專利名稱：鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的方法及其專用引物對(duì)sr-1×3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的方法及其專用引物對(duì)SR-1X3。
背景技術(shù)：
營養(yǎng)不親和系統(tǒng)是一種識(shí)別異己的遺傳系統(tǒng)，在多數(shù)真菌中，該系統(tǒng)能引起遺傳上明顯不同的個(gè)體在交接區(qū)產(chǎn)生特征性的體細(xì)胞不親和性(戚元成等，中國栽培糙皮側(cè)耳品種體細(xì)胞不親和性實(shí)驗(yàn)與RAro分析結(jié)果的比較.菌物學(xué)報(bào)，2010，29 (3))反應(yīng)，體細(xì)胞不親和性反應(yīng)的強(qiáng)度因個(gè)體不同而異。在真菌中，營養(yǎng)不親和又稱為體細(xì)胞不親和或異核體不親和，它的作用在于防止同一種內(nèi)交配型不同的個(gè)體或營養(yǎng)不親和位點(diǎn)上基因不同的個(gè)體間的融合，以保持個(gè)體遺傳上的穩(wěn)定性。交配型是根據(jù)交配因子的個(gè)體間能否完成交配結(jié)合而確定的結(jié)合類型(中國標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室，中國農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編(食用菌卷).中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010)。在真菌的有性生殖和營養(yǎng)生長過程中都存在一個(gè)自己或異己識(shí)別的機(jī)制或系統(tǒng)。有性生殖階段靠交配型因子識(shí)別；而營養(yǎng)生長階段的識(shí)別是靠異核體不親和系統(tǒng)來進(jìn)行的。異核體不親和性是普遍存在于真菌中的一種生物學(xué)現(xiàn)象，在子囊菌、擔(dān)子菌、接合菌等真菌中是一種普遍存在的現(xiàn)象。在異核體形成過程中，非己識(shí)別系統(tǒng)通過一系列蛋白因子的相互作用最終導(dǎo)致遺傳背景不同的核不能形成穩(wěn)定的異核體，也就是所謂的異核不親和性。異核體不親和性是一個(gè)受基因調(diào)控的過程并且往往異核體不親和性的菌絲體會(huì)死亡。異核菌絲體在原生質(zhì)體制備過程中出現(xiàn)單核原生質(zhì)體的現(xiàn)象。這些單核原生質(zhì)體經(jīng)過再生培養(yǎng)和遺傳篩選成為原生質(zhì)體單核體，由于原生質(zhì)體單核體是直接來源于營養(yǎng)菌絲，沒有經(jīng)歷過減數(shù)分裂的無性后代，它為食用菌的遺傳和育種研究提供了一種十分重要的基礎(chǔ)材料。原生質(zhì)體單核體的雜交育種方式是把兩個(gè)分別來自雙核親本的原生質(zhì)體單核體兩兩接入同一 PDA平板，對(duì)峙培養(yǎng)進(jìn)行雜交。在雜交過程中，兩個(gè)原生質(zhì)體單核體的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行重組，形成一個(gè)異質(zhì)異核的雜交后代。這一方法的主要特點(diǎn)是，根據(jù)親本性狀不易在原生質(zhì)體單核體中分散和稀釋，在育種程序中可以從一個(gè)比較小的變異范圍內(nèi)去選擇具有親本性狀的不育單核體，有效地克服了傳統(tǒng)育種過程中由孢子單核體遺傳多樣性所造成的親本性狀分散和選材困難的障礙，減少了篩選雜交后代的工作量。同時(shí)，由于原生質(zhì)體單核體是在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得的，無季節(jié)性限制，因此縮短了育種時(shí)間?；樝隳?Lepistasordida)屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香蘑屬(Lepista)。該菌營養(yǎng)豐富，具有一定的藥用功效。在中國主要分布于貴州、黑龍江、遼寧、河北、河南、甘肅、青海、四川、新疆、山西、內(nèi)蒙古和福建等地，是一種名貴的食用菌和藥用菌，人工栽培花臉香蘑還處于小規(guī)模試驗(yàn)階段，野生產(chǎn) 量低且稀少，其價(jià)格極其昂貴，是一種很有開發(fā)潛力的野生菌種。但實(shí)際生產(chǎn)中存在產(chǎn)量低，抗蟲能力差，適應(yīng)溫度范圍窄，子實(shí)體易碎，不易運(yùn)輸、保存等亟待解決的難題。這就要求花臉香蘑的遺傳育種相關(guān)的基礎(chǔ)研究加大力度，為傳統(tǒng)的遺傳育種奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的方法及其專用引物對(duì)SR-1 X 3。本發(fā)明所提供的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的PCR引物對(duì)，名稱為SR-1 X 3，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。其中，SEQ ID N0.1由20個(gè)脫氧核苷酸組成，SEQ ID N0.2由23個(gè)脫氧核苷酸組成。含有PCR引物對(duì)SR-1 X 3的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的試劑或試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述試劑或試劑盒除PCR引物對(duì)SR-1 X 3外，還含有進(jìn)行PCR和DNA測序的其它常規(guī)試劑。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明PCR引物對(duì)SR-1 X 3、含有PCR引物對(duì)SR-1 X 3的試劑或試劑盒
可用于鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型。本發(fā)明所提供的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的方法，包括如下步驟:分別以待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)SR-1 X 3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測所得到的PCR產(chǎn)物的大小，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小按照下述方法確定所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體 的交配型:如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物均含有500bp_800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物均為500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同或候選為交配型相同，如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物均不含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物均不為大小是500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同或候選為交配型相同；如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體中的一株待鑒別的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體中的一株待鑒別的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物為500bp-800bp的DNA片段)，另一株待鑒別的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物不含有500bp-800bp的DNA片段(或另一株待鑒別的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物不為500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型不同或候選為交配型不同。上述方法中，所述500bp-800bp的DNA片段具體為786bp的DNA片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件為57°C退火30s。所述PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序如下:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，57°C退火30s, 72°C延伸 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。上述方法中，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同是指將所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體在一起培養(yǎng)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲之間不產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合；所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型不同是指將所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體在一起培養(yǎng)，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲之間產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合。上述方法中，所述花臉香蘑具體可為花臉香蘑(lepista sordida) CFCC89562。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的特異性引物對(duì)SR-1X3對(duì)花臉香蘑原生質(zhì)體單核體具有特異性，本發(fā)明利用PCR引物對(duì)SR-1X3鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體間的交配型是否相同的方法與現(xiàn)有的體細(xì)胞不親和性實(shí)驗(yàn)方法鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體間的交配型是否相同的方法的一致性為100%。本方法縮短了花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的鑒別時(shí)間并簡化了交配型鑒別的步驟，其準(zhǔn)確性和可靠性高。通過原生質(zhì)體單核化獲得的單核體稱為原生質(zhì)單核體，與孢子單核體不同，原生質(zhì)體單核體是在原生質(zhì)體制備過程中從花臉香蘑異核菌絲體中直接得到的單核單倍體的無性后代，因此花臉香蘑的原生質(zhì)單核體只有兩種形式的交配型AxBx和AyBy兩對(duì)。在常規(guī)的雜交育種中，只有交配型不同的單核菌株是雜交可育的，因此交配型的鑒定是雜交育種的前提和必要條件。本發(fā)明對(duì)研究花臉香蘑的遺傳育種及生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。本發(fā)明適用于食用菌生產(chǎn)、菌種選育等相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域?qū)樝隳⒃|(zhì)體原生質(zhì)單核體的鑒別及遺傳育種等方面的研究。


圖1為用本發(fā)明引物對(duì)SR-1X3對(duì)部分花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中I至12對(duì)應(yīng)的菌株依次為:110號(hào)，58號(hào)，99號(hào)，67號(hào)，55號(hào)，137號(hào)，179號(hào)，69 號(hào)，104 號(hào)，139 號(hào)，100 號(hào)，雙核菌株;M:DNA Marker。圖2為用引物SRAP-mel和SRAP_em3對(duì)花臉香蘑原生質(zhì)體單核體進(jìn)行PCR的電泳
圖?！D中，I至12對(duì)應(yīng)的菌株依次為:110號(hào)，58號(hào)，99號(hào)，67號(hào)，55號(hào)，137號(hào)，179號(hào)，69號(hào)，104號(hào)，139號(hào)，100號(hào)，雙核菌株的基因組DNA ；M:DNA Marker。圖3為交配型不同的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲之間產(chǎn)生的鎖狀聯(lián)合照片。圖中箭頭示鎖狀聯(lián)合。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的花臉香蘑均為花臉香蘑(Lepista sordida) CFCC89562,公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)林業(yè)微生物中心(中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，China Forestry Culture Collection Center 英文縮寫 CFCC,簡稱林業(yè)微生物中心)獲得。在下文中，均簡稱花臉香蘑。1、下述實(shí)施例中的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體均通過原生質(zhì)體單核化獲得，具體方法如下:1.1培養(yǎng)基MM緩沖液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為50mM馬來酸緩沖液(pH5.5);所述溶質(zhì)及其在MM緩沖液中的濃度如下:0.5M甘露醇。液體MCM培養(yǎng)基:將酵母提取物2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖20g、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀0.5g和磷酸氫二鉀Ig溶于水并用水定容至1L。固體MCM平板:在液體MCM培養(yǎng)基中添加瓊脂，使其濃度為20g/L。固體再生平板(RM)的制備方法:在液體MCM培養(yǎng)基中添加山梨醇和瓊脂，使其濃度分別為IM和20g/L。1.2原生質(zhì)體制備I)取花臉香蘑菌絲于液體MCM培養(yǎng)基中，160rpm、25°C培養(yǎng)4天(3-5天均可)，用3層無菌擦鏡紙過濾并收集菌絲，然后用0.6M甘露醇水溶液洗滌2-3次。2)將步驟I)的花臉香蘑菌絲(約Ig)懸浮于1.5%溶壁酶溶液(將1.5g溶壁酶用
0.6M甘露醇水溶液溶解并定容至IOOmL ;溶壁酶購自廣東碧德生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)出(1_8110001023)，在水浴搖床(321:、60印111)中溫浴2小時(shí)，用3層無菌擦鏡紙過濾并收集濾液。3)將步驟2)的濾液3000rpm離心IOmin并收集沉淀。4)將步驟3)的沉淀用MM緩沖液洗滌三次后，懸浮于100 μ I MM緩沖液中，即為原生質(zhì)體溶液。1.3原生質(zhì)單核體的獲得將獲得的原生質(zhì)體用麗緩沖液稀釋至濃度為IO3-1O4個(gè)/mL，均勻涂布于RM上，28 °C靜置培養(yǎng)10-14天；待生長出來單菌落后用無菌接種針轉(zhuǎn)接至固體MCM培養(yǎng)基上，28 V培養(yǎng)5-7天。將獲得的原生質(zhì)單核體依次編號(hào)，并在放大1000倍的顯微鏡(Olympus BX51)下觀察，如果沒有發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，則該菌株為花臉香蘑原生質(zhì)體單核體。共得到30株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體，它們的編號(hào)分別為36、42、50、53、55、58、61、65、66、67、69、71、72、75、81、82、86、87、88、99、100、104、110、111、113、117、119、137、139、179。2、鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型是否相同待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同是指將待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體在一起培養(yǎng)，該待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲之間不產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合；待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型不同是指將待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體在一起培養(yǎng)，該待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲之間產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合。1.3中的30株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體間的交配型按照下述體細(xì)胞不親和性實(shí)驗(yàn)方法鑒別:PDA培養(yǎng)基:200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水IOOOml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，取濾液再加20g葡萄糖和20g瓊脂，121°C滅菌20分鐘。將兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體一起接種到PDA培養(yǎng)基上，兩者之間間開2cm，25°C培養(yǎng)10天進(jìn)行觀察。如果肉眼觀察兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲長在一起， 通過顯微鏡觀察進(jìn)一步確認(rèn)交接處的菌絲沒有鎖狀聯(lián)合，該兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同。如果肉眼觀察兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲交匯的地方有拮抗線，則挑取拮抗線上的菌絲，接種至PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)5天后，再通過顯微鏡觀察是否有鎖狀聯(lián)合，若無鎖狀聯(lián)合，該兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同；若有鎖狀聯(lián)合，該兩株待鑒別交配型的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型不同。圖3顯示了交配型不同的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的菌絲之間產(chǎn)生的鎖狀聯(lián)合。按照該方法鑒別1.3得到的30株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型，結(jié)果如表I和2所示。表I和表2中，“ V ”表示兩個(gè)菌株之間體細(xì)胞不親和性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩個(gè)菌株的交配型不同X ”表示兩個(gè)菌株之間體細(xì)胞不親和性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩個(gè)菌株的交配型相同。表1.體細(xì)胞不親和性實(shí)驗(yàn)方法鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體間的交配型是否相同的結(jié)果
權(quán)利要求
1.鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的方法，包括如下步驟:分別以待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR弓丨物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測所得到的PCR產(chǎn)物的大小，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小按照下述方法確定所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型: 如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物均含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同或候選為交配型相同，如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物均不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同或候選為交配型相同；如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體中的一株待鑒別的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物含有500bp-800bp的DNA片段，另一株待鑒別的花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型不同或候選為交配型不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述500bp-800bp的DNA片段為786bp的DNA片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件為57°C退火30s。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸40s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的方法在花臉香蘑育種中的應(yīng)用。
6.鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的PCR引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)的名稱為SR-1 X 3，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。
7.含有權(quán)利要求6所述的PCR引物對(duì)的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的試劑。
8.含有權(quán)利要求6所述的PCR引物對(duì)的鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的試劑盒。
9.權(quán)利要求6所述的PCR引物對(duì)、權(quán)利要求7所述的試劑或權(quán)利要求8所述的試劑盒在鑒別或輔助鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求6所述的PCR引物對(duì)、權(quán)利要求7所述的試劑或權(quán)利要求8所述的試劑盒在花臉香蘑育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒別花臉香蘑原生質(zhì)體單核體交配型的方法及其專用引物對(duì)SR-1×3。該方法包括分別以待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測所得到的PCR產(chǎn)物的大小，如果所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的PCR產(chǎn)物均含有或均不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型相同；如果其中的一株含有500bp-800bp的DNA片段，另一株不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉香蘑原生質(zhì)體單核體的交配型不同。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103233080SQ20131018762
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者許峰, 李登進(jìn), 劉宇, 王鵬, 趙爽, 王守現(xiàn), 王蘭青, 耿小麗 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院