Atm基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了ATM基因突變體及其應(yīng)用，具體涉及分離的編碼ATM基因突變體的核酸、分離的多肽、篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法、篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的試劑盒。其中，分離的編碼ATM基因突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有選自下列的至少一種突變：c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和c.8851_8987del。通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
【專利說明】ATM基因突變體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及ATM基因突變體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]共濟失調(diào)毛細血管擴張癥(ataxia-telangiectasia, AT)是一種罕見的常染色體隱性遺傳(autosomal recessive inherited, AR)病，又叫 Louis-Bar 綜合征，于 1941 年由Louis-Bar首先報道。AT發(fā)病率約1/4萬~1/10萬，多于兒童期起病，臨床主要表現(xiàn)為進行性發(fā)展的小腦性共濟失調(diào)，眼球結(jié)膜和面部皮膚的毛細血管擴張，反復(fù)發(fā)作的呼吸道感染；同時還具有對射線的殺傷作用異常敏感，染色體不穩(wěn)定性，易患惡性腫瘤，免疫缺陷和抗射線的DNA復(fù)制合成等特征。
[0003]Savitsky和Uziel等率先克隆AT的疾病基因(ATM)，并將其定位于llq22.3。ATM是AT唯一的致病基因，全長約150kb，而編碼序列只有12kb，共有66個外顯子，編碼一個有3056個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為350000的蛋白質(zhì)。ATM基因產(chǎn)物ATM編碼蛋白作為直接感受DNA雙鏈斷裂(DSBs)損傷信號的上游分子，以其激酶活性，催化多種重要功能底物蛋白的磷酸化，使受損的DNA停止于細胞周期檢測點并對其進行修復(fù)，對維持染色體的穩(wěn)定性起重要作用。
[0004]ATM基因的克隆為AT的基因診斷和癥狀前診斷奠定了基礎(chǔ)，并且很大程度上解決了該病臨床診斷困難的問題。ATM蛋白在胎兒和成人組織內(nèi)均有廣泛表達，其功能域包括磷酯酰肌醇 3-激酶(phosphoinositide_3kinase，PI3K)、Rad3、亮氨酸拉鏈(leucinezipper, LZ)、局部的連接區(qū)域(focaladhes1n target, FAT)、局部的連接區(qū)域C端(FATC)等。PI3K蛋白家族成員和具有Rad3結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員參與了激活細胞周期關(guān)卡，控制端粒長度和應(yīng)答DNA損傷等重要的生物學(xué)過程。
[0005]AT最顯著的病理學(xué)表現(xiàn)是基因組的不穩(wěn)定性，主要反應(yīng)在高頻率的染色體斷裂，自發(fā)染色體末端融合和染色體內(nèi)同源重組及染色體易位，以及體內(nèi)、外染色體自發(fā)畸變率和輻射誘發(fā)染色體畸變率的異常增加。作為DNA損傷信號傳導(dǎo)通路中最早的傳感和中樞調(diào)控基因，ATM編碼的ATM蛋白在電離輻射的誘導(dǎo)下被激活，并磷酸化其下游蛋白，通過調(diào)控細胞周期關(guān)卡、DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡等維持基因組穩(wěn)定性。AT細胞由于ATM基因突變，缺失了 ATM蛋白，喪失了對下游基因的調(diào)控作用，使受損的DNA的合成受抑，阻礙DNA的修復(fù)過程，從而導(dǎo)致染色體的斷裂和基因組不穩(wěn)定。
[0006]ATM基因的突變具有極高的異質(zhì)性，突變方式和突變檢測都極為復(fù)雜。到目前為止，國外已經(jīng)報道了 400余種ATM基因突變，絕大多數(shù)AT患者為復(fù)合性雜合突變，突變形式有錯義突變、無義突變、剪切位點突變、小片段插入突變、小片段缺失突變、大片段缺失和同義突變等，突變位點遍布基因全長，無突變熱點。
[0007] 因而，目前對共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的致病基因ATM突變基因的研究仍有待深入。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法。
[0009]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作完成的:發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗證的方法確定了共濟失調(diào)毛細血管擴張癥新的致病基因突變位點(ATM基因的 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del 突變)。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼ATM基因突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ 、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和c.8851_8987del (exon65del)。即相對于野生型ATM基因，本發(fā)明的ATM基因具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和c.8851_8987del(eX0n65del)的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 ATM基因的新突變體，該突變體與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽，該多肽與SEQ IDNO:2 相比，具有選自下列的至少一種突變:p.Cysl899X、p.Glu2950fs、p.Trpl026Cys、p.Val2662del、p.1lel59fs和p.2951_2995del，通過檢測生物樣品中是否表達該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多肽是由上述核酸編碼的。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的地三個方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，該方法包括以下步驟:從所述生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ 、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和 c.8851_8987del(exon65del)的至少一種突變是所述生物樣品易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的指示，任選地，所述生物樣品為選自人體血液，任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA，任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥是常染色體隱性遺傳疾病。通過根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，可以有效地篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del (exon65del)的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥；任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥是常染色體隱性遺傳疾病。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實施前述篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的試劑盒，該試劑盒含有:適于檢測ATM基因突變體的試劑，其中與SEQ IDNO:1相比，所述ATM基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del (exon65del)，任選地，所述試劑為核酸探針或引物，任選地，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列，任選地，所述是常染色體隱性遺傳疾病。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體包含前面所述的分離的編碼ATM基因突變體的核酸。需要說明的是，“構(gòu)建體包含前面所述的分離的編碼ATM基因突變體的核酸”表示，本發(fā)明的構(gòu)建體包含與SEQ ID N0:1相比具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del (exon65del)至少一種突變。由此，利用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用作共濟失調(diào)毛細血管擴張癥相關(guān)研究的模型。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明還提出了一種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該重組細胞是通過前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明的重組細胞，能夠有效地用作共濟失調(diào)毛細血管擴張癥相關(guān)研究的模型。
[0017]對于本發(fā)明中所述核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本發(fā)明的實施例中，雖然多數(shù)情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID NO: 1，實際包括其互補序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
[0018]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0020]圖1:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)及其組成部分的示意圖，其中，
[0021]A為根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥患者的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，
[0022]B為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0023]C為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖。
[0024]圖2:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的共濟失調(diào)毛細血管擴張癥患者的家系圖
-1'TfeP曰。
[0025]圖3:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系I的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。
[0026]圖4:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系2的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。
[0027]圖5:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系3的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。
[0028]圖6:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系I的ATM基因突變體的QPCR的結(jié)果圖。圖7:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系2的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。

【具體實施方式】
[0029]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0030]ATM基因突變體
[0031]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼ATM基因突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC和c.8851_8987del (exon65del)。即相對于野生型ATM基因，本發(fā)明的ATM基因具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和c.8851_8987del (eX0n65del)突變的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 ATM基因的新突變體，該突變體與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
[0032]在本文中所使用的表達方式“編碼ATM突變體的核酸”，是指與編碼ATM突變體的基因相對應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與ATM突變體的編碼基因相對應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，前面所述的編碼ATM突變體的核酸為DNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 ATM基因的新突變體，這些新突變體與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥，也可以通過檢測這些突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測生物體是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
[0033]該編碼ATM突變體的核酸，是本申請的發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗證的方法確定的共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的致病基因上的新突變。該突變位點在現(xiàn)有技術(shù)中并未被提到。
[0034]其中，野生型ATM基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:

【權(quán)利要求】
1.一種分離的編碼ATM基因突變體的核酸，其特征在于，與SEQ ID N0:1相比， 所述核酸具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del。
2.一種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Cysl899X、p.Glu2950fs、p.Trpl026Cys、p.Val2662del、p.1lel59fs 和p.2951_2995del, 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。
3.一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del 的至少一種突變是所述生物樣品易患感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA， 任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥是常染色體隱性遺傳疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進一步包括: 針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果，任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測序文庫進行測序， 任選地,針對所述核酸樣本,構(gòu)建核酸測序文庫進一步包括: 利用ATM基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增；以及 針對所得到的擴增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測序文庫， 任選地，所述ATM基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與 SEQ ID NO:1 相比，是否具有 c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del 的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥； 任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥為常染色體隱性遺傳疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸提取裝置進一步包括: RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對所述RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進一步包括: 文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果， 任選地,所述文庫構(gòu)建單元 進一步包括: PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設(shè)置有ATM基因外顯子特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種。
9.一種用于篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有: 適于檢測ATM基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述ATM基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和 c.8851_8987del, 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地,所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列， 任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥為常染色體隱性遺傳疾病。
10.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的分離的編碼ATM基因突變體的核酸。
11.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是通過權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞而獲得的。
【文檔編號】C12N15/12GK104178487SQ201310188517
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月20日
【發(fā)明者】江泓, 陳召, 師玉亭, 唐北沙, 肖晶晶, 管李萍, 王俊 申請人:中南大學(xué)湘雅醫(yī)院, 深圳華大基因科技有限公司