專利名稱：鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)的領(lǐng)域，更具體涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
鷹嘴豆殼二孢葉枯病由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起,是一種毀滅性的病害。1911年，鷹嘴豆殼二孢葉枯病在巴基斯坦被首次發(fā)現(xiàn)，該病害的危害性很高，在鷹嘴豆的重要種植區(qū)巴基斯坦，年受害面積高達25-50%。冷涼的氣候非常適合病害發(fā)展，常造成100%的產(chǎn)量損失。2007年，該病害在新疆北部的鷹嘴豆主栽區(qū)昌吉州木壘縣、奇臺縣等地暴發(fā)，其中僅在木壘縣發(fā)病面積為4000hm2，平均為害株率46%，嚴重田塊為害株率達到100%，產(chǎn)量損失率為40% -50%。該病害主要危害葉片、葉柄、莖桿，也可侵染幼嫩的莢果。葉片被害后由葉緣向內(nèi)擴散，形成“U”形或“V”形淺褐色至深褐色病斑，潮濕時病斑上產(chǎn)生分散的細小黑點，葉柄和莖桿受害初期產(chǎn)生水浸狀病斑，隨后病斑逐漸變?yōu)樯詈稚?，病斑處凹陷并逐漸萎蔫干枯造成落葉斷枝，嚴重時整株枯萎死亡。豆莢受害初期產(chǎn)生水浸狀病斑，然后變成深褐色病斑，嚴重時豆莢干枯。雨水偏多年份，發(fā)病嚴重，產(chǎn)量損失極大。因此，開展鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌檢測，防止其從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，以及在其發(fā)病初期進行診斷檢測，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病的傳播與控制具有重要意義。自從發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆殼二孢葉枯病以來，各國研究人員便對其檢測技術(shù)進行研究。傳統(tǒng)的檢測方法是從病殘體或帶病種子分離菌體，將其接種在相應培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天，再對這些菌體的形態(tài)進行觀察。若產(chǎn)孢則繼續(xù)觀察分生孢子的形態(tài)特征，從菌落上挑片鏡檢，觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)。從而確定是否存在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助顯微鏡技術(shù)對發(fā)病癥狀進行判定是否由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的病害。傳統(tǒng)的檢測方法不僅操作繁瑣、費時，而且要求有高度的 專業(yè)知識，最重要一點是它不能滿足病害防治中制定最佳防治時期及海關(guān)進出境快速檢測和鑒定的需求。基因芯片技術(shù)雖然能夠同時進行多種真菌的鑒定，但成本高，制約了其發(fā)展；雜交方式固有的局限性影響了其特異性；質(zhì)譜技術(shù)以其快速準確的優(yōu)點被用于微生物鑒定，由于質(zhì)譜鑒定必須是培養(yǎng)后分純的單克隆菌落，而且設(shè)備昂貴，操作難度高，因此，限制了其應用。隨著生物學技術(shù)的發(fā)展，基于rDNA-1TS的長度多態(tài)性和序列多態(tài)性的序列分析，由于可以從不太長的核酸序列中獲得相對足夠的信息用來反應生物親緣關(guān)系與分類情況，因而成為真菌分類及鑒定研究的熱點，目前已廣泛應用于真菌的屬種間及種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學研究。真菌核糖體DNA(rDNA)上的保守序列廣泛，有著不同的進化水平的區(qū)域序列，可用于不同等級的真菌分類鑒定。核糖體DNA上的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS是存在于18S rDNA,5.8S rDNA和28S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域受外界環(huán)境因素的影響小，與編碼區(qū)相比具有進化速度快的特點，在種內(nèi)的不同菌株之間高度保守，而在真菌種間存在極大的變化，表現(xiàn)出極大的序列多態(tài)性，可以為真菌學的研究提供豐富的遺傳信息。因此，應用PCR技術(shù)對病原菌進行特異、靈敏快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內(nèi)外有學者利用基于ITS堿基序列設(shè)計引物對真菌的分子檢測開展研究，但針對Ascochyta rabiei的研究尚少。因此要對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei進行高特異性檢測，從病原菌ITS堿基序列設(shè)計高特異引物并建立一種快速檢測的體系及試劑盒是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌的生物學檢測方法所需周期長、準確度低等問題，提供一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒包括A液(PCR反應液):含染料的2XTaq PCR MasterMix、上游引物7-5f (20 μ Μ)、下游引物7-5r (20 μ Μ)、超純水；Β液(陽性對照)為鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌標準株DNA。采用利用該試劑盒在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原真菌DNA、鷹嘴豆殼二孢葉枯病病殘體、帶病土壤及帶病種子中均能特異地擴增出片段長度為440bp的特異擴增產(chǎn)物的方法進行檢測。本發(fā)明所述的試劑盒用于生產(chǎn)實踐中被鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌感染的植物組織、土壤及種子的快速、靈敏、特異的檢測，同時用于田間病害的早期監(jiān)測，也可為海關(guān)進出口鷹嘴豆所攜帶的鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌高靈敏快速分子檢測和鑒定。利用鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測試劑盒進行檢測，其結(jié)果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高。該試劑盒還可用于帶菌的植物組織、帶菌土壤及帶菌種子的高靈敏度快速分子檢測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的檢測試劑盒，該試劑盒為:A液PCR反應液和B液陽性對照組成；其中A液為PCR反應液是由含染料的2 X Taq PCR MasterMix，上游引物7_5f20 μ M)，下游引物7-5r20yM，超純水重量濃度> 99%組成；B液為陽性對照:鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌標準株DNA，DNA濃度為IOOng/ μ L。所述試劑盒中A液中的上游引物為7_5f25bp:5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物為 7_5r23bp:5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。所述試劑盒中A液中含染料的2XTaq PCR MasterMix中包含Taq DNA聚合酶0.05units/ μ L,氯化鎂4mM,脫氧核酸三磷酸基質(zhì)0.4mM,其中脫氧核酸三磷酸基質(zhì)由dATP, dCTP，dGTP, dTTP四種脫氧核糖核酸組成，購自北京莊盟生物基因科技有限公司，貨號為 ZT201-02，L0T#1BH09N。所述的鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的檢測試劑盒的檢測方法，按下列步驟進行:a、待檢樣品或真菌的DNA提取，采用常規(guī)真菌DNA提取方法；b、取步驟a所得DNA模板I μ L，A液24 μ L，進行PCR反應，PCR反應條件:溫度94°C預變性5min，溫度94。。，變性50s，溫度57.5°C，退火50s，72延伸2min，共30各循環(huán)，最后溫度72°C，lOmin，溫度4°C保存；c、將擴增產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。 本發(fā)明中針對特異檢測鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為:
上游引物7-5f(25bp):5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下游引物7-5r(23bp):5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'；該引物由下載GenBank已公開報道Ascochyta rabiei的同屬其它ITS序列，登錄號分別為 AY152550, DQ822479, DQ822480, EU167600, FJ032643, HQ700312, JF714463，將其與測得的鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS序列利用DNAMAN軟件進行比較(

圖1)，選定特有的一段保守序列，即ITS序列的l-440bp，并根據(jù)其利用primerf.0軟件設(shè)計一對針對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的特異引物即特異分子檢測引物7-5f/7-5r，引物序列為 :上游引物7-5f(25bp):5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下游引物7-5r(23bp):5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'序列比對結(jié)果:AY152550.....ATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCCCGCTAC35DQ822479····g----------------------------------------------------------------------36DQ822480····g----------------------------------------------------------------------36EU167600 gaagg----------------------------------------------------------------------1720FJ032643 gaagg----------------------------------------------------------------------58HQ700312 gaagg-------------------------------1------59JF714463.......ggggct----c_g_a------------------------------------33ITS................................................8AY152550 CTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGCG75DQ822479 --------------------------------------------------------------------------------76DQ822480 --------------------------------------------------------------------------------76EU167600 --------------------------------------------------------------------------------1760FJ032643 --------------------------------------------------------------------------------98HQ700312 --------------------------------------------------------------------------------99JF714463 --------------------------------------------------------------------------------73ITS--------------------------------------------------------------------------------48AY152550 GGTCCGCCCGCCGATTGGACAAAATCAAACCCTTTGCAGT115DQ822479 --------------------------------------------------------------------------------116DQ822480 --------------------------------------------------------------------------------116EU167600 --------------------------------------------------------------------------------1800FJ032643 --------------------------------------------------------------------------------138HQ700312 --------------------------------------------------------------------------------139JF714463 --------------------------------------------------------------------------------113ITS--------------------------------------------------------------------------------88AY152550 TGCAATCAGCGTCTGAAAAACATAATAGTTACAACTTTCA155DQ822479 --------------------------------------------------------------------------------156DQ822480 --------------------------------------------------------------------------------156EU167600 --------------------------------------------------------------------------------1840
權(quán)利要求
1.一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒為A液PCR反應液和B液陽性對照組成；其中 A液為PCR反應液，由含染料的2XTaq PCR MasterMix，上游引物7_5f20 μ M，下游引物7-5r20yM，超純水重量濃度> 99%組成； B液為陽性對照鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌標準株DNA，DNA濃度為IOOng/ μ L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于A液中的上游引物為7-5f25bp 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物為 7_5r23bp 5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于A液中含染料的2XTaqPCR MasterMix中包含Taq DNA聚合酶O. 05units/ μ L,氯化鎂4mM,脫氧核酸三磷酸基質(zhì)O. 4mM,其中脫氧核酸三磷酸基質(zhì)由dATP，dCTP，dGTP，dTTP四種脫氧核糖核酸組成，購自北京莊盟生物基因科技有限公司，貨號為ZT201-02，L0T#1BH09N。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于按下列步驟進行 a、待檢樣品或真菌的DNA提取，采用常規(guī)真菌DNA提取方法； b、取步驟a所得DNA模板Iμ L，A液24 μ L，進行PCR反應，PCR反應條件溫度94°C預變性5min，溫度940C，變性50s，溫度57. 5°C，退火50s，72延伸2min,共30各循環(huán)，最后溫度72°C，10min，溫度4°C保存； C、將擴增產(chǎn)物于1%瓊 脂糖凝膠電泳檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒包括A液(PCR反應液)含染料的2×Taq PCR MasterMix、上游引物7-5f(20μM)、下游引物7-5r(20μM)、超純水；B液(陽性對照)為鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌標準株DNA，采用利用該試劑盒在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原真菌DNA、鷹嘴豆殼二孢葉枯病病殘體、帶病土壤及帶病種子中均能特異地擴增出片段長度為440bp的特異擴增產(chǎn)物的方法進行檢測。本發(fā)明所述的試劑盒用于生產(chǎn)實踐中被鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌感染的植物組織、土壤及種子的快速、靈敏、特異的檢測，同時用于田間病害的早期監(jiān)測，也可為海關(guān)進出口鷹嘴豆所攜帶的鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌高靈敏快速分子檢測和鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK103215374SQ20131018630
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者馬德英, 馬麗娟, 羌松 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學