴(kuò)增獲得。通用引物對包括正向引物和反向引物，其用于擴(kuò)增分枝桿菌的rpsA基因。分枝桿菌的種屬鑒定方法利用所述通用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得待測菌株的rpsA基因片段，測序后比對從而鑒定待測菌株的種屬。分枝桿菌的分類鑒定試劑盒，應(yīng)用rpsA基因進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，包括直接檢測rpsA基因的PCR技術(shù)或以此基礎(chǔ)為基礎(chǔ)的其它檢查技術(shù)。本發(fā)明對分枝桿菌的種屬分類鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法簡單、鑒定速度快；通用引物對能鑒定絕大多數(shù)常見的非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。
【專利說明】分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及微生物的分子鑒定領(lǐng)域；尤其涉及一種分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，尤其是在發(fā)展中國家。據(jù)WHO統(tǒng)計世界人口的1/3有結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染,是全世界感染性疾病中的第一大殺手。我國是全世界22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，活動性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。目前我國全年齡組結(jié)核菌感染率為44.5%，全國約5.5億人受到結(jié)核菌感染。而非結(jié)核分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria, NTM)感染在我國總體也呈上升趨勢，1984/1985年第二次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查(簡稱流調(diào))NTM發(fā)病率為4.2%，1990年第三次流調(diào)為4.9%, 2000年第四次流調(diào)則增至11.1%，而在2010年第五次流調(diào)中則上升為22.9%。然而這個比率遠(yuǎn)低于歐洲和美國的發(fā)病率(> 40%)。按照流行病學(xué)的理論，隨著國家結(jié)核病防治規(guī)劃效果的日益顯現(xiàn)，NTM在結(jié)核病總體發(fā)病中所占的比率逐步提高。因此，預(yù)計我國未來NTM的發(fā)病率仍有上升空間，所以對NTM的研究也應(yīng)該提高重視程度。
[0003]NTM病臨床表現(xiàn)與結(jié)核病相似，在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，經(jīng)常被誤診為結(jié)核病。而臨床對于感染了結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的患者治療方案完全不同:非結(jié)核分枝桿菌多數(shù)對常用的抗結(jié)核藥物天然耐藥(NTM耐多藥率高達(dá)83.7%)，但一些廣譜的抗生素對治療NTM感染有效，而這些廣譜抗生素對結(jié)核分枝桿菌感染的抗菌作用很弱，甚至沒有作用；常見的能夠致病的NTM有30余種，針對不同種NTM治療的藥物選擇存在較大差異。因此在臨床上，快速準(zhǔn)確地判定患者是否存在NTM感染，是何種NTM感染，對臨床治療具有重要意義。
[0004]目前臨床上常用的鑒定NTM的方法分為兩大類，一類是傳統(tǒng)生化的方法，操作繁瑣并且不夠準(zhǔn)確，所以已基本被棄用，僅有含對硝基苯甲酸(PNB)的選擇性培養(yǎng)基法仍然廣泛使用，用于初步區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC)和NTM ;另一類為分子生物學(xué)方法，以比較同源基因/序列的序列差異來鑒定NTM至種水平，該方法以操作簡單、快速、能夠鑒定分枝桿菌至種水平等優(yōu)勢成為目前最常用的方法，并且已經(jīng)衍生出了各類商業(yè)試劑盒(如DNA芯片技術(shù)，線形探針雜交技術(shù))應(yīng)用于臨床。目前最見的用于分枝桿菌菌種鑒定的同源基因/序列包括:16srRNA編碼基因、16s-23s rRNA間區(qū)(ITS)、hsp60和rpoB基因。采用單一的基因或現(xiàn)有基因組合對NTM的鑒別依然僅能鑒定常見致病NTM中的一部分，少量NTM由于種間序列的高度同源性，現(xiàn)有的鑒定技術(shù)不能夠區(qū)分。如鳥分枝桿菌復(fù)合群、海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌，即使聯(lián)合使用16s rRNA編碼基因和ITS，也不能區(qū)分。現(xiàn)有的鑒別技術(shù)鑒定為同一種的分枝桿菌，有可能被新的標(biāo)識鑒定為幾種分枝桿菌或分為幾個亞種，如經(jīng)16s rRNA基因和ITS鑒定為膿腫分枝桿菌的菌群，在結(jié)合使用hsp60和rpoB基因后，進(jìn)一步分為了膿腫分枝桿菌、M.massiIiense和M.bolletii。目前對分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)主要關(guān)注的是其鑒定NTM至種的能力，實(shí)際上通過更多的分子標(biāo)識的使用，有可能將同一種NTM分為更多的亞型，更細(xì)致的分型不僅有助于流行病學(xué)研究，而且當(dāng)與患者的病史結(jié)合時，還有可能建立不同亞型與患者發(fā)病的聯(lián)系，由此了解宿主的免疫機(jī)制與發(fā)病機(jī)制，類似的研究在國際上還未被關(guān)注過。因此，發(fā)現(xiàn)更多的分子標(biāo)識，提高分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)的鑒別能力，對臨床診斷和治療具有重要的參考價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明第一方面提供了 rpsA基因在分枝桿菌菌種鑒定中的應(yīng)用。
[0007]rpsA基因(作為一種新的分子標(biāo)識)用于在分枝桿菌菌種鑒定中，通過一種通用引物對，包括正向引物和反向引物，擴(kuò)增分枝桿菌(Mycobacterium)的rpsA基因，從而鑒定或區(qū)分不同的分枝桿菌。優(yōu)選的，其中所述正向引物為5’-CCCTACATCGGCAAGGAG-3’ (SEQ IDNo:1)，所述反向引物為 5，-TGTCGATGACCTTGACCATC-3，(SEQ ID No:2)。其中，正向引物，位于結(jié)核分枝桿菌的rpsA基因的487-504位置,gene bank號為NC_000962.2 ;反向引物位于結(jié)核分枝桿菌的rpsA基因的1032-1051位置，gene bank號為NC_000962.2。
[0008]本發(fā)明第二方面提供了一種通用引物對，所述通用引物對包括正向引物和反向引物，其用于擴(kuò)增分枝桿菌Mycobacterium的rpsA基因,其中所述正向引物如SEQ ID No:l所示，所述反向引物如SEQ ID No:2所示。該引物對擴(kuò)增分枝桿菌(Mycobacterium)的rpsA基因，本發(fā)明還將引物對應(yīng)用于檢測分枝桿菌或鑒定分枝桿菌。
[0009]本發(fā)明第三方面提供了一種分枝桿菌的種屬鑒定方法，該方法利用上述通用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得待測菌株的rpsA基因片段，測序后比對從而鑒定待測菌株的種屬。
[0010]優(yōu)選的，所述方法包括如下步驟:a)以待測菌株的基因組DNA為模板，以正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增所得DNA片段進(jìn)行回收、純化、測序，得rpsA基因序列；b)根據(jù)序列測定結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得鑒定結(jié)果。
[0011]更優(yōu)選的，上述方法的步驟b)為:將序列測定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中所有的分枝桿菌的rpsA基因序列進(jìn)行BLAST比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得鑒定結(jié)果?；蛘吒鼉?yōu)選的，步驟b)為:利用Clustal X軟件對待測菌株的rpsA基因序列進(jìn)行多序列重排；其間同時加入不同分枝桿菌菌種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的rpsA基因序列，利用MEGA軟件建立包含多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與待測菌株親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株所對應(yīng)的種，即為該菌株所屬的種。
[0012]更優(yōu)選的，上述方法的步驟a)中PCR擴(kuò)增的具體操作為:擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μ 1，正向引物濃度及反向引物濃度分別為20pmol，模板DNA50ng，Taq酶1U，脫氧核苷三磷酸終濃度250 μ M7MgCl2終濃度1.5mM ;擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95°C變性5分鐘，之后循環(huán)30次(95°C 30#,56°C 30 #,72°C 30 秒)，72°C延伸 5 分鐘。
[0013]本發(fā)明第四方面還提供了一種分枝桿菌的分類鑒定試劑盒，應(yīng)用rpsA基因進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，包括直接檢測rpsA基因的PCR技術(shù)或以此基礎(chǔ)為基礎(chǔ)的其它檢查技術(shù)。所述試劑盒包含SEQ ID No:1所示的正向引物和SEQ ID No:2所示的反向引物。所述試劑盒還包括dNTPs、10XBuffer, Taq DNA聚合酶和超純水。
[0014]本發(fā)明還提供了將上述通用引物對、擴(kuò)增引物對、或試劑盒應(yīng)用于制備鑒定分枝桿菌的產(chǎn)品中。
[0015]舉例來說，本發(fā)明的鑒定分枝桿菌種屬的方法，包括如下步驟:S10、使用上述引物分別擴(kuò)增多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因；S20、對擴(kuò)增后的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因進(jìn)行測序；S30、對待鑒定的臨床分離株的rpsA基因用步驟SlO中的引物進(jìn)行擴(kuò)增并測序；S40、對擴(kuò)增后的rpsA基因進(jìn)行多序列重排，根據(jù)臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)株的序列相似度判斷臨床分離株所屬菌種。其中擴(kuò)增條件同前。
[0016]其中，優(yōu)選的，步驟S30中使用CLUSTAL2.1軟件對待鑒定臨床分離株擴(kuò)增后的rpsA基因進(jìn)行多序列重排。
[0017]為了更簡便的鑒定出待測菌株所屬菌種，優(yōu)選的，步驟S20與步驟S30之間還包括步驟S25:對擴(kuò)增后的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因測序后，建立包含多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的進(jìn)化樹；并且步驟S30中判斷臨床分離株所屬菌種后，參照所述進(jìn)化樹進(jìn)行進(jìn)一步比對證實(shí)。
[0018]為了更簡便快速的建立進(jìn)化樹，優(yōu)選的，步驟S25中使用Mega5.05軟件建立包含多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的進(jìn)化樹。
[0019]本發(fā)明的上述鑒定方法中，其中擴(kuò)增了 43種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因片段，所述43種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為:胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare) ATCCl3950,龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonae) ATCC14472，偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)ATCC6481,戈登分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)ATCC14470,金色分枝桿菌(Mycobacterium aurum)ATCC23366，新金色分枝桿菌(Mycobacteriumneoaurum) ATCC25795，海分枝桿菌(Mycobacterium marinum) ATCC927,微黃分枝桿菌(Mycobacterium gilvum)ATCC43909，愛知分枝桿菌(Mycobacterium aichiense)ATCC27280，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)ATCC19420,副偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium parafortuitum)ATCC19686，枝母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)ATCC15483，鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium) ATCC25291,草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)ATCCl1758，瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)ATCC19981,胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)ATCCl5754,次要分枝桿菌(Mycobacteriumtriviale)ATCC23292，蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)ATCC19250,月農(nóng)腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)ATCC19977，非洲分枝桿菌(Mycobacterium africanum)ATCC25420，卡介苗分枝桿菌(Bacilli Calmette Guerin, BCG) ATCC35735,結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra) ATCC25177，牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)ATCC19210,瑪爾摩分枝桿菌(Mycobacterium malmoense)ATCC29571，轉(zhuǎn)黃分枝桿菌(Mycobacterium flavescens) ATCC14474，迪爾諾弗枝桿菌(Mycobacteriumdiernhoferi)ATCC19340,亞洲分枝桿菌(Mycobacterium asiaticum)ATCC25276，斯塞格分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)ATCC25799,塞內(nèi)加爾分枝桿菌(Mycobacteriumsenegalense)ATCC35796，耐高溫分枝桿菌(Mycobacterium thermoresistibile)ATCC19527，楚布分枝桿菌(Mycobacterium chubuense) ATCC27278，杜氏分枝桿菌(Mycobacterium duvalii) ATCC43910，嘎地分枝桿菌(Mycobacterium gadium) ATCC27726，奧布分枝桿菌(Mycobacterium obuense) ATCC27023，羅得西亞分枝桿菌(Mycobacteriumrhodesiae)ATCC27024,泥炭蘇分枝桿菌(Mycobacterium sphagni)ATCC33027,托凱分枝桿菌(Mycobacterium tokaiense)ATCC27282,豬分枝桿菌(Mycobacterium porcinum)ATCC33776,南非分枝桿菌(Mycobacterium austroafricanum)ATCC33464,地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ATCC15755,龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonae)ATCC35752。上述標(biāo)準(zhǔn)株均能通過國內(nèi)外商業(yè)渠道購買獲得，如可在美國標(biāo)準(zhǔn)生物品保藏中心(American type culture collect1n, ATCC)購買。
[0020]通過本發(fā)明的分枝桿菌的鑒定方法能準(zhǔn)確區(qū)分表型分型和16S rDNA基因分型不能明確鑒定的菌株，包括鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和龜分枝桿菌等。胺腫分枝桿菌和M.massiIiense的16srRNA編碼基因、16s_23srRNA間區(qū)(ITS)、hsp65和rpoB基因序列幾乎完全相同，而其rpsA基因相似度98.7%，能用于區(qū)分這兩種分枝桿菌；某些分枝桿菌(如M.celatum和M.terrae)的16s rRNA編碼基因?yàn)槎嗫截?，但rpsA基因?yàn)閱慰截?，能避免由于靶基因多拷貝而難以判定菌種鑒定結(jié)果。
[0021]胞內(nèi)分枝桿菌待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度97.9%-100%,鳥分枝桿菌待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度96.7%-100%，膿腫分枝桿菌待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度97.9%-100%，堪薩斯分枝桿菌待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度95.1%-100%,戈登分枝桿菌待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度97.9%-100%，偶然分枝桿菌待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度97.9%-100%，結(jié)核分枝桿菌待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度99.8%-100%。因此rpsA基因可用于分枝桿菌的菌種鑒定，以與標(biāo)準(zhǔn)株序列相似度大于97%為界，能鑒定絕大多數(shù)常見的非結(jié)核分枝桿菌待測菌株。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明利用rpsA基因?qū)Σ煌墙Y(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0023]圖2為本發(fā)明利用rpsA基因?qū)Υ郎y菌株110以及不同種的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行多序列重排的結(jié)果；
[0024]圖3為本發(fā)明利用rpsA基因?qū)Υ郎y菌株110以及不同種的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0025]圖4為本發(fā)明利用rpsA基因?qū)Υ郎y菌株213以及不同種的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行多序列重排的結(jié)果；
[0026]圖5為本發(fā)明利用rpsA基因?qū)Υ郎y菌株213以及不同種的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面將通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的描述。
[0028]本發(fā)明的分枝桿菌的鑒定方法，包括如下步驟:
[0029]S10、分別擴(kuò)增多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因，所用的引物序列為:正向引物:5’CCCTACATCGGCAAGGAG3’，位于結(jié)核分枝桿菌的rpsA基因的487 - 504位置，gene bank號為NC_000962.2 ;反向引物:5’TGTCGATGACCTTGACCATC3’，位于結(jié)核分枝桿菌的rpsA基因的1032 - 1051 位置，gene bank 號為 NC_000962.2 ；
[0030]S20、對擴(kuò)增后的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因進(jìn)行測序；
[0031]S30、對待鑒定的臨床分離株的rpsA基因用步驟SlO中的引物進(jìn)行擴(kuò)增并測序；
[0032]S40、對擴(kuò)增后的rpsA基因進(jìn)行多序列重排，根據(jù)臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)株的序列相似度判斷臨床分離株所屬菌種。
[0033]優(yōu)選的，為了建立足夠豐富的標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因序列庫，步驟SlO中擴(kuò)增43種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，所述43種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為:胞內(nèi)分枝桿菌ATCC13950,龜分枝桿菌ATCC14472，偶發(fā)分枝桿菌ATCC6481，戈登分枝桿菌ATCC14470，金色分枝桿菌ATCC23366,新金色分枝桿菌ATCC25795，海分枝桿菌ATCC927，微黃分枝桿菌ATCC43909，愛知分枝桿菌ATCC27280，恥垢分枝桿菌ATCC19420，副偶發(fā)分枝桿菌ATCC19686，母牛分枝桿菌ATCC15483，鳥分枝桿菌ATCC25291，草分枝桿菌ATCC11758，瘰疬分枝桿菌ATCC19981,胃分枝桿菌ATCC15754,次要分枝桿菌ATCC23292,蟾分枝桿菌ATCC19250,膿腫分枝桿菌ATCC19977，非洲分枝桿菌ATCC25420，卡介苗分枝桿菌ATCC35735，結(jié)核分枝桿菌H37Ra ATCC25177,牛分枝桿菌ATCC19210,瑪爾摩分枝桿菌ATCC29571,轉(zhuǎn)黃分枝桿菌ATCC14474，迪爾諾弗枝桿菌ATCC19340，亞洲分枝桿菌ATCC25276，斯塞格分枝桿菌ATCC25799，塞內(nèi)加爾分枝桿菌ATCC35796，耐高溫分枝桿菌ATCC19527，楚布分枝桿菌ATCC27278，杜氏分枝桿菌ATCC43910，嘎地分枝桿菌ATCC27726，奧布分枝桿菌ATCC27023,羅得西亞分枝桿菌ATCC27024，泥炭蘚分枝桿菌ATCC33027，托凱分枝桿菌ATCC27282,豬分枝桿菌ATCC33776,南非分枝桿菌ATCC33464,地分枝桿菌ATCC15755,龜分枝桿菌ATCC35752。
[0034]優(yōu)選的，步驟S30中使用CLUSTAL2.1軟件對待鑒定臨床分離株擴(kuò)增后的rpsA基因進(jìn)行多序列重排。
[0035]為了更簡便的鑒定出臨床分離株所屬菌種，優(yōu)選在步驟S20與步驟S30之間還包括步驟S25:對擴(kuò)增后的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的rpsA基因測序后，建立包含多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的進(jìn)化樹；并且步驟S30中判斷臨床分離株所屬菌種后，參照所述進(jìn)化樹進(jìn)行一步比對證實(shí)。
[0036]為了更簡便快速的建立進(jìn)行化，步驟S25中優(yōu)選使用Mega5.05軟件建立包含多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的進(jìn)化樹。
[0037]以上實(shí)施例的先后順序僅為便于描述，不代表實(shí)施例的優(yōu)劣。
[0038]實(shí)施例1
[0039]1、擴(kuò)增臨床分離株110并測序，序列如下:
[0040]ATCGAGGCCAAGATCATCGAGCTGGACAAGAACCGCAACAACGTGGTGCTGAGCCGCCGCGCCTGGCTGGAGCAGACCCAGTCCGAGGTGCGCAGCGAGTTCCTCAACCAGCTGCAGAAGGGTGCCATCCGCAAGGGTGTCGTCTCCTCGATCGTCAACTTCGGCGCCTTCGTCGATCTCGGCGGTGTCGACGGCCTGGTCCACGTGTCCGAGCTGTCCTGGAAGCACATCGATCACCCGTCCGAGGTGGTTCAGGTGGGCGACGAGGTCACCGTCGAGGTGCTCGACGTCGACATGGATCGCGAGCGGGTTTCGCTGTCGCTCAAGGCGACTCAGGAAGACCCGTGGCGCCACTTCGCCCGCACCCACGCGATCGGTCAGATCGTGCCGGGCAAGGTCACCAAGCTGGTGCCGTTCGGTGCGTTCGTCCGCGTCGAGGAGGGCATCGAGGGTCTGGTGCACATCTCGGAGCTGTCCGAGCGCCACGTCGAGGTCCCGGACCAGGTGGTCCAGGTCGGCGACGACGC (SEQID NO:3)
[0041] 2、使用CLUSTAL2.1軟件對臨床分離株110的rpsA基因進(jìn)行多序列重排，并比對與標(biāo)準(zhǔn)株的相似度(與偶然分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相似度100%)，初步鑒定為偶然分枝桿菌(圖2)。
[0042]3、進(jìn)化樹進(jìn)一步證實(shí)為偶然分枝桿菌(圖3)。
[0043]實(shí)施例2
[0044]1、擴(kuò)增臨床分離株213并測序，序列如下:
[0045]ATCGAGGCCAAGATCATCGAGCTGGACACAGACCGCAACAACGTGGTGCTGTCGCGCCGGGCGTGGCTGGAGCAGACGCAGTCCGAGGTGCGCAGCGAGTTCCTCAACCAGCTGCAGAAGGGCGCCATCCGCAAGGGTGTCGTCTCCTCCATCGTCAACTTCGGTGCGTTCGTCGACCTCGGCGGCGTCGACGGTCTGGTGCACGTCTCCGAGCTGAGCTGGAAGCACATCGACCACCCGTCCGAGGTGGTCCAGGTCGGCGACGAGGTCACCGTCGAGGTGCTCGATGTCGACATGGACCGCGAGCGGGTTTCGTTGTCGCTCAAGGCGACTCAGGAAGACCCGTGGCGCCACTTCGCCCGCACCCACGCCATCGGCCAGATCGTGCCCGGCAAGGTCACCAAGCTGGTTCCGTTCGGCGCGTTCGTCCGCGTCGAGGAGGGCATCGAGGGCCTGGTGCACATTTCGGAGCTGGCCGAGCGCCACGTCGAGGTCCCCGACCAGGTGGTTGCCGTCGGCGACGACGC (SEQID NO:4)。
[0046]2、使用CLUSTAL2.1軟件對臨床分離株213的rpsA基因進(jìn)行多序列重排，并比對與標(biāo)準(zhǔn)株的相似度(與胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相似度98.3%)，初步鑒定為胞內(nèi)分枝桿菌(圖4)。
[0047]3、進(jìn)化樹進(jìn)一步證實(shí)為胞內(nèi)分枝桿菌(圖5)。
[0048]最后應(yīng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.rpsA基因在分枝桿菌菌種鑒定中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述rpsA基因通過包括正向引物和反向引物的通用引物對擴(kuò)增獲得。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中通用引物對，其中所述正向引物如SEQID No:l所示，所述反向引物如SEQ ID No:2所示。
4.通用引物對，其特征在于所述通用引物對包括正向引物和反向引物，其用于擴(kuò)增分枝桿菌Mycobacterium的rpsA基因,其中所述正向引物如SEQ ID No:1所示,所述反向引物如SEQ ID No:2所示。
5.一種分枝桿菌的種屬鑒定方法，該方法利用權(quán)利要求4所述通用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得待測菌株的rpsA基因片段，測序后比對從而鑒定待測菌株的種屬。
6.權(quán)利要求5所述方法，該方法包括如下步驟: a)以待測菌株的基因組DNA為模板，以正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增所得DNA片段進(jìn)行回收、純化、測序，得rpsA基因序列； b)根據(jù)序列測定結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得鑒定結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于， 所述步驟b)為:將序列測定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中所有的分枝桿菌的rpsA基因序列進(jìn)行BLAST比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得鑒定結(jié)果；或者， 所述步驟b)為:利用Clustal X軟件對待測菌株的rpsA基因序列進(jìn)行多序列重排；其間同時加入不同分枝桿菌菌種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的rpsA基因序列，利用MEGA軟件建立包含多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與待測菌株親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株所對應(yīng)的種，即為該菌株所屬的種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述方法，其特征在于， 步驟a)中PCR擴(kuò)增的具體操作為:擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μ 1，正向引物濃度及反向引物濃度分別為20pmol，模板DNA50ng，Taq酶IU，脫氧核苷三磷酸終濃度250 μ M，MgCl2終濃度1.5mM ;擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95°C變性5分鐘，之后循環(huán)30次(95°C 30秒，56°C 30秒，72°C 30秒)，72°C延伸5分鐘。
9.一種分枝桿菌的分類鑒定試劑盒，其特征在于應(yīng)用rpsA基因進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，包括直接檢測rpsA基因的PCR技術(shù)或以此基礎(chǔ)為基礎(chǔ)的其它檢查技術(shù)。
10.按照權(quán)利要求9所述的分枝桿菌的分類鑒定試劑盒，其特征在于包含SEQID No:1所示的正向引物和SEQ ID No:2所示的反向引物，還包括dNTPs、10XBuffer、rTaq DNA聚合酶和超純水。
【文檔編號】C12Q1/04GK104164475SQ201310185213
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】黃海榮, 劉冠, 段鴻飛, 姜廣路, 戴廣明 申請人:黃海榮