生產(chǎn)莫納甜和莫納甜前體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了可用于從葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸制造莫納甜或其鹽的方法和組合物。也公開了生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中間體的方法。所提供的組合物包括核酸分子、多肽、化學(xué)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。方法包括體外和體內(nèi)方法，體外方法包括化學(xué)反應(yīng)。
【專利說明】生產(chǎn)莫納甜和莫納甜前體[0001]本申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US2004/034558、國際申請日為2004年10月21日，進(jìn)入中國國家階段的申請?zhí)枮?00480034841.9，名稱為“生產(chǎn)莫納甜和莫納甜前體”的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]本申請要求2003年10月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/513，406的優(yōu)先權(quán)，該申請被全文納入作為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本公開提供了用于生產(chǎn)吲哚3-丙酮酸、2-羥基2_(吲哚-3基甲基)-4_酮戊二酸和/或莫納甜(monatin)的方法和材料。
【背景技術(shù)】
[0004]吲哚-3-丙酮酸是一種強效抗氧化劑，相信它抵消了氧氣濃度高的組織中的氧化應(yīng)激(Politi 等色氨酸研究的最近進(jìn)展”(Recent advances in Tryptophan research),G.A.Filippini 等編，Plenum Press, New York, 1996,第 291-8 頁)。吲哚丙酮酸也是作為主要的植物生長激素生長素(可擴散的生長促進(jìn)因子)的吲哚-乙酸(IAA)的產(chǎn)生途徑中的中間物。在生理過程包括頂端優(yōu)勢、向性、紙條伸長、誘導(dǎo)形成層細(xì)胞分裂和生根中，亞微克量的IAA是有活性的。園藝中用合成生長素誘導(dǎo)生根并促進(jìn)果實形成和發(fā)育。參見例如美國專利號5，843，782和5，952，231。在高濃度時，合成生長素是有效的闊葉植物除草劑?？烧J(rèn)為，通過發(fā)酵生產(chǎn)的天然生長素比化學(xué)生產(chǎn)的除草劑對環(huán)境更友好。1999年生長調(diào)節(jié)劑的全球銷售額為4億英鎊(14億美元)。除了植物相關(guān)用途以外，吲哚乙酸還用于藥物應(yīng)用。例如，美國專利號5，173，497提出，用這些化合物治療記憶損傷，如伴隨阿爾茨海默病和老年性癡呆的記憶損傷。美國專利號5，173，497中提出的機制是這些化合物抑制乙酰膽堿酯酶并提高大腦中的乙酰膽堿水平。
[0005]通過過氧化物酶催化的氧化作用由吲哚-3-乙酸產(chǎn)生吲哚-3-甲醇，且可容易地轉(zhuǎn)化成二吲哚甲烷。據(jù)報道，兩種化合物能夠消除毒素并促進(jìn)產(chǎn)生有益于女性健康的激素。氯化D-色氨酸被鑒定為非營養(yǎng)性甜味劑，對探索其它衍生物的興趣持續(xù)增加。
[0006]莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3基甲基)-4_氨基戊二酸)是天然存在的，類似于氨基酸色氨酸成分的甜味劑。它可提取自南非灌木似冬青葉硬木朔(Sclerochitonilicifolius)的根皮，作為高強度甜味劑在食品和飲料工業(yè)中有前途。關(guān)于莫納甜的專利的一些例子包括:美國專利號 5，994，559 ;4，975，298 ;5，128，164 和 5，128，482。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明涉及莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸一也稱為4-氨基-2-羥基-(IH-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者根據(jù)另一種編號系統(tǒng)，稱為4-羥基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸)，該化合物具有下式:
[0008]NH2
IOH I
o> °




LJ


n
[0009]莫納甜也有以下化學(xué)名稱:3-(1-氨基-1，3- 二羧基-3-羥基-丁 -4-基)-吲哚；
4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-谷氨酸和3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羥基丁烷-4-基)-吲哚。
[0010]莫納甜是一種天然存在的高強度甜味劑。莫納甜有四種立體異構(gòu)形式:2R, 4R( “R，R立體異構(gòu)體”或“R，R莫納甜”)；2S, 4S( “S，S立體異構(gòu)體”或“S，S莫納甜”)；2R，4S( “R，S立體異構(gòu)體”或“R，S莫納甜”)以及2S，4R( “S，R立體異構(gòu)體”或“S，R莫納甜”)。本文中，除非另有說明，“莫納甜”7是指莫納甜的所有四種立體異構(gòu)體，以及莫納甜立體異構(gòu)體任意組合的任何混合物(例如莫納甜的R，R和S，S立體異構(gòu)體的混合物)。
[0011]本發(fā)明部分基于確定從葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸，和/或通過中間體如吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(莫納甜前體，MP,莫納甜的α-酮形式)來產(chǎn)生莫納甜的幾種生物合成途徑。公開了可用于制造莫納甜、吲哚-3-丙酮酸和MP的多肽和核酸序列。因為莫納甜的有機合成需要拆分異構(gòu)體，所以可利用便宜的原料并可僅產(chǎn)生一種異構(gòu)體的生化途徑在經(jīng)濟上更有利。
[0012]可通過吲哚-3-丙酮酸、ΜΡ、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖來產(chǎn)生莫納甜(圖1)。產(chǎn)生或制造莫納甜或其中間體的方法見圖1-3和11-13，包括將底物轉(zhuǎn)化為第一種產(chǎn)物，然后將第一種產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為第二種產(chǎn)物，等等，直到產(chǎn)生所需終產(chǎn)物。
[0013]圖1-3和11-13以框顯示了可能的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物。例如，可用本文提供的方法和材料進(jìn)行一種產(chǎn)物到另一種產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到ΜΡ、ΜΡ到莫納甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸?？捎没瘜W(xué)方法或生物學(xué)方法促進(jìn)這些轉(zhuǎn)化。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指在將一種產(chǎn)物(如第一種中間體)轉(zhuǎn)變成另一產(chǎn)物(如第二種中間體)的反應(yīng)中使用化學(xué)方法或多肽。術(shù)語“化學(xué)轉(zhuǎn)化”指不由多肽主動促進(jìn)的反應(yīng)。術(shù)語“生物轉(zhuǎn)化”指由多肽主動促進(jìn)的反應(yīng)。轉(zhuǎn)化可在體內(nèi)或體外發(fā)生。當(dāng)使用生物轉(zhuǎn)化時，多肽和/或細(xì)胞能固定于支持物如化學(xué)附著于聚合物支持物上。可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何反應(yīng)器，例如在分批或連續(xù)反應(yīng)器中完成轉(zhuǎn)化。
[0014]也提供了方法，包括使第一種多肽接觸底物，制造第一種產(chǎn)物，然后使產(chǎn)生的第一種產(chǎn)物接觸第二種多肽，產(chǎn)生第二種產(chǎn)物，然后使產(chǎn)生的第二種產(chǎn)物接觸第三種多肽，產(chǎn)生第三種產(chǎn)物，例如莫納甜。所用多肽和所產(chǎn)生的產(chǎn)物見圖1-3和11-13。
[0015]公開了可用于進(jìn)行圖1-3和11-13中所示轉(zhuǎn)化的多肽及其編碼序列。在一些實施例中，具有一個或多個改變多肽的底物特異性和/或活性的點突變的多肽可用來制造莫納甜。
[0016]公開了產(chǎn)生莫納甜的分離和重組細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，如植物、動物、細(xì)菌、酵母、藻類、古菌或真菌細(xì)胞。
[0017]在具體實施例中，公開的細(xì)胞包括一種或多種(如兩種或多種、三種或多種、四種或多種，或者五種或多種)以下活性:色氨酸轉(zhuǎn)氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無 EC 號，Hadar 等，J.Bacteriol 125:1096-1104,1976 和 Furuya 等，Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93，2000)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2._)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Kohiba和Mito，《第8屆國際維生素B6和擬基催化討論會會議錄》(Proceedings of 8th International Symposium onVitamin B6and Carbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)和/ 或谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)。
[0018]在另一實施例中，細(xì)胞包括一種或多種(如兩種或多種、三種或多種、四種或多種，或者五種或多種)以下活性:吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)_羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.1)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、
1.4.1.4)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶和/或D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)。
[0019]此外，公開的細(xì)胞可包括一種或多種(如兩種或多種、三種或多種、四種或多種，或者五種或多種)以下活性:色氨酸轉(zhuǎn)氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無EC編號)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)、吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)_羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28,1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3._)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)和/或D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
[0020]能生成莫納甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接觸第一種多肽，其中第一種多肽將色氨 酸和/或吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸；本領(lǐng)域技術(shù)人員理解選擇用于此步驟的多肽理想地表現(xiàn)出適當(dāng)特異性)，所得吲哚-3-丙酮酸接觸第2種多肽，其中第2種多肽將叼丨哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP，MP接觸第3種多肽，其中第3種多肽將MP轉(zhuǎn)化成莫納甜。能用于這些轉(zhuǎn)化的示范多肽示于圖2和3。
[0021]本發(fā)明另一方面提供了組合物如MP，含有至少一種外源性核酸序列(如至少兩種、三種、四種、五種或多種外源性核酸序列)上編碼的至少兩種多肽，或有時至少三種或至少四種多肽的細(xì)胞。
[0022]本文提供的方法和材料可用于制造產(chǎn)物如莫納甜、MP、莫納甜中間體和莫納甜衍生物。莫納甜和本文所述的一些莫納甜中間體可用作甜味劑或合成莫納甜衍生物的中間體。
[0023]另一方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生莫納甜的方法。在某些實施方式中，產(chǎn)生莫納甜或其鹽的方法包括:(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，該微生物含有至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉(zhuǎn)氨酶多肽的核酸；和(b)從培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中提取莫納甜或其鹽。在某些實施方式中，醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶，EC4.1.3.16)。在其它實施方式中，該微生物選自苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosterone)、稻草假單胞菌(Pseudomonas straminea)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)和大腸桿菌(E.coli)?；蛘?，該微生物可選自棒桿菌屬(Corynebacterium)和短桿菌屬(brevibacterium)。
[0024]在其它實施方式中，培養(yǎng)基含有非離子去污劑、青霉素、青霉素衍生物(如氨芐青霉素)或其組合。非離子去污劑包括吐溫、Triton X-100或十二烷基乙酸銨。在一個實施方式中，培養(yǎng)基含有濃度小于5 μ g/L的生物素。在另一實施方式中，在培養(yǎng)微生物之前，培養(yǎng)基的PH約為pH7-pH8。此外，培養(yǎng)基可包括糖蜜、玉米漿或其組合。
[0025]在一些實施方式中，該微生物是大腸桿菌，培養(yǎng)基是Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基。在其它實施方式中，該微生物的生長需要苯丙氨酸和酪氨酸，培養(yǎng)基含有苯丙氨酸和酪氨酸。該微生物也可含有aspC和proA基因。此外`，該微生物可以是產(chǎn)生和分泌谷氨酸的谷氨酸棒桿菌。在一些實施方式中，該微生物(如谷氨酸棒桿菌)分泌莫納甜或其鹽。在另一實施方式中，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物。
[0026]在一些實施方式中，培養(yǎng)基含有色氨酸、丙酮酸，非離子去污劑(如吐溫)，青霉素，青霉素衍生物或其組合。在其它實施方式中，轉(zhuǎn)氨酶多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
[0027]此外，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生莫納甜或其鹽的方法，包括:(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌(ATCC13058);和(b)從培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中提取莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，培養(yǎng)基含有吐溫、青霉素、青霉素衍生物或其組合。
[0028]本發(fā)明的特征還有具有至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉(zhuǎn)氨酶多肽的核酸的微生物，其中所述核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合，其中所述微生物產(chǎn)生莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶，EC4.1.3.16)。在其它實施方式中，轉(zhuǎn)氨酶多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.21)。微生物可包括過量產(chǎn)生丙酮酸的微生物，和/或是硫胺營養(yǎng)缺陷型，苯丙氨酸和酪氨酸營養(yǎng)缺陷型或硫辛酸營養(yǎng)缺陷型。
[0029]在一些實施方式中，微生物選自光滑假絲酵母(Candida glabrata)、皮狀絲抱酵母(Trichosporon cutaneum)、脂解假絲酵母(Candida lipolytica)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在其它實施方式中，該微生物含有aspC基因和proA基因。在某些實施方式中，該微生物含有aspC基因和proA基因和至少一個色氨酸操縱子基因。在其它實施方式中，該微生物是大腸桿菌。在其它實施方式中，該微生物含有缺陷的F1_ATP酶基因，破壞的內(nèi)源性IipA基因，破壞的pheA基因，破壞的內(nèi)源性色氨酸酶(tna)基因和/或一種或多種色氨酸生物合成基因的兩個或多個拷貝。在一些實施方式中，該微生物過量產(chǎn)生色氨酸。在其它實施方式中，該微生物過表達(dá)ppsA基因,相對于相應(yīng)的對照微生物,3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖 7_ 憐酸(3-deoxy-D-arabino-hapatulosonic 7-phosphate acid)(DAHP)合酶活性提高，它包括編碼具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合酶活性的多肽的核酸，該核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合和/或tkt基因。在其它實施方式中，該微生物是大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌。
[0030]在一些實施方式中，該微生物還含有編碼具有色氨酸酶活性的多肽的外源性核酸。在其它實施方式中，該微生物分泌莫納甜或其鹽和/或是脂肪酸營養(yǎng)缺陷型。在其它實施方式中，該微生物是含有表達(dá)醛縮酶的核酸的細(xì)菌菌株，其中由該核酸表達(dá)的醛縮酶能夠產(chǎn)生富含立體異構(gòu)體的莫納甜混合物。在一些實施方式中，富含立體異構(gòu)體的莫納甜混合物主要是S，S莫納甜或其鹽。或者，富含立體異構(gòu)體的莫納甜混合物主要是R，R莫納甜或其鹽。在一個實施方式中，該微生物過表達(dá)至少一種編碼色氨酸攝取多肽的核酸。
[0031]在另一方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生莫納甜或其鹽的方法，該方法包括:(a)在產(chǎn)生莫納甜或其鹽的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生莫納甜或其鹽的微生物，和(b)從培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中獲得莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，該微生物分泌莫納甜或其鹽和/或是脂肪酸營養(yǎng)缺陷型。
[0032]此外，本發(fā)明也包括`鑒定能夠合成莫納甜或其鹽的細(xì)胞的方法，該方法包括:(a)在選自莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽、莫納甜或其鹽的類似物、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽的類似物，及其組合的碳/能源的存在下培養(yǎng)細(xì)胞；和(b)測試細(xì)胞生長，其中細(xì)胞生長說明細(xì)胞將碳源/能源轉(zhuǎn)化成丙酮酸，從而說明該細(xì)胞能夠合成莫納甜或其鹽。在一個實施方式中，細(xì)胞是丙酮酸營養(yǎng)缺陷型，在細(xì)胞中通過代謝碳/能源產(chǎn)生丙酮酸。在其它實施方式中，該細(xì)胞含有破壞的PykA和pykF基因。
[0033]而且，本發(fā)明的特征是鑒定能夠由色氨酸合成莫納甜或其鹽或2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸或其鹽或其組合的細(xì)胞的方法，該方法包括:(a)在不存在色氨酸而存在莫納甜或其鹽、2-羥基2 (吲哚-3-基甲基)4-酮戊二酸或其鹽或其組合的情況下培養(yǎng)色氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞；和(b)測試色氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞的生長，其中細(xì)胞生長說明該細(xì)胞能夠從莫納甜或其鹽，2-羥基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合合成色氨酸，從而說明該細(xì)胞能夠由色氨酸合成莫納甜或其鹽或2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合。
[0034]本發(fā)明的特征還有產(chǎn)生莫納甜或其鹽的方法，該方法包括:(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物選自苜蓿中華根瘤菌、睪丸酮叢毛單胞菌、稻草假單胞菌和谷氨酸棒桿菌；和(b)從培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中提取莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，該微生物未經(jīng)遺傳修飾。在其它實施方式中，培養(yǎng)基是PHB培養(yǎng)基。培養(yǎng)基也可包括色氨酸、丙酮酸、非離子去污劑、青霉素、青霉素衍生物或其組合。在一些實施方式中，該微生物是苜蓿中華根瘤菌或睪丸酮叢毛單胞菌。在其它實施方式中，該微生物是睪丸酮叢毛單胞菌，和/或培養(yǎng)基還含有色氨酸和丙酮酸。在其它實施方式中，培養(yǎng)基是TY培養(yǎng)基。培養(yǎng)基也可包含色氨酸、丙酮酸或其組合。
[0035]除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的涵義與本發(fā)明所涉及【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員所通常理解的相同。雖然在實踐本發(fā)明的過程中可采用與本文所述內(nèi)容相似或相同的方法和材料，但下面描述了合適的方法和材料。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)都被全文納入作為參考。在沖突情況下，本說明書，包括定義將控制(本發(fā)明范圍)。此外，材料、方法和實施例僅為示范性，不旨在限制。
[0036]通過以下詳述和所附權(quán)利要求書將明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1顯示用于生成莫納甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑。一種途徑通過色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一種通過吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。隨后通過MP中間體生成莫納甜。
[0038]框中所示化合物是底物和生物合成途徑中生成的產(chǎn)物。
[0039]與箭頭相鄰的組合物是輔因子或可在底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物期間使用的反應(yīng)物。所用輔因子或反應(yīng)物取決于生物合成途徑的特定步驟使用的多肽。輔因子PLP(批哆醛5'-磷酸)能催化不依賴于多肽的反應(yīng)，因此僅提供PLP可從底物進(jìn)行到產(chǎn)物。
[0040]圖2是使用MP中間體的生物合成途徑的更詳細(xì)圖?？蛑酗@示了途徑中各步驟的底物。便于底物間轉(zhuǎn)化的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過其常用名稱和酶分類(EC)號描述。
[0041]圖3顯示將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑的更詳細(xì)圖?？蛑酗@示了底物，和便于底物間轉(zhuǎn)化的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過其常用名稱和酶分類(EC)號描述。
[0042]圖4顯示一種經(jīng)化學(xué)方法產(chǎn)生MP的可能反應(yīng)。
[0043]圖5A和5B是色譜圖，顯示酶法生成的莫納甜的LC/MS鑒定。
[0044]圖6是酶法合成的莫納甜的電噴射質(zhì)譜。
[0045]圖7A和7B是酶混合物中生成的莫納甜的LC/MS/MS子離子分析色譜圖。
[0046]圖8是色譜圖，顯示酶法生成莫納甜的高分辨質(zhì)譜測量。
[0047]圖9A-9C是色譜圖，顯示(A) R-色氨酸、⑶S-色氨酸和(C)酶法生成莫納甜的手性分離。
[0048]圖10是柱狀圖，顯示IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌細(xì)胞中生成的莫納甜的相對量。(_)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。
[0049]圖11-12是示意圖，顯示用于增加莫納甜產(chǎn)量的途徑，莫納甜產(chǎn)生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
[0050]圖13是示意圖，顯示能用于增加莫納甜產(chǎn)量的途徑，莫納甜產(chǎn)生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
[0051]圖14是描述遺傳修飾的大腸桿菌7692和BW25113細(xì)胞中丙酮酸產(chǎn)量增加的圖。
[0052]圖15是描述在過量產(chǎn)生丙酮酸的培養(yǎng)基中生長的遺傳修飾的大腸桿菌7692和BW25113細(xì)胞中丙酮酸產(chǎn)量增加的圖。
[0053]圖16是從睪丸酮叢毛單胞菌(ATCC49249)中克隆的proA基因的核酸序列。
[0054]圖17是由來自睪丸酮叢毛單胞菌(ATCC49249)的基因編碼的ProA醛縮酶多肽的氨基酸序列。
[0055]序列表
[0056]所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是用標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫(核酸堿基)和三字母編碼(氨基酸)表示的。只顯示各核酸序列的一條鏈，但參照所示鏈應(yīng)理解包括互補鏈。
[0057]SEQ ID NO:1和2分別列出來自苜蓿中華根瘤菌的轉(zhuǎn)氨酶(tatA基因，在文獻(xiàn)中稱為酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶或芳族轉(zhuǎn)氨酶)的核酸和氨基酸序列。
[0058]SEQ ID NO:3和4分別列出來自類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的釀氛酸轉(zhuǎn)氨酶(2.4.1)(與tatA (SEQ ID NO:1和2)同源)的核酸和氨基酸序列。
[0059]SEQ ID NO:5和6分別列出來自類球紅細(xì)菌(35053)(新穎，根據(jù)2.4.1序列SEQID NO:3和4克隆)的轉(zhuǎn)氨酶的核酸和氨基酸序列。
[0060]SEQ ID NO:7和8分別列出來自碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的廣譜底物轉(zhuǎn)氨酶(bsat)的核酸和氨基`酸序列。
[0061]SEQ ID NO:9和10分別列出來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列。
[0062]SEQ ID NO: 11 和 12分別列出來自食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)的芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT)(通過同源性鑒定為芳族轉(zhuǎn)氨酶)的新核酸和氨基酸序列。
[0063]SEQ ID NO:13和14分別列出來自類球紅細(xì)菌(35053)的多底物轉(zhuǎn)氨酶(msa)(通過與登錄號AAAE01000093.1，bpl4743_16155和登錄號ZP00005082.1同源鑒定為多底物轉(zhuǎn)氨酶)的核酸和氨基酸序列。
[0064]SEQ ID NO:15和16列出用于克隆枯草芽孢桿菌D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(dat)基因序列的引物的核酸序列。
[0065]SEQ ID NO:17和18列出用于克隆苜蓿中華根瘤菌tatA序列的引物的核酸序列。
[0066]SEQ ID NO:19和20列出用于克隆枯草芽孢桿菌araT轉(zhuǎn)氨酶序列的引物的核酸序列。
[0067]SEQ ID NO:21和22列出用于克隆類球紅細(xì)菌(2.4.1和35053)多底物轉(zhuǎn)氨酶序列的引物的核酸序列。
[0068]SEQ ID NO:23和24列出用于克隆碩大利什曼原蟲bsat序列的引物的核酸序列。
[0069]SEQ ID NO:25和26列出用于克隆食淀粉乳桿菌araT序列的引物的核酸序列。
[0070]SEQ ID NO:27和28列出用于克隆類球紅細(xì)菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物的核酸序列。
[0071]SEQ ID NO:29和30列出用于克隆大腸桿菌aspC序列(基因序列Genbank登錄號:ΑΕ000195.1，蛋白質(zhì)序列Genbank登錄號:AAC74014.1)的引物的核酸序列。
[0072]SEQ ID NO:31和32分別列出來自大腸桿菌的芳族轉(zhuǎn)氨酶(tyrB)的核酸和氨基酸序列。
[0073]SEQ ID NO:33和34列出用于克隆大腸桿菌tyrB序列的引物的核酸序列。
[0074]SEQ ID NO: 35-40列出用于克隆具有4_羥基_2_氧戊二酸醛縮酶(KHG)(EC4.1.3.16)活性的多肽的引物的核酸序列。
[0075]SEQ ID NO:41和42列出來自大腸桿菌的色氨酸酶(tna)基因和來自弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)的酪氨酸-酹裂合酶(tpl)基因的核酸序列，它們分別編碼蛋白質(zhì) P00913 (G1:401195)和 P31013 (G1:401201)。
[0076]SEQ ID NO:43_46列出用于克隆色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物的核酸序列。
[0077]SEQ ID NO:47_54列出用于使色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶多肽突變的引物的核酸序列。
[0078]SEQ ID NO:55_64列出用于克隆具有4_羥基_4_甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)活性的多肽的引物的核酸序列。
[0079]SEQ ID NO:65和66列出來自睪丸酮叢毛單胞菌的4_羥基_4_甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(ProA)的核酸和氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO:67-68列出用于在pET30Xa/LIC中具有大腸桿菌aspC的操縱子中克隆睪丸酮叢毛單胞菌4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(ρι.οΑ)的引物的核酸序列。
[0081]SEQ ID NO:69-72列出用于在pESC-his中克隆大腸桿菌aspC和睪丸酮叢毛單胞菌proA的引物的核酸序列。
[0082]SEQ ID NO:73_74列出加`到用于克隆本文所公開基因的引物5'端的核酸序列。
[0083]SEQ ID NO:75和76列出用于縮短aspC和proA基因之間的間插序列的引物的核酸序列。
[0084]SEQ ID NO:77和78列出用于在pPRONco中克隆大腸桿菌tnaA的引物的核酸序列。
[0085]SEQ ID NO:79和80列出用于在pPRONco中克隆大腸桿菌色氨酸操縱子(trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因)的引物的核酸序列。
[0086]SEQ ID NO:81和82分別列出質(zhì)粒pGX50 (來自5_甲基色氨酸抗性細(xì)胞)的trpE基因的核酸和氨基酸序列。
[0087]SEQ ID NO:83和84列出用于將含有睪丸酮叢毛單胞菌4_羥基_4_甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(ProA)和大腸桿菌aspC的操縱子克隆到棒桿菌/大腸桿菌穿梭載體pEKEX-2中的引物的核酸序列。
[0088]SEQ ID NO:85和86列出用于在大腸桿菌中產(chǎn)生pykA敲除的引物的核酸序列。
[0089]SEQ ID NO:87和88列出用于在大腸桿菌中產(chǎn)生pykF敲除的引物的核酸序列。
[0090]SEQ ID NO:89列出來自食淀粉乳桿菌的芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT)的前十個氨基酸(SEQID NO:12)。
【具體實施方式】
[0091]提供下列術(shù)語和方法的解釋以更好地描述本說明書并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實踐本發(fā)明。如本文所用，“含有”指“包括”。此外，單數(shù)形式也指復(fù)數(shù)，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，提到“含有一種蛋白”包括一種或多種這樣的蛋白，提高“含有細(xì)胞”包括一種或多種細(xì)胞和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的它的等價物，等等。術(shù)語“約”包括發(fā)生于任何測定中的實驗誤差的范圍。除非另有說明，假定所有的測定數(shù)字前面都有“約”字，即使沒有明顯地使用“約”字。
[0092]cDNA(互補DNA):缺少內(nèi)部非編碼節(jié)段(內(nèi)含子)和決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列的一段DNA?？稍趯嶒炇抑型ㄟ^提取自細(xì)胞的信使RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0093]保守取代:生化特性相似的氨基酸殘基中的一個或多個氨基酸取代(如2、5或10個殘基)。保守取代一般對得到的多肽的活性影響小或無影響。例如，包含一個或多個保守取代的色氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽理想地保持色氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性?？赏ㄟ^用，例如標(biāo)準(zhǔn)方法如定位誘變或PCR來操作編碼該多肽的核苷酸序列來產(chǎn)生含有一個或多個保守取代的多肽。
[0094]取代變體是氨基酸序列中至少一個殘基被去除，并在其位置中插入了一個不同殘基的變體?？捎脕砣〈鞍踪|(zhì)中原始氨基酸的并認(rèn)為是保守取代的氨基酸的例子包括:用絲氨酸或蘇氨酸取代丙氨酸；用谷胺酰胺、組氨酸或賴氨酸取代精氨酸；用谷氨酸、谷胺酰胺、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸取代天冬酰胺；用天冬酰胺、谷氨酸或谷胺酰胺取代天冬氨酸；用絲氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；用天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷胺酰胺；用天冬氨酸、谷胺酰胺、賴氨酸或精氨酸取代谷氨酸；用脯氨酸取代甘氨酸；用天冬酰胺、賴氨酸、谷胺酰胺、精氨酸、酪氨酸取代組氨酸；用亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代異亮氨酸；用異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；用天冬酰胺、谷氨酸、谷胺酰胺、組氨酸、精氨酸取代賴氨酸；用異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；用蘇氨酸、丙氨酸取代絲氨酸；用絲氨酸或丙氨酸取代蘇氨酸；用苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；用組氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；用甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸取代纈氨酸。參見 Ben-Bassat 等(J.Bacteriol.169:751-7，1987)，O，Regan 等(Gene77:237-51，1989)，Sahin-Toth 等(Protein Sc1.3:240-7，1994), Hochuli 等(Bio/Technology6:1321-5,1988)，W000/67796 (Curd等)或遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書，以了解關(guān)于保守取代的更多信息。`
[0095]外源性:在提到核酸和特定細(xì)胞時本文所用術(shù)語“外源性”指在天然情況下不是源自該特定細(xì)胞的任何核酸。因此，認(rèn)為在引入細(xì)胞時，非天然存在的核酸對細(xì)胞來說是外源性的。對于特定細(xì)胞而言，天然存在的核酸也可以是外源性的。例如，當(dāng)將分離自人X的細(xì)胞的整個染色體引入人Y的細(xì)胞時，它對Y的細(xì)胞來說是外源性核酸。在細(xì)胞中外源性核酸表達(dá)產(chǎn)生“外源性”蛋白。
[0096]功能等效:具有等效功能。在酶中，功能等效的分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通過酶序列中的序列改變來提供功能等效物，其中具有一個或多個序列改變的多肽保持了未改變多肽的功能(如酶活性)。在具體實施例中，色氨酸轉(zhuǎn)氨酶功能等效物保持了將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸的能力。
[0097]序列改變的例子包括但不限于:保守取代、缺失、突變、移碼和插入。在一個實施例中，給定多肽與抗體結(jié)合，功能等效物是與相同抗體結(jié)合的多肽。因此，功能等效物包括結(jié)合特異性與多肽相同的肽，可用作代替該多肽的試劑。在一個實施例中，功能等效物包括結(jié)合序列不連續(xù)、抗體與線性表位結(jié)合的多肽。因此，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO:12的氨基酸1-10) (SEQ ID NO:89)，功能等效物包括不連續(xù)的表位，可以是(**=任何數(shù)量的間插氨基酸):NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L_COOH。在這個例子中，如果該多肽的三維結(jié)構(gòu)使其可以結(jié)合能結(jié)合SEQ ID NO:12的氨基酸1-10的單克隆抗體，那么該多肽與SEQ ID NO:12的氨基酸1_10功能等效。
[0098]雜交:本文所用術(shù)語“雜交”指根據(jù)互補的單鏈DNA和/或RNA形成雙鏈體分子的能力來測試兩個核酸分子的核苷酸序列的互補性的方法。在本發(fā)明范圍內(nèi)，核酸雜交技術(shù)可用于獲得分離的核酸。簡要說，與SEQ ID NO:11所列序列或其部分有同源性的任何核酸可用作在中等至高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交鑒定相似核酸的探針。鑒定后，可純化、測序并分析該核酸，以確定它是否在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0099]可通過Southern或Northern分析進(jìn)行雜交來分別鑒定與探針雜交的DNA或RNA序列?？捎蒙锼?、洋地黃毒苷、多肽或放射性同位素如32P來標(biāo)記探針。可以在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離待分析的DNA或RNA，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其它合適的膜上，用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用探針雜交，如Samtoook等(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning),第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY 的第7.39-7.52節(jié)所述。探針的長度一般至少約20個核苷酸。例如，對應(yīng)于SEQ ID NO:11所列20個毗連核苷酸序列的探針可用于鑒定相同或相似的核酸。此外，可采用長于或短于20個核苷酸的探針。
[0100]本公開也提供了長度至少約為12個堿基(如，長度至少約13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000個堿基)并
且在雜交條件下與具有SEQ ID NO:11所列核酸序列的正義或反義鏈雜交的分離核酸序列。雜交條件可以是中等或高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。就本公開目的而言，中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件意味著在約 42°C 下在含有 25mM KPO4 (pH7.4)、5X SSC、5X Denhart 溶液、50 μ g/mL 經(jīng)超聲處理的變性鮭精DNA、50%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯和l-15ng/mL探針(約5xl07cpm/ μ g)的雜交溶液中進(jìn)行雜交，而在約50°C下用含有2X SSC和0.1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進(jìn)行洗漆。
`[0101]高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件意味著在約42°C下在含有25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5XDenhart溶液、50 μ g/mL經(jīng)超聲處理的變性鮭精DNA、50%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯和l-15ng/mL探針(約5xl07cpm/μ g)的雜交溶液中進(jìn)行雜交，而在約65°C下用含有0.2X SSC和0.1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進(jìn)行洗滌。
[0102]分離:在提及核酸時，本文所用術(shù)語“分離”指不與來源于天然存在的生物體基因組中直接毗連(一個在5'端，一個在3'端)的序列直接毗連的天然存在的核酸。例如，分離的核酸可以是，但不限于:在天然存在的基因組中，通常發(fā)現(xiàn)重組DNA分子側(cè)翼的一個核酸序列被去除或不存在的任何長度的重組DNA分子。因此，分離的核酸包括但不限于:以獨立于其它序列的分離分子(如用PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA以及摻入載體、自主復(fù)制的質(zhì)粒、病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒或皰疹病毒)或原核生物或真核生物的基因組DNA的重組DNA。此外，分離的核酸可包括作為雜交或融合核酸序列的一部分的重組DNA分子。當(dāng)提及核酸時，本文所用術(shù)語“分離”也包括任何非天然存在的核酸，因為在自然中未發(fā)現(xiàn)非天然存在的核酸序列，且在天然存在的基因組中非天然存在的核酸序列不具有直接毗連的序列。例如，非天然存在的核酸如工程改造的核酸被認(rèn)為是分離核酸?？捎闷胀ǖ姆肿涌寺〖夹g(shù)或化學(xué)核酸合成技術(shù)來制造工程改造的核酸。分離的非天然存在的核酸可以獨立于其它序列，或摻入載體、自主復(fù)制的質(zhì)粒、病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒或皰疹病毒)或原核生物或真核生物的基因組DNA。此外，非天然存在的核酸可包括作為雜交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
[0103]在例如，cDNA或基因組文庫、或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠片中，認(rèn)為存在于幾百至幾百萬其它核酸分子中的核酸不是分離核酸。
[0104]當(dāng)提及多肽時，本文所用術(shù)語“分離”指以一些方式，例如從細(xì)胞中或從以前的環(huán)境中分離的多肽。分離多肽也可指以一些方式純化的多肽。
[0105]核酸:本文所用術(shù)語“核酸”包括RNA和DNA，DNA包括但不限于cDNA、基因組DNA和合成(如化學(xué)合成)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈核酸。其中單鏈核酸可以是正義鏈或反義鏈。此外，核酸可以是環(huán)形或線狀。一個或多個核酸可存在于較大的核酸內(nèi)。例如，編碼醛縮酶多肽的核酸和編碼轉(zhuǎn)氨酶多肽的核酸可存在于較大的單一核酸內(nèi)，如基因組DNA或質(zhì)粒載體?；蛘撸幋a醛縮酶多肽的核酸和編碼轉(zhuǎn)氨酶多肽的核酸可存在于兩個不同核酸，如兩個不同質(zhì)粒載體中。[0106]操作性連接:當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列發(fā)生功能性關(guān)系時，第一核酸序列“操作性連接”于第二核酸序列。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，將啟動子操作性連接于編碼序列。通常，操作性連接的DNA序列是毗連的，當(dāng)需要時可將兩個多肽編碼區(qū)連接在相同的閱讀框中。
[0107]過度表達(dá):如果在細(xì)胞和/或微生物中產(chǎn)生的由特定核酸或基因編碼的多肽的濃度高于相應(yīng)的野生型或天然細(xì)胞和/或微生物中所產(chǎn)生的濃度，則細(xì)胞“過度表達(dá)”該特定核酸或基因。細(xì)胞可過度表達(dá)細(xì)胞中的外源性、重組或天然存在的(即天然)核酸或基因。例如，可通過在細(xì)胞中過度表達(dá)天然存在的核酸而在細(xì)胞中產(chǎn)生更高濃度的多肽，其中未遺傳修飾編碼多肽本身的核酸，但修飾或加入了指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。術(shù)語“過度表達(dá)”也可涉及過度表達(dá)的蛋白質(zhì)，即以高于相應(yīng)野生型或天然細(xì)胞和/或微生物的濃度存在于細(xì)胞和/或微生物中的蛋白質(zhì)。
[0108]多肽:多肽指與翻譯后修飾無關(guān)的氨基酸鏈。
[0109]多肽修飾:本公開包括酶，及其合成實施方式。此外，本文所述方法可采用具有所需酶活性的類似物(非肽有機分子)、衍生物(用所公開的多肽序列為起點獲得的化學(xué)功能化的多肽分子)和變體(同源物)。本文所公開的多肽包括可以是L-氨基酸和/或D-氨基酸，天然存在或非天然存在的氨基酸序列。
[0110]可通過各種化學(xué)技術(shù)修飾多肽，產(chǎn)生活性與未修飾多肽基本相同，并任選地具有其它所需特性的衍生物。例如，可以藥學(xué)上可接受的陽離子鹽，或酯化形成C1-C16酯，或轉(zhuǎn)化成式NR1R2的酰胺的形式提供多肽的羧酸基團(tuán)(羧基端或側(cè)鏈)，其中R1和R2各自獨立地為H或C1-C16烷基或者結(jié)合形成雜環(huán)如5-元環(huán)或6-元環(huán)。多肽的氨基(氨基端或側(cè)鏈)可以是藥學(xué)上可接受的酸加成鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、甲苯磺酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽和其它有機鹽形式，或可被修飾為C1-C16烷基或二烷基氨基或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酰胺的形式。
[0111]可用熟知技術(shù)將氨基酸側(cè)鏈的羥基轉(zhuǎn)化為C1-C16烷氧基或轉(zhuǎn)化為C1-C16酯?？捎靡粋€或多個鹵原子如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或這種羧酸的酰胺來取代氨基酸側(cè)鏈的苯基或酚環(huán)。氨基酸側(cè)鏈的亞甲基可以延伸到同源的C2-C4亞烷基中?？捎迷S多良好公認(rèn)的保護(hù)基團(tuán)中的任何一個，如乙酰胺基團(tuán)來保護(hù)硫醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將認(rèn)識到將環(huán)結(jié)構(gòu)引入本公開多肽中以選擇和提供對結(jié)構(gòu)的構(gòu)象約束，導(dǎo)致穩(wěn)定性提高。例如，可以向多肽加入C-末端或N-末端半胱氨酸，以致當(dāng)氧化時，該多肽將含有二硫鍵，產(chǎn)生環(huán)狀多肽。其它多肽環(huán)化方法包括形成硫醚以及羧基和氨基末端酰胺和酯。
[0112]肽模擬物和有機模擬物實施方式也是在本公開范圍之內(nèi)，這種肽模擬物和有機模擬物的化學(xué)組成的三維排列模擬肽骨架和成分氨基酸側(cè)鏈的三維排列，導(dǎo)致此公開多肽的肽模擬物和有機模擬物具有可檢測的酶活性。對于計算機建模應(yīng)用而言，使藥效團(tuán)理想化，生物活性的結(jié)構(gòu)要求的三維定義。用當(dāng)前的計算機建模軟件(用計算機輔助藥物設(shè)計或CADD)，可設(shè)計適合各藥效團(tuán)的肽模擬物和有機模擬物。參見例如Walters，《藥物的計算機輔助建?！?Computer-Assisted Modeling of Drugs),刊于 Klegerman 和 Groves (編),《制藥生物技術(shù)》(Pharmaceutical Biotechnology), 1993, Interpharm Press:BuffaloGrove, IL,第 165_74 頁和第 IO2 章，Munson (編),《藥理學(xué)原理》(Principles ofPharmacology), 1995, Chapman和Hall,用于CADD技術(shù)的說明。用這些技術(shù)制備的模擬物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一個實施例中，模擬物模擬酶或其變體、片段或融合所產(chǎn)生的酶活性。
[0113]探針和引物:可根據(jù)本文提供的氨基酸序列和核酸序列容易地制備核酸探針和引物?！疤结槨卑ê锌蓹z測標(biāo)記或報道分子的分離核酸。示范性標(biāo)記包括但不限于:放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑和多肽(如酶)。例如，SambiOOk等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual))第2版,第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,和 Ausubel等(編)《新編分子生物學(xué)實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology) ,GreenePublishing and ffiley-1nterscience, New York(定期更新)，1987 中討論了標(biāo)記方法和適合各種目的的標(biāo)記的選擇指南 。
[0114]“引物”一般是具有10個或更多個核苷酸的核酸分子(如具有約10-100個核苷酸的核酸分子)。引物可通過核酸雜交退火到互補靶核酸鏈上，在引物和靶核酸鏈之間形成雜交體，然后通過例如，DNA聚合酶多肽沿靶核酸鏈延伸。可通過例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或本領(lǐng)域已知的其它核酸擴增方法將引物對用于擴增核酸序列。
[0115]例如，在參考文獻(xiàn)如Sambrook等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ；Ausubel 等(編)，《新編分子生物學(xué)實驗指 南》(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing andffiley-1nterscience, New York(定期更新)，1987 ;和 Innis 等(編)，((PCR 方法:方法和應(yīng)用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications), Academic Press:San Diego，1990中描述了探針和引物的制備和使用方法。例如，可通過用于此目的的計算機程序如 Primer (0.5 版，? 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)從已知序列獲得PCR引物對。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，具體的探針或引物的特異性隨長度而提高，但探針或引物的尺寸范圍是序列全長到短至五個連續(xù)核苷酸的序列。因此，例如，20個連續(xù)核苷酸的引物可退火到具有特異性高于僅15個核苷酸的相應(yīng)引物的靶上。因此，為了獲得更大的特異性，探針和引物可選自例如:10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050，3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450 或更多個連續(xù)核苷酸。
[0116]啟動子:指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。啟動子包括在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型啟動子的情況下的TATA元件。啟動子可包括可位于距轉(zhuǎn)錄起始位點多達(dá)幾千堿基對的遠(yuǎn)端增強子或阻抑元件。
[0117]純化的:本文所用術(shù)語“純化的”不要求絕對純凈；而打算作為相對術(shù)語。因此，例如，純化的多肽或核酸制劑可以是主題多肽或核酸各自比在生物體的天然環(huán)境中的多肽或核酸的濃度高的多肽或核酸制劑。例如，如果制劑中多肽含量至少占總可溶性蛋白質(zhì)含量的50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%，那么可認(rèn)為該多肽制劑是純化的。
[0118]重組:“重組”核酸是一種具有(I)在表達(dá)它的生物體中不天然存在的序列或(2)由兩種分離的、較短的序列人工組合而成的序列。常常用化學(xué)合成，更常見的是如用遺傳工程技術(shù)人工操作核酸的分離節(jié)段來完成此人工組合?！爸亟M”也用于描述已人工操作的，但含有與發(fā)現(xiàn)于分離出該核酸的生物體的調(diào)節(jié)序列和編碼區(qū)相同的核酸分子?！爸亟M”多肽是由重組核酸表達(dá)的多肽。
[0119]序列同一性:用序列之間的相似性，或稱為序列同一性來表示氨基酸序列之間的相似性。常常通過同一性百分?jǐn)?shù)(或相似性或同源性)來量度序列同一性；此百分?jǐn)?shù)越高，兩個序列越相似。當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)方法比`對時，多肽的同源物或變體，如SEQ ID N0:12具有相對較高的序列同一性。
[0120]用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的。各種程序和比對算法見=Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981 ;Needleman和 Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-53,1970 ;Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444-8,1988 ;Higgins和Sharp, Gene73:237-44，1988 ；Higgins 和 Sharp, CAB10S5:151-3，1989 ；Corpet 等，NucleicAcids Researchl6:10881-90,1988;和 Altschul 等，Nature Genet.6:119-29,1994。
[0121]可從幾種來源獲得NCBI局部序列比對基本檢索工具(BLAST?) (Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-10，1990)，包括國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和Internet,與序列分析軟件 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx 聯(lián)合使用。
[0122]多肽變體一般的特征是經(jīng)缺口 blastp設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)的NCBI Blast 2.0進(jìn)行氨基酸序列全長比對計算具有至少50%序列同一性。對于比較大于約30個氨基酸的氨基酸序列而言，采用Blast2序列函數(shù)，用設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)的默認(rèn)BL0SUM62矩陣，(存在缺口損失11，每殘基缺口損失I)。當(dāng)比對短多肽(少于約30個氨基酸)時，用Blast2序列函數(shù)，用設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)的PAM30矩陣(開放缺口 9，延伸缺口罰分I)進(jìn)行比對。當(dāng)用此方法評價時，與參比序列相似性更大的多肽顯示出同一性百分?jǐn)?shù)提高，如序列同一性為至少80%、至少90%、至少95%、至少98%，甚至至少99%。當(dāng)比較少于完整序列的序列同一性時，在10-20個氨基酸的短窗口中同源物和變體的序列同一性一般至少為80%，且序列同一性可以為至少85%、至少90%、至少95%或98%，這取決于它們與參比序列的相似性。在此短窗口中確定序列同一'I"生的方法見Bethesda,Maryland的國家生物技術(shù)信息中心維護(hù)的網(wǎng)站。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，提供這些序列同一性的范圍僅是為了指導(dǎo)；完全可能獲得在所提供范圍之外的非常有效的同源物。
[0123]類似的方法可用于確定核酸序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。在具體實施例中，比對同源序列與天然序列，通過計算兩個序列中存在的相同核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)量來確定匹配數(shù)量。通過將匹配數(shù)量除以鑒定序列(如SEQ ID N0:11)中所列序列長度，或除以分節(jié)長度(如來自鑒定序列中所列序列的100個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基)，然后將得到的值乘以100來確定序列同一性百分?jǐn)?shù)。例如，與SEQ ID NO:11所列序列比對時具有882個匹配的核酸序列與SEQ ID NO:11所列序列的同一性為75.0%(即(882+1176) *100=75.0)。應(yīng)注意，序列同一性百分?jǐn)?shù)值四舍五入到最接近的十分之一。例如，75.11,75.12,75.13和75.14四舍五入到75.1，而75.15,75.16,75.17,75.18和75.19四舍五入到75.2。也應(yīng)注意，長度值總是整數(shù)。
[0124]特異性結(jié)合物:能夠特異性結(jié)合于本文所述任何多肽的物質(zhì)。例子包括但不限于:多克隆抗體、單克隆抗體(包括人源單克隆抗體)和單克隆抗體的片段如？&13、？(&13’)2和Fv片段以及能夠特異性結(jié)合于這種多肽的表位的任何其它物質(zhì)。
[0125]本文所提供的多肽的抗體可用于純化或鑒定這種多肽。本文所提供的氨基酸和核酸序列可用于生產(chǎn)識別本文所述多肽的基于特異性抗體的結(jié)合物。
[0126]可生產(chǎn)多肽、部分多肽或其變體的單克隆或多克隆抗體。多肽抗原上產(chǎn)生抗一個或多個表位的抗體宜特異性檢測該多肽。即，產(chǎn)生抗特定多肽的抗體將識別和結(jié)合該特定多肽，基本不會識別和結(jié)合其它多肽。通過許多標(biāo)準(zhǔn)免疫測定方法中的任何一種，如Western印跡(參見例如，Sa`mbrook等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)來確定抗體與特定多肽特異性結(jié)合。
[0127]為通過Western印跡測定給定抗體制劑(如在小鼠中產(chǎn)生的抗具有SEQ ID NO:12所列氨基酸序列的多肽的制劑)特異性檢測合適的多肽(如具有SEQ ID N0:12所列氨基酸序列的多肽)，從細(xì)胞中抽提細(xì)胞總蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。
[0128]然后，可將分離的細(xì)胞總蛋白轉(zhuǎn)移到膜(如硝酸纖維素)上，用抗體制劑孵育該膜。洗滌膜去除非特異性結(jié)合的抗體后，可用合適的偶聯(lián)于多肽如堿性磷酸酶的第二抗體(如抗鼠抗體)檢測存在的特異性結(jié)合的抗體，因為通過免疫定位的堿性磷酸酶應(yīng)用
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基藍(lán)四唑鎗導(dǎo)致產(chǎn)生深藍(lán)色化合物。
[0129]適合用作免疫原的基本純的多肽可獲自轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或野生型細(xì)胞。通過，例如Amicon過濾裝置濃縮將最終制劑中多肽濃度調(diào)整到幾微克/微升的水平。此外，大小范圍是全長多肽至少達(dá)9個氨基酸殘基的多肽可用作免疫原。這種多肽可在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生、可用標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)合成或可通過將大多肽切割成可純化的較小多肽而獲得。在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子如I型MHC分子或II型MHC分子的情況下，當(dāng)呈遞給免疫系統(tǒng)時，長度少達(dá)9個氨基酸殘基的多肽可具有免疫原性。因此，具有本文所公開的任何氨基酸序列的至少 9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、I100、1150、1200、1250、1300、1350或更多個連續(xù)氨基酸殘基可用作生產(chǎn)抗體的免疫原。
[0130]可根據(jù)Kohler和Milstein的經(jīng)典方法(Nature 256:495-7,1975)或其衍生方法從鼠雜交瘤制備本文所公開的任何多肽的單克隆抗體。
[0131]可通過用多肽(或其片段)免疫合適的動物來制備含有本文所公開任何多肽的異源表位的抗體的多克隆抗血清，該多肽可以是未修飾或經(jīng)修飾提高免疫原性的多肽。免疫兔的有效方法可參見 Vaitukaitis 等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33:988-91，1971)。
[0132]可用抗體片段代替整個抗體，并可在原核宿主細(xì)胞中容易地表達(dá)抗體片段。制造和使用單克隆抗體的免疫有效部分，也稱為“抗體片段”的方法是熟知的，包括 Better 和 Horowitz (Methods Enzymol.178:476-96，1989)、Glockshuber 等(Biochemistry29:1362-7, 1990)、美國專利號5，648，237 ( “功能性抗體片段的表達(dá)”(Expression of Functional Antibody Fragments))、美國專利號 4，946，778 ( “單多妝鏈結(jié)合分子”(Single Polypeptide Chain Binding Molecules))、美國專利號5，455，030 ( “采用單鏈多肽結(jié)合分子的免疫療法”(Immunotherapy Using Single ChainPolypeptide Binding Molecules))和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的方法。
[0133]轉(zhuǎn)化:“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞是通過例如分子生物學(xué)技術(shù)引入了核酸分子的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化包括可將核酸分子引入細(xì)胞的所有 技術(shù)，包括但不限于:用病毒載體轉(zhuǎn)染、接合、用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化和通過電穿孔引入裸DNA、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和基因槍加速。
[0134]變體、片段或融合多肽:所公開的多肽包括其變體、片段和融合物。經(jīng)工程改造，編碼多肽(例如SEQ ID NO:12)、融合多肽或多肽片段或變體的DNA序列(例如SEQ ID NO:
11)可在真核細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲和/或植物中表達(dá)該多肽。為了獲得表達(dá)，可改變DNA序列，且操作性連接于其它調(diào)節(jié)序列。將含有調(diào)節(jié)序列和多肽編碼序列的最終產(chǎn)物稱為載體?？蓪⒃撦d體引入真核細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和/或植物細(xì)胞。引入細(xì)胞后，該載體可產(chǎn)生所述多肽。
[0135]融合多肽可包括連接于不抑制所需多肽活性(例如，將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸的能力)的其它氨基酸序列的多肽，如芳族轉(zhuǎn)氨酶(例如，SEQ ID N0:12)。在一個實施例中，所述其它氨基酸序列的長度不超過約10、12、15、20、25、30或50個氨基酸。
[0136]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，可用不影響編碼多肽生物活性的許多方式改變DNA序列。例如，可用PCR在編碼多肽的DNA序列中產(chǎn)生變異。這種變體可以是用于表達(dá)該多肽的宿主細(xì)胞中密碼子偏好優(yōu)化的變體，或促進(jìn)表達(dá)的其它序列改變。
[0137]載體:將核酸分子引入細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞。載體可包括允許它在細(xì)胞中復(fù)制，如含有復(fù)制起點的核酸序列。載體也可包括一個或多個可選擇標(biāo)記基因和本領(lǐng)域已知的其它遺傳元件。
[0138]生物合成途徑概述
[0139]如圖1-3和11-13所示，可用許多生物合成途徑產(chǎn)生莫納甜或其中間體如吲哚-3-丙酮酸或MP。對各底物(如葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)向各產(chǎn)物(如色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫納甜)的轉(zhuǎn)化，可采用幾種不同多肽。而且，可在體內(nèi)、體外、或通過體內(nèi)反應(yīng)和體外反應(yīng)的組合，如包括無酶化學(xué)反應(yīng)的體外反應(yīng)來進(jìn)行這些反應(yīng)。因此，圖1-3和11-13是示范，顯示可用于獲得所需產(chǎn)物的多種不同途徑。
[0140]葡萄糖到色氨酸
[0141]許多生物體能從葡萄糖合成色氨酸。含從葡萄糖和/或色氨酸生成莫納甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的構(gòu)建物可克隆入這種生物體中。本文顯示色氨酸可轉(zhuǎn)化成吳納甜。
[0142]在其它例子中，用已知多肽改造生物體可產(chǎn)生色氨酸或過量產(chǎn)生色氨酸。例如，美國專利號4，371，614描述了用含野生型色氨酸操縱子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株。色氨酸操縱子基因包括編碼多肽鄰氨基苯甲酸合酶組分I (EC4.1.3.27)、鄰氨基苯甲酸合酶組分IKEC4.1.3.27)、N-(5'-磷酸核糖基)鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶(EC5.3.1.24)/吲哚-3-甘油磷酸合酶(EC4.1.1.48)、色氨酸合酶、α亞基(EC4.2.1.20)和色氨酸合酶、β亞基(EC4.2.1.20)的色氨酸生物合成基因，它們都參與從分支酸產(chǎn)生色氨酸。
[0143]美國專利號4，371，614所述色氨酸的最大效價約為230ppm。類似地，W08701130描述遺傳改造大腸桿菌菌株以生成色氨酸并討論增加發(fā)酵生產(chǎn)的L-色氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到能從葡萄糖生成色氨酸的生物體也能利用其它可轉(zhuǎn)化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，結(jié)果類似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纖維素或甘油。
[0144]提高色氨酸產(chǎn)量
[0145]在大多數(shù)生物體中色氨酸產(chǎn)量受到調(diào)節(jié)。一個機制是通過途徑中某些酶的反饋抑制。例如，提高色氨酸的水平可導(dǎo)致色氨酸產(chǎn)率降低。因此，當(dāng)采用工程改造的宿主細(xì)胞通過色氨酸中間體生產(chǎn)莫納甜時，可用對色氨酸濃度不敏感的生物體。例如，可通過重復(fù)接觸高濃度的5-甲基色氨酸來選擇耐各種色氨酸類似物的生長抑制的長春花(Catharanthusroseus)植株，如下列文獻(xiàn)所述(Schallenberg 和 Berlin, Z.Naturforsch, 34:541-5，1979)。所得植株的色氨酸合酶活性受由于基因突變產(chǎn)生的產(chǎn)物抑制的影響小。
[0146]可用類似方法選擇抗反饋的株。例如，可以通過在苯丙氨酸類似物、β -2-噻吩基丙氨酸、間_氟_D, L-苯丙氨酸和對-氟-D, L-苯丙氨酸上培養(yǎng)大腸桿菌菌株#7692 (來自E.Coli Genetic Stock Center,W3110tnaA2trpEfbrl9(Yanofsky 等，J.Bacteriol.,158:1018-1024，1984;和Doolittle和 Yanofsky，J.Bacteriol.，95:1253，1968))來選擇抗反饋的aroG DAHP (3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸)合酶的突變體。此大腸桿菌菌株#7692可產(chǎn)生可測量量的色氨酸，可用作引入外源性核酸如編碼醛縮酶和轉(zhuǎn)氨酶的核酸的起始宿主。另一大腸桿菌菌株E971(ATCC15491)是顯示DAHP合酶水平升高以及吲哚和色氨酸水平比親本菌株高的原養(yǎng)型菌株(Lim和Mateles, 1964J.Bacteriol., 87: 1051-1055) ?該菌株可用于獲得用生長培養(yǎng)基中的5-甲基色氨酸類似物降低了抗反饋的鄰氨基苯甲酸合酶(EC5.3.1.24)突變體。此菌株也可用作引入編碼醛縮酶和轉(zhuǎn)氨酶的外源性核酸的宿主。
[0147]可通過定向進(jìn)化產(chǎn)生對產(chǎn)物抑制較不敏感的多肽來優(yōu)化色氨酸產(chǎn)量。例如，可在培養(yǎng)基中不含色氨酸，但含有高濃度的不可代謝的色氨酸類似物的平板上進(jìn)行篩選。美國專利號5，756，345,4, 742，007和4，371，614描述了在發(fā)酵生物中提高色氨酸產(chǎn)量的方法。色氨酸生物合成的最后一步是將絲氨酸加在吲哚上。因此，提高絲氨酸的有效性來增加色氨酸產(chǎn)量。[0148]色氨酸生物合成的控制點是DAHP合酶。此多肽的三種同工酶由以下基因編碼:ar0F、ar0G和aroH，它們分別可被酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸反饋抑制。L-酪氨酸反饋抑制的DAHP合酶約占總酶活性的20%，L-苯丙氨酸反饋抑制的DAHP合酶約占總酶活性的80%，L-色氨酸抑制的DAHP合酶對總酶活性的貢獻(xiàn)很小。得到的酶抗反饋的突變體可提供該控制點失調(diào)的株。通常，主要的抗反饋靶是aroG和aroF。
[0149]一種分離抗反饋突變體的方法是用化學(xué)誘變或紫外線誘變并選擇在氨基酸類似物上可生長的生物體?？捎妙愃莆铴?2-噻吩基丙氨酸獲得對反饋不敏感的aroG (Duda和Sasvar1-Szekely, (1973) Acta.Biochim.Biophys.Acad.Sc1.Hung.8 (2): 81-90)。也可用類似物間-氟-D，L-苯丙氨酸(Ito 等，(1990) Agric.Biol.Chem.，54 (3): 707-713)以及對氟苯丙氨酸(Hagino 和 Nakayama, (1974) Agr.Biol.Chem., 38 (I): 157-161)產(chǎn)生對反饋不敏感的aroG。
[0150]一種獲得抗反饋的DAHP合酶的方法是用氨基酸類似物并產(chǎn)生天然基因已突變的株。另一方法是克隆編碼抗反饋的酶的基因，它能提供更大彈性，并且用不同啟動子可降低轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的可能性(Ito 等，(1990) Agric.Biol.Chem., 54 (3): 707-713)。
[0151]色氨酸生物合成中另一調(diào)節(jié)點是分支點酶鄰氨基苯甲酸合酶，在大腸桿菌中它是trpE和trpD編碼的雙組分蛋白?？捎冒被犷愃莆?-氟色氨酸和5-甲基色氨酸獲得不受色氨酸反饋抑制的突變體(Shiio 等，(1975)Agr.Biol.Chem., 39 (3):627-635)。
[0152]此外,在乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)中可能出現(xiàn)色氨酸反饋抑制鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和色氨酸合酶。然而，可使這些酶對抑制不敏感(Matsui等，(1987) J.Bacteriol.，169:5330-5332)。這種突變體可顯示色氨酸水平升高，因此，預(yù)計它能提高莫納甜水平。
[0153]細(xì)胞所用控制其合成色氨酸水平的其它方法包括在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)。在谷氨酸棒桿菌中，酪氨酸在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)DAHP合酶，通過操縱5，調(diào)節(jié)區(qū)來減輕此種調(diào)節(jié)可提高色氨酸生物合成(Shiio, 1986,《氨基酸生產(chǎn)的生物技術(shù)》(Biotechnology of AminoAcids Production), Aida, K.、Chibita, L.、Nakayama, K.、Takinami, K.和 Yamada, H.編.Elsevier).在大腸桿菌中，通過阻抑和弱化在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)色氨酸(trp)操縱子，阻抑產(chǎn)生80倍變異和弱化產(chǎn)生6-8倍變異。阻抑蛋白的TrpR多肽的失活可提高trp操縱子mRNA的水平。前導(dǎo)肽形成mRNA二級結(jié)構(gòu)，它響應(yīng)于帶電荷tRNAtap水平。5'-調(diào)節(jié)弱化區(qū)的缺失可幫助克服此額外水平的調(diào)節(jié)(Yanofsky等，J.Bacteriol.，158:1018-1024，1984)。在枯草芽孢桿菌中也觀察到色氨酸-RNA-結(jié)合弱化蛋白(TRAP)的弱化機制，通過下調(diào)或缺失編碼它的基因減輕弱化可提高此宿主生物體中的色氨酸合成(Babitzke和Gollnick，2001，J.Bacteriol.，183:5795-5802)?；蛘撸缮险{(diào)抗-TRAP 多肽的表達(dá)。
[0154]可通過在色氨酸途徑中過度表達(dá)多肽來提高色氨酸產(chǎn)量，這可提高莫納甜水平。例如，過度表達(dá)編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、aroFfbr和aroL(編碼莽草酸激酶)可提高色氨酸產(chǎn)量。然而，過度表達(dá)這些序列可引起對細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，在極限培養(yǎng)基中，細(xì)胞可分泌出各種中間體?？捎酶挥袪I養(yǎng)的培養(yǎng)基來提高色氨酸水平(Kim等，2000，J.Microbiol.Biotechnol.，10 (6):789-796)。此外，含有失調(diào)的DAHP合酶表達(dá)、失調(diào)的鄰氨基苯甲酸合酶表達(dá)和編碼磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的多拷貝質(zhì)粒的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞的色氨酸產(chǎn)量可增加到 43g/L(Katsumata 和 Ikeda, (1993)Bio/Technology,11:921-9250)。[0155]芳族氨基酸途徑中受反饋和/或轉(zhuǎn)錄控制的其它酶包括莽草酸脫氫酶(由aroE編碼)和莽草酸激酶I/II (由aroK、aroL編碼)。誘變aroE基因可提供抗反饋的酶。AroK和aroL受酪氨酸的負(fù)轉(zhuǎn)錄控制。遺傳操縱啟動子區(qū)或缺失調(diào)芐基因(trpR和tyrR)可減輕酪氨酸的控制。
[0156]苯丙氨酸和酪氨酸是芳族氨基酸，它們的生物合成可從色氨酸上轉(zhuǎn)移碳，因為分支酸是所有三種芳族氨基酸的共同前體，并且是色氨酸代謝和苯丙氨酸/酪氨酸代謝之間的分支點?？扇コ蛑袛啾奖彼岷屠野彼岬纳锖铣赏緩?，以降低分支酸消耗，這可通過遺傳敲除編碼分支酸變位酶/預(yù)苯酸(prephanate)脫氫酶的pheA或tyrA基因來完成。分支酸變位酶與鄰氨基苯甲酸合酶(trpD和trpE基因產(chǎn)物)競爭可用的分支酸。中斷或去除競爭性芳族氨基酸途徑的示范性菌株包括大腸桿菌NRRL B12262(參見實施例15)、大腸桿菌 NRRL B12258、大腸桿菌 SR250(Rothman 和 Kirsch，J Mol Biol.(2003)327，593-603)、谷氨酸棒桿菌ATCC21847 (參見實施例17)、谷氨酸棒桿菌ATCC21850、谷氨酸棒桿菌ATCC21851?；蛘?，除去除苯丙氨酸和酪氨酸途徑和需要將氨基酸加入培養(yǎng)基外，可克隆trpE基因(或整個色氨酸操縱子)并用異源啟動子過度表達(dá)trpE基因，因為鄰氨基苯甲酸合酶與分支酸的親和力高于pheA或tyrA(Dopheide等，(1972) J.Biol.Chem., 247:4447-4452)。降低碳流到苯丙氨酸和酪氨酸的另一方法是修飾它們的轉(zhuǎn)錄控制。還有，催化色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚和丙酮酸的色氨酸酶多肽的表達(dá)降低可幫助防止色氨酸喪失(Aiba等，Appl.Environ.Microbiol.,1982,43:289-297)。
[0157]在一個實施方式中，可以改造中心機制，以提高莫納甜產(chǎn)量。如本文所述，為獲得足夠的莫納甜產(chǎn)量，選擇或得到的生物體應(yīng)具有高于野生型生物體的速率生產(chǎn)色氨酸的能力。因為色氨酸不是最終產(chǎn)物，而是到莫納甜途徑中的中間體，所以開發(fā)不僅具有累積更高濃度的色氨酸能力，而且具有流量提高的菌株是至關(guān)重要的?？捎枚喾N方法來改造中心碳機制，以將碳轉(zhuǎn)移到莽草酸和分支酸途徑中，使得可以產(chǎn)生高水平的莫納甜。
[0158]芳族化合物如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成中第一步是烯醇丙酮酸磷酸(PEP)和赤蘚糖4-磷酸(E4P)縮合`形成DAHP?？捎酶鞣N方法提高各前體的有效性，并提高此第一反應(yīng)的性能。以下五種方法是用于提高PEP有效性的可能的例子。
[0159]第一，可消除通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)攝取葡萄糖對PEP的消耗。葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的失活可產(chǎn)生葡萄糖負(fù)突變體。已分離PTS_葡萄糖+突變體。它們中一些通過半乳糖透性酶、葡糖激酶和ATP轉(zhuǎn)運和磷酸化葡萄糖,不消耗PEP (Flores等，(1996) Nat.Biotechnol.,14:620-623;和 Chen 等，(1997)Biotechnol.Prog.，13:768-775)。葡萄糖透性酶系統(tǒng)需要較大量的ATP來磷酸化葡萄糖?？赏ㄟ^加入編碼葡萄糖易化子(facilitator)(由glf編碼)、葡萄糖脫氫酶(由gdhIV編碼)和葡糖酸激酶(由glk編碼)的基因引入不同的葡萄糖轉(zhuǎn)運和磷酸化系統(tǒng)，它們也可導(dǎo)致PEP水平升高(W099/55877)。此機制可產(chǎn)生葡糖酸6-磷酸，它是戊糖磷酸途徑中的中間體，因此可提高此途徑中的碳流并導(dǎo)致E4P水平升高。
[0160]第二，PEP消耗酶、PEP羧化酶(Ppc)和丙酮酸激酶(如PykA和PykB)的失活可增加可用的 PEP 庫(Bongaerts 等，(2001)Met.Eng., 3, 289-300)。
[0161]第三，可通過提高PEP合酶(Pps)的表達(dá)將通過PTS或丙酮酸激酶形成的丙酮酸再循環(huán)回 PEP 中(Patnaik 等，(1995)Biotechnol.Bioeng.,46:361-370;和 Yi 等，(2002)Biotechnol.Prog.，18:1141-1148)。[0162]第四，可通過破壞csrA基因改變糖異生調(diào)節(jié)(碳貯存調(diào)節(jié)器)，這可增加糖異生，影響參與PEP代謝、降低糖酵解和提高PEP水平的幾種酶的調(diào)節(jié)(Tatarko等，(2001)Current Microbiol.,43(I):26-32)。
[0163]第五，可通過供給糖如不像葡萄糖，繞過PTS系統(tǒng)轉(zhuǎn)運入細(xì)胞的木糖來減少PEP消耗。
[0164]為了提高E4P的有效性，可過度表達(dá)編碼轉(zhuǎn)酮酶的tktA基因和/或編碼轉(zhuǎn)醛酶的talB基因。在將碳流導(dǎo)入芳族途徑中表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶更有效(Liao等，(1996)Biotechnol.Bioeng.,52:129-140)。例如，具有修飾的戊糖磷酸途徑的谷氨酸棒桿菌菌株可用來產(chǎn)生色氨酸(攜帶 pKW9901 的 KY9218 ；Ikeda 和 Katsumata, Appl.Environ.Microbiol.，1999，65(6):2497-502)。
[0165]可采用這些方法的任何組合。例如，可將這些修飾中的幾種組合起來應(yīng)用于大腸桿菌菌株。在過度表達(dá)tktA的PTS_葡萄糖+、pykA、pykB菌株中，到芳族途徑的碳流幾乎提高了 20 倍(Gosset 等，(1996) J.1nd.Microbiol.，17:47-52)。此外，可將這些方法可與其它修飾聯(lián)用，以降低色氨酸生物合成途徑中后來發(fā)生的瓶頸(如芳族途徑的色氨酸分支中過度表達(dá)基因，缺失PheA和tyrA基因以避免分支酸消耗，過表達(dá)trpE和trpD以提高鄰氨基苯甲酸的合成)，從而增加色氨酸產(chǎn)量。所產(chǎn)生的色氨酸不需要在細(xì)胞中累積，因為它可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物如莫納甜。
[0166]產(chǎn)生色氨酸，以及后來產(chǎn)生莫納甜，可得益于引起絲氨酸生產(chǎn)途徑中的改變。在生產(chǎn)色氨酸的最后一步中需要絲氨酸，最后一步包括絲氨酸與吲哚-3-甘油磷酸酯的反應(yīng)。此反應(yīng)由色氨酸合酶多肽催化。通過色氨酸途徑的碳流增加可導(dǎo)致一些反應(yīng)不平衡，出現(xiàn)新瓶頸。由于通過另一途徑產(chǎn)生絲氨酸，所以其產(chǎn)率可成為色氨酸生產(chǎn)中的限制因素?？赏ㄟ^過度表達(dá)途徑中的第一個 基因來增加通過絲氨酸途徑的碳流，該基因編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶(PDG;Ikeda 等，(1994) Biosc1.Biotech.Biochem.，58 (4): 674-678)。
[0167]提高丙酮酸產(chǎn)量
[0168]可通過增加宿主生物產(chǎn)生的丙酮酸量來提高由生物體產(chǎn)生的莫納甜量。一種產(chǎn)生莫納甜的途徑基于吲哚-3-丙酮酸與丙酮酸反應(yīng)形成莫納甜的4-酮酸衍生物。為了將此反應(yīng)向前推進(jìn)，能夠?qū)⒋罅刻嫁D(zhuǎn)移到丙酮酸的生物體用作生產(chǎn)莫納甜的宿主。選擇丙酮酸超產(chǎn)菌，它們不需要耐受高濃度的酸，但它們的代謝途徑應(yīng)失調(diào)，以使更多的碳轉(zhuǎn)移到丙酮酸。某些酵母，如皮狀絲孢酵母(Wang 等，Lett.Appl.Microbiol.，35:338-42，2002)、脂解假絲酵母、釀酒酵母和光滑假絲酵母(以前稱為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)(Li 等，Appl.Microbiol.Biotechnol., 57:451-9, 2001)從葡萄糖過量產(chǎn)生丙酮酸(高達(dá)50g/L)，可用于產(chǎn)生本文所述產(chǎn)物。
[0169]這些不同菌株的硫胺營養(yǎng)缺陷型在硫胺有限的條件下累積丙酮酸，因為硫胺依賴性丙酮酸脫氫酶(TOH)的活性降低損害了丙酮酸的氧化脫羧。硫辛酸是PDH的輔因子。同樣，硫辛酸營養(yǎng)缺陷型，如大腸桿菌菌株W14851ip2(ATCC25645 ；Kawasaki等，J.Ferment.Bioeng.,82:604-6,1996)可將丙酮酸累積到顯著的程度(>25g/L) (Yokota 等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，41:638-643，1994)。將 Fl-ATP 酶缺陷基因引入 W14851ip2 菌株可進(jìn)一步提高丙酮酸生產(chǎn)的速率和量。此突變導(dǎo)致細(xì)胞的能量產(chǎn)生有缺陷，此缺陷趨向于由提高通過糖酵解的碳流來補償，因此產(chǎn)生更大量的丙酮酸(Yokota等，J.Ferment.Bioeng.,83:132-138,1997) 0雙突變菌株可用于產(chǎn)生過量產(chǎn)生幾種氨基酸包括色氨酸(Kawasaki等，1996上述)、亮氨酸和纈氨酸(美國專利號5，888，783和6，214，591)的宿主菌株。
[0170]除了丙酮酸脫氫酶復(fù)合物中的突變以外，可通過去除或降低丙酮酸脫羧酶、丙酮酸鐵氧還蛋白-氧化還原酶、丙酮酸黃素氧還蛋白氧化還原酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶和/或丙酮酸氧化酶的表達(dá)獲得丙酮酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。參見例如，W003/000913。
[0171]過量產(chǎn)生丙酮酸的菌株中過度表達(dá)色氨酸酶基因可用于從吲哚產(chǎn)生色氨酸(Kawasaki等，1996，上述)。過量產(chǎn)生丙酮酸可提高色氨酸產(chǎn)量，也使形成莫納甜前體的底物(丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸)水平提高?；蛘?，當(dāng)采用色氨酸酶基因時，在存在過量銨的情況下可同時供給丙酮酸和吲哚?？捎萌ノ蹌┨岣哌胚岬娜芙庑裕蛘呖蛇B續(xù)供給吲哚以使毒性和沉淀減至最低程度。
[0172]色氨酸到吲哚-3-丙酮酸
[0173]可用一些多肽將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括但不限于酶種類(EC) 2.6.1.27,1.4.1.19,1.4.99.1,2.6.1.28,1.4.3.2,1.4.3.3,2.6.1.5,2.6.1.-、
2.6.1.1和2.6.1.21。這些種類包括但不限于稱為色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的多肽(也稱為L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、5-羥基色氨酸-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、羥基色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、L-色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、L-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、和L-色氨酸:2-氧戊二酸轉(zhuǎn)氨酶),它將L-色氨酸和2-氧戊二酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酰胺；D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶，它將D-色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脫氫酶(也稱為NAD (P) -L-色氨酸脫氫酶、L-色氨酸脫氫酶、L-Trp-脫氫酶、TDH和L-色氨酸:NAD(P)氧化還原酶(脫氨))，它將L-色氨酸和NAD (P)轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD (P) H ；D-氨基酸脫氫酶，它使D-氨基酸和FAD轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2 ;色氨酸-苯基丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(也稱為L-色氨酸-α-酮異已酸轉(zhuǎn)氨酶和L-色氨酸:苯基丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶)，它將L-色氨酸和苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮`酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也稱為蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸:氧氧化還原酶(脫氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ；D-氨基酸氧化酶(也稱為蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸:氧氧化還原酶(脫氨))，它將D-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ;色氨酸氧化酶,它使L-色氨酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3以及H202。這些種類也含有酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)轉(zhuǎn)氨酶和有多種轉(zhuǎn)氨酶活性的廣(多底物)轉(zhuǎn)氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
[0174]轉(zhuǎn)氨酶種類中有這種活性的11個成員描述于下面的實施例1，包括SEQ ID N0:11和12所示的新轉(zhuǎn)氨酶。因此，本發(fā)明提供分離的核酸和氨基酸序列，與分別在SEQ ID NO: 11和12中所示序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少99%的序列同一性。本發(fā)明也涵蓋SEQ ID NO: 11和12中所示片段和融合體，它們保持轉(zhuǎn)氨酶活性或編碼具有轉(zhuǎn)氨酶活性的多肽。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500 或 1000 個 SEQ ID NO: 11 的毗連核苷酸或至少 6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350個SEQ ID NO: 12的毗連氨基酸。所示序列(和其變體、片段和融合體)可以是載體的一部分。載體能用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而生成重組細(xì)胞，重組細(xì)胞可從色氨酸產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能進(jìn)一步產(chǎn)生MP和/或莫納甜。
[0175]L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)已知，序列可分離自一些不同來源，如地中海蝰(Vipera lebetine) (sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah) (sp P81383)、紅口峻(Agkistrodon rhodostonma) (sp P81382)、西部菱斑響尾蛇(Crotalus atrox) (spP56742)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepaica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄桿菌(Caulobacter cresentus)、萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假單胞菌(P.Syringae)和紅球菌屬(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文獻(xiàn)且可分離自例如鬼傘屬(Coprinus) SF-1、有根腫病的大白菜、擬南芥和哺乳動物的肝。
[0176]色氨酸脫氫酶已知，并可分離自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黃花牧豆樹(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆樹、小麥、玉米、番爺、煙草、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)和乳桿菌(Lactobacilli)。許多D-氛基酸脫氧酶基因序列已知。
[0177]如圖11-13所示，如果用氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸，能加入過氧化氫酶以減少或甚至去除過氧化氫的存在。
[0178]吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸
[0179]將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸的反應(yīng)可通過各種多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或 1.1.1.111 多肽類的成員。1.1.1.11 0多肽類包括吲哚乳酸脫氫酶(也稱為吲哚乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.1.27,1.1.1.28和1.1.2.3類包括乳酸脫氫酶(也稱為乳酸脫氫酶、乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.1.222類包含(R) -4-羥苯基乳酸脫氫酶(也稱為D-芳族乳酸脫氫酶、R-芳族乳酸脫氫酶和R-3-(4-羥苯基)乳酸:NAD (P)+2-氧化還原酶)且1.1.1.237類包含3-(4-羥苯基丙酮酸)還原酶(也稱為羥苯基丙酮酸還原酶和4-羥苯基乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.3.-類包含乳酸氧化酶，1.1.1.111類包含(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(也稱為(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸:NAD(P) +氧化還原酶)?？赡苓@些種類中的一些多肽能從吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。
[0180]化學(xué)反應(yīng)也可用于將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸。這種化學(xué)反應(yīng)包括能用一些方法完成的氧化步驟，例如:使用B2催化劑的空氣氧化(China ChemicalReporter, 13卷，28期，18頁(I)，2002)，金屬催化劑存在時稀釋高錳酸鹽和高氯酸鹽或過
氧化氫。
[0181]吲哚-3-丙酮酸到2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸(MP)
[0182]一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸加一種三碳源(如丙酮酸)轉(zhuǎn)化成MP。示范多肽種類包括4.1.3.-、4.1.3.16,4.1.3.17和4.1.2._。這些種類包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2種羧酸底物縮合的醛縮酶。肽類EC4.1.3.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電體，而EC4.1.2.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作為親電體。
[0183]例如，EP1045-029中所述多肽(EC4.1.3.16,4-羥基_2_氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也稱為4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶、2-氧-4-羥基戊二酸醛縮酶或KHG醛縮酶)將乙醛酸和丙酮酸轉(zhuǎn)化成4-羥基-2-酮戊二酸，多肽4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17，也稱為4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛縮酶)縮合2種酮酸如2個丙酮酸到4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用這些裂合酶的反應(yīng)。
[0184]圖1-2和11-13顯示這些反應(yīng)的示意圖，其中3_碳(C3)分子結(jié)合吲哚_3_丙酮酸。EC4.1.2.-和4.1.3.-的許多成員，特別是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如絲氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇縮合需要此途徑的3個碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作為C3碳源且可轉(zhuǎn)化成丙酮酸?？赏ㄟ^許多利用PLP的轉(zhuǎn)氨酶來轉(zhuǎn)氨以產(chǎn)生丙酮酸，包括許多上述的轉(zhuǎn)氨酶。可通過β消除反應(yīng)(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)獲得丙酮酸和氨，反應(yīng)用于L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有足夠離去基團(tuán)的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-絲氨酸、O-芐基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-芐基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-?；?L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介導(dǎo)的β -裂合酶反應(yīng)中用作丙酮酸的來源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC4.1.99.2，也稱為酪氨酸-酚裂合酶)催化的反應(yīng)。通過在(4.1.99.1-2)多肽上進(jìn)行定點誘變可增加β-裂合酶反應(yīng)速率，如Mouratou等(J.Biol.Chem274:1320-5,1999)和實施例5所述。這些修飾使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸鹽也能用作丙酮酸的來源，且通過加入乳酸脫氫酶和氧化輔因子或乳酸氧化酶和氧來氧化成丙酮酸。這些反應(yīng)的例子在下文描述。例如，如圖2和圖11-13所示，當(dāng)丙酮酸用作C3分子時，ProA醛縮酶能接觸吲哚_3_丙酮酸。
[0185]MP到莫納甜
[0186]MP到莫納甜的轉(zhuǎn)化可由下列I個或多個催化:色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.28)或更多轉(zhuǎn)氨酶家族(2.6.1.-)的一般成員如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)轉(zhuǎn)氨酶(圖2)。轉(zhuǎn)氨酶類的11個成員在下文描述(實施例1)，包括SEQ ID NO: 11和12所示新的種類成員，實施例4提供證明轉(zhuǎn)氨酶和脫氫酶活性的反應(yīng)。
[0187]此反應(yīng)也能用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。酮酸(MP)胺化通過還原性胺化用氨和氰基硼氫化鈉進(jìn)行。
[0188]圖11-13顯示另外的多肽，它們能用于使MP轉(zhuǎn)化成莫納甜，以及提供增加來自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫納甜產(chǎn)量的方法。例如，如果天冬氨酸用作氨基供體，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶能用于使天冬氨酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸(圖11)。草酰乙酸通過脫羧酶(如草酰乙酸脫羧酶)轉(zhuǎn)化成丙酮酸和二氧化碳(圖11)。此外，如果賴氨酸用作氨基供體，賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶可用于使賴氨酸轉(zhuǎn)化成ε -醛基賴氨酸(圖12)。ε -醛基賴氨酸自發(fā)轉(zhuǎn)化成1-哌啶
6-羧酸鹽(圖12)。如果能催化還原性胺化反應(yīng)的多肽(如谷氨酸脫氫酶)用于將MP轉(zhuǎn)化成莫納甜，可使用能再循環(huán)NAD⑵H和/或產(chǎn)生揮發(fā)性產(chǎn)物的多肽，如甲酸脫氫酶。
[0189]提高莫納甜產(chǎn)量的其它方法
[0190]可用于提高莫納甜產(chǎn)量的具有遺傳修飾的菌株的其它例子包括:
[0191]I)大腸桿菌 AGX1757，可分離自 W3110 (具有質(zhì)粒 pSC101+trpI 的 trpAEl、trpR、tnaA)。可進(jìn)行NTG誘變，選擇6-氟色氨酸或5-甲基色氨酸抗性?？赏ㄟ^加入普朗尼克(Pluronic) L-61使色氨酸或莫納甜在培養(yǎng)基中結(jié)晶以提高產(chǎn)率。
[0192]2)谷氨酸棒桿菌KY9225衍生自Ρχ_115_97，顯示苯丙氨酸和酪氨酸雙營養(yǎng)缺陷型，并含有耐色氨酸抑制的鄰氨基苯甲酸合酶。
[0193]3)誘變?nèi)榘l(fā)酵短桿菌1041trpE，使其對色氨酸反饋抑制脫敏感。發(fā)現(xiàn)該基因具有被精氨酸所取代的絲氨酸殘基。發(fā)現(xiàn)推定弱化子內(nèi)終止子結(jié)構(gòu)中鳥嘌呤突變成腺嘌啉也減輕轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Matsui 等,(1987) J.Bacteriology, 16:5330-5332)。
[0194]可用于使前體的有效性最優(yōu)化和使莫納甜產(chǎn)量最大化的其它修飾包括但不限于:(I)缺失編碼有助于莫納甜攝取的多肽的基因，(2)缺失或下調(diào)編碼參與競爭途徑的多肽的基因，(3)上調(diào)醛縮酶和轉(zhuǎn)氨酶多肽表達(dá)，(4)缺失編碼產(chǎn)生莫納甜的不正確形式的轉(zhuǎn)氨酶多肽的基因，和(5)提高PLP有效性。編碼有助于莫納甜攝取的多肽的基因可包括枯草芽孢桿菌天冬氨酸攝取轉(zhuǎn)運蛋白(YveA ;Lorca 等，2003, J.Bacteriol., 185 (10): 3218-22),Glt-1L-谷氨酸/L-天冬氨酸/D-天冬氨酸攝取多肽(協(xié)同轉(zhuǎn)運子)和谷氨酸棒桿菌gluA、B、C、D谷氨酸攝取基因。編碼參與競爭途徑的多肽的基因可以是tnaA基因(編碼色氨酸酶多肽)，除非吲哚用作產(chǎn)生色氨酸的底物。[0195]設(shè)計生物合成途徑中的另外考慮
[0196]取決于哪種多肽用于產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜，能提供輔因子、底物和/或另外多肽給生產(chǎn)細(xì)胞以增強產(chǎn)物形成。此外，可設(shè)計遺傳修飾來提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜等產(chǎn)物的產(chǎn)量。類似地，使用宿主細(xì)胞可使莫納甜生產(chǎn)最優(yōu)化。
[0197]如本文所述，任何生物如大腸桿菌和其它腸桿菌科(如克氏桿菌屬、泛菌屬和歐文氏菌屬菌株)、谷氨酸棒桿菌、短桿菌菌株、桿菌菌株和酵母菌株可用于產(chǎn)生產(chǎn)物如吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜。例如，可對經(jīng)改造從鄰氨基苯甲酸過量產(chǎn)生色氨酸(導(dǎo)致許多有疑問的副產(chǎn)物)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌進(jìn)行修飾，以有效生成產(chǎn)物。此外，產(chǎn)生谷氨酸的野生型黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)和谷氨酸棒桿菌菌株經(jīng)修飾能有效產(chǎn)生其它氨基酸如賴氨酸。T.0ka，“氨基酸，生產(chǎn)工藝”(Amino Acids, Production Processes),刊于《生物工藝技術(shù)百科全書:發(fā)酵、生物催化和生物分離》(Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis, and Bioseparation), M.C.Flickinger 和 S.W.Drew 編，John Wiley 和Sons, Inc.New York,第89-100頁。此外,可選擇或設(shè)計本文所述生物體,使其(I)具有有利的生長動力學(xué)，使它們可以在低成本基質(zhì)上生長，(2)分泌產(chǎn)物如莫納甜，和/或(3)使莫納甜的前體如色氨酸和丙酮酸的水平提高?？捎靡撰@得的遺傳學(xué)工具從良好表征的物種產(chǎn)生這種生物體，和/或這種生物體具有安全地用于產(chǎn)生食品成分的歷史。
[0198]1.去除過氧化氫
[0199]過氧化氫(H2O2)是一種產(chǎn)物，如果產(chǎn)生，可對生產(chǎn)細(xì)胞有毒、并可損害多肽或產(chǎn)生的產(chǎn)物(如中間體)。上述L-氨基酸氧化酶產(chǎn)生H2O2作為產(chǎn)物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平減少以降低對細(xì)胞或產(chǎn)物的潛在損傷。
[0200]過氧化氫酶能用于降低細(xì)胞中的H2O2水平(圖11-13)。生產(chǎn)細(xì)胞可表達(dá)編碼過氧化氫酶(EC1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化過氧化氫分解成水和氧氣。例如，過氧化氫酶可從轉(zhuǎn)染入生產(chǎn)細(xì)胞的載體中表達(dá)。能使用的過氧化氫酶例子包括但不限于:tr I Q9EV50 (木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr | Q9KBE8 (耐鹽桿菌)、tr I Q9URJ7 (白色念珠菌)、tr | P77948 (天蘭色鏈霉菌)、tr | Q9RBJ5 (野油菜黃單胞菌)(SwissProt登錄號)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反應(yīng)器也能包含過氧化氫酶多肽。
[0201]2.吡哆醛Y -磷酸(PLP)有效性的調(diào)節(jié)
[0202]如圖1所示，PLP可用于本文所述I個或多個生物合成步驟。能補充PLP濃度，從而PLP不成為對反應(yīng)總效率的限制。
[0203]已充分研究大腸桿菌中維生素B6 (PLP的前體)的生物合成途徑且已結(jié)晶一些蛋白(Laber等，F(xiàn)EBS Letters，449:45-8，1999)。其它代謝途徑中需要2個基因(印d或gapB和serC),而3個基因(pdxA、pdxB和pdxj)是吡B多醒磷酸生物合成獨有的。大腸桿菌途徑中的起始物質(zhì)之一是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。從共同的2和3碳中心代謝物合成此前體是由多肽1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前體是從4-碳糖，D-赤蘚糖4-磷酸形成的蘇氨酸衍生物。轉(zhuǎn)化到磷酸-4-羥基-L蘇氨酸(HTP)所需的基因是^cUpdxB和serC。形成PLP的最后一個反應(yīng)是DXP與HTP間的復(fù)雜分子內(nèi)縮合和閉環(huán)反應(yīng)，由pdxA和pdxj的基因產(chǎn)物催化。
[0204]如果PLP成為發(fā)酵生產(chǎn)莫納甜期間的限制營養(yǎng)物，可增加I個或多個途徑中的基因在生產(chǎn)宿主細(xì)胞中的表達(dá)來提高莫納甜產(chǎn)量。宿主生物體可包含多拷貝的天然途徑基因，或非天然途徑基因的拷貝可摻入生物體的基因組中。另外，可在宿主生物體內(nèi)克隆入多拷貝的拯救途徑基因中。
[0205]在所有生物體中保守的I個拯救途徑使各種維生素B6的衍生物再循環(huán)成活性PLP形式。參與此途徑的多肽是PdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。過量表達(dá)I個或多個這些基因可增加PLP有效性。
[0206]可通過去除或阻抑宿`主生物體中天然生物合成途徑基因的代謝調(diào)節(jié)提高維生素B6水平。PLP阻抑參與黃桿菌屬(Flavobacterium)菌株238-7中前體蘇氨酸衍生物的生物合成的多肽。此細(xì)菌菌株無代謝控制，過量產(chǎn)生吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以類似方式遺傳操作產(chǎn)生莫納甜的宿主生物體可增加PLP生成而不過度表達(dá)生物合成途徑基因。
[0207]3.銨利用
[0208]通過制備更能利用的氨或去除水能驅(qū)動色氨酸酶反應(yīng)趨向合成方向(從吲哚生成色氨酸)。還原性胺化反應(yīng)如由谷氨酸氫化酶催化的反應(yīng)，也能通過銨過量來驅(qū)動。
[0209]氨可作為碳酸或磷酸緩沖系統(tǒng)中的碳酸銨或磷酸銨鹽而得到。氨也能作為丙酮酸銨或甲酸銨提供。另外，如果反應(yīng)偶聯(lián)產(chǎn)生氨的反應(yīng)如谷氨酸脫氫酶或色氨酸脫氫酶，可提供氨。加入EC4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能產(chǎn)生氨，底物會水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通過酶水解其優(yōu)選底物也能使增加的合成產(chǎn)物的產(chǎn)量超過正常平衡量。
[0210]4.除去產(chǎn)物和副產(chǎn)物
[0211 ] 色氨酸經(jīng)色氨酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影響吲哚-3-丙酮酸的產(chǎn)率，因為反應(yīng)生成谷氨酰胺并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酰胺可引起轉(zhuǎn)氨酶的抑制，反應(yīng)會消耗大量共底物。此外，高谷氨酸濃度對下游分離過程有害。
[0212]多肽谷氨酸脫氫酶(GLDH)將谷氨酸轉(zhuǎn)化成2_氧戊二酸，從而在反應(yīng)中再循環(huán)共底物，反應(yīng)由色氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化。GLDH也產(chǎn)生還原性等效物(NADH或NADPH)，能用于在需氧條件下產(chǎn)生細(xì)胞所用能量(ATP)。通過GLDH利用谷氨酸也減少副產(chǎn)物形成。另外，反應(yīng)產(chǎn)生氨，它能用作細(xì)胞的氮源或作為圖1所示最后步驟中還原性胺化的底物。因此，過度表達(dá)GLDH多肽的生產(chǎn)細(xì)胞能用于增加產(chǎn)量和降低培養(yǎng)基和/或分離方法的成本。
[0213]在色氨酸到莫納甜的途徑中，如果使用來自適當(dāng)酶類的轉(zhuǎn)氨酶，步驟3的氨基供體(如谷氨酸或天冬氨酸)可反轉(zhuǎn)化成步驟I所需的氨基受體(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途徑的2種獨立的轉(zhuǎn)氨酶能提高此途徑的效率，其中I種轉(zhuǎn)氨酶的底物非競爭性抑制其它轉(zhuǎn)氨酶的活性。
[0214]所述途徑中的許多反應(yīng)是可逆的，因此可達(dá)到底物和產(chǎn)物間的平衡?？赏ㄟ^從多肽中連續(xù)取出產(chǎn)物來增加途徑的產(chǎn)量。例如，用通透酶或其它轉(zhuǎn)運蛋白使莫納甜分泌入發(fā)酵液，或者從生物催化反應(yīng)器流中選擇性結(jié)晶莫納甜并伴隨底物再循環(huán)會提高反應(yīng)產(chǎn)量。
[0215]另一種增加反應(yīng)產(chǎn)量的方法是通過另外的酶反應(yīng)或通過氨基供體基團(tuán)的取代來去除副產(chǎn)物。例如，可產(chǎn)生不能在反方向中反應(yīng)的副產(chǎn)品，或通過相變(例如終產(chǎn)物的沉淀)或通過自發(fā)轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性終產(chǎn)物如二氧化碳實現(xiàn)。
[0216]5.底物庫的調(diào)節(jié)
[0217]可通過增加色氨酸前體生成和/或改變包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代謝途徑調(diào)節(jié)吲哚庫。例如，可通過宿主細(xì)胞中編碼EC4.1.1.74的基因功能性缺失來減少或去除從吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸?？赏ㄟ^功能性缺失宿主細(xì)胞中編碼EC4.1.99.1的基因減少或去除從色氨酸生成吲哚。另外，過量吲哚能用作體外或體內(nèi)過程中的底物，結(jié)合增加量的編碼EC4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.,82:604-6，1996)。
[0218]此外，可進(jìn)行遺傳修飾以增加中間體，如D-赤蘚糖4-磷酸和分支酸的水平。
[0219]6.控制手性
[0220]通過控制立體化學(xué)(手性)能改變莫納甜的品嘗描繪。例如，不同食物系統(tǒng)的濃度不同的混合物中需要不同的莫納甜異構(gòu)體。手性可通過pH和多肽的組合控制。
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中所述微生物包含至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉(zhuǎn)氨酶多肽的核酸；和 (b)從所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中提取莫納甜或其鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，EC4.1.3.16)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物選自苜蓿中華根瘤菌、睪丸酮叢毛單胞菌、稻草假單胞菌、谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物選自棒桿菌屬和短桿菌屬。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含非離子去污劑、青霉素、青霉素衍生物或其組合。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述非離子去污劑選自吐溫、TritonX-1OO和十二烷基乙酸銨。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基所含生物素的濃度小于5μ g/L。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述青霉素衍生物是氨芐青霉素。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，培養(yǎng)微生物前所述培養(yǎng)基的pH 約為 pH7 — pH8。`
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含糖蜜、玉米漿或其組合。
12.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌，其中所述培養(yǎng)基包含Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物的生長需要苯丙氨酸和酪氨酸，其中所述培養(yǎng)基包含苯丙氨酸和酪氨酸。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物含有aspC和proA基因。
15.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒桿菌是產(chǎn)生和分泌谷氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含非離子去污劑、青霉素、青霉素衍生物或其組合。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，由所述谷氨酸棒桿菌分泌莫納甜或其鹽。
18.—種生產(chǎn)莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌(ATCC13058);和 (b)從所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中提取莫納甜或其鹽。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含吐溫、青霉素、青霉素衍生物或其組合。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含色氨酸、丙酮酸、非離子去污劑、青霉素、青霉素衍生物或其組合。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述非離子去污劑是吐溫。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含丙酮酸、吐溫和青霉素衍生物。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)氨酶多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物分泌莫納甜或其鹽。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)所述微生物。
26.一種包含至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉(zhuǎn)氨酶多肽的核酸的微生物，其中所述核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合，其中所述微生物產(chǎn)生莫納甜或其鹽。
27.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，EC4.1.3.16)。
28.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)氨酶多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
29.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物過量產(chǎn)生丙酮酸。
30.如權(quán)利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物是硫胺營養(yǎng)缺陷型。
31.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物是苯丙氨酸和酪氨酸營養(yǎng)缺陷型。
32.如權(quán)利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物選自光滑假絲酵母、皮狀絲孢酵母、脂解假絲酵母和釀酒酵母。
33.如權(quán)利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物是硫辛酸營養(yǎng)缺陷型。
34.如權(quán)利要求33所述的微生物,其特征在于,所述微生物包含aspC和proA基因。
35.如權(quán)利要求33所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含aspC和proA基因和至少一個色氨酸操縱子基因。
36.如權(quán)利要求33所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌。
37.如權(quán)利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含缺陷的Fl— ATP酶基因。
38.如權(quán)利要求33所述的微生物，其特征在于，所述微生物的內(nèi)源性IipA基因中有破壞。
39.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物過量產(chǎn)生色氨酸。
40.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含一種或多種色氨酸生物合成基因的兩個或多個拷貝。
41.如權(quán)利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含被破壞的pheA基因。
42.如權(quán)利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含被破壞的內(nèi)源性色氨酸酶(tna)基因。
43.如權(quán)利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物過度表達(dá)ppsA基因。
44.如權(quán)利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌。
45.如權(quán)利要求44所述的微生物，其特征在于，相對于對應(yīng)的對照微生物，所述微生物提高了 3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸(DAHP)合酶活性量。
46.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物還包含編碼具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合酶活性的多肽的核酸，其中所述核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合。
47.如權(quán)利要求46所述的微生物，其特征在于，所述微生物還包含tkt基因。
48.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物還包含編碼具有色氨酸酶活性的多肽的外源性核酸。
49.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物分泌莫納甜或其鹽。
50.如權(quán)利要求49所述的微生物，其特征在于，所述微生物是脂肪酸營養(yǎng)缺陷型。
51.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物是含有表達(dá)醛縮酶的核酸的細(xì)菌菌株，其中由所述核酸表達(dá)的醛縮酶能夠產(chǎn)生富含立體異構(gòu)體的莫納甜混合物。
52.如權(quán)利要求51所述的微生物，其特征在于，所述富含立體異構(gòu)體的莫納甜混合物主要是S，S莫納甜或其鹽。
53.如權(quán)利要求51所述的微生物，其特征在于，所述富含立體異構(gòu)體的莫納甜混合物主要是R，R莫納甜或其鹽。
54.如權(quán)利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物過度表達(dá)編碼色氨酸攝取多肽的至少一種核酸。
55.一種生產(chǎn)莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在生產(chǎn)莫納甜或其鹽的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生莫納甜或其鹽的微生物，和 (b)從所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中獲得莫納甜或其鹽。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述微生物分泌莫納甜或其鹽。
57.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述微生物是脂肪酸營養(yǎng)缺陷型。
58.一種鑒定能夠合成莫納甜或其鹽的細(xì)胞的方法，所述方法包括: (a)在選自以下的碳源/能源存在下培養(yǎng)細(xì)胞:莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽、莫納甜或其鹽的類似物、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽的類似物及其組合；和 (b)測試細(xì)胞生長，其中細(xì)胞生長說明該細(xì)胞將所述碳源/能源轉(zhuǎn)化為丙酮酸，從而說明該細(xì)胞能夠合成莫納甜或其鹽。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是丙酮酸營養(yǎng)缺陷型，在所述細(xì)胞中通過代謝碳源/能源產(chǎn)生丙酮酸。
60.如權(quán)利要求59所述的方法,其特征在于,所述細(xì)胞包含被破壞的pykA和pykF基因。
61.一種鑒定能夠從色氨酸合成莫納甜或其鹽或者2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戍二酸或其鹽或者其組合的細(xì)胞的方法,所述方法包括: (a)在不存在色氨酸和存在莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合的條件下培養(yǎng)色氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞；和 (b)測試色氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞的生長，其中細(xì)胞生長說明該細(xì)胞從莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合合成色氨酸，從而說明該細(xì)胞能夠從色氨酸合成莫納甜或其鹽或2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合。
62.一種生產(chǎn)莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，所述微生物選自苜蓿中華根瘤菌、睪丸酮叢毛單胞菌、稻草假單胞菌和谷氨酸棒桿菌；和 (b)從培養(yǎng)基或培養(yǎng)的微生物中提取莫納甜或其鹽。
63.如權(quán)利要求62所述的方法,其特征在于,所述微生物未經(jīng)遺傳修飾。
64.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含PHB培養(yǎng)基。
65.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還包含色氨酸、丙酮酸、非離子去污劑、青霉素、青霉素衍生物或其組合。
66.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述微生物是苜蓿中華根瘤菌或睪丸酮叢毛單胞菌。
67.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述微生物是睪丸酮叢毛單胞菌，所述培養(yǎng)基還包含色氨酸和丙酮酸。
68.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含TY培養(yǎng)基。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還包含色氨酸、丙酮酸或其組合。
【文檔編號】C12N9/10GK103555782SQ201310188490
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2004年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2003年10月21日
【發(fā)明者】S·C·麥克法蘭, P·M·西克斯, M·J·齊德韋克, F·A·桑切斯－里埃, D·C·卡梅隆, M·L·德蘇扎, J·羅薩扎, S·J·格特, T·W·阿布拉罕 申請人:嘉吉有限公司