無抗藥基因的酵母-細菌穿梭載體的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】穿梭載體是具有兩種不同的復制起點和篩選標記、能夠在大腸桿菌和另一種宿主細胞中獨立存在并進行復制的質(zhì)粒載體。目前廣泛使用的穿梭載體都含有用作篩選標記的抗藥基因，其生物安全性是限制微生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。本發(fā)明成功利用葡萄糖胺合成酶基因取代抗藥基因，獲得酵母-大腸桿菌，穿梭載體pGFA。新載體的特征：(1)不含潛在危害性基因，具有生物安全性；(2)篩選功能強，能夠有效維持重組表征；(3)不受微環(huán)境中富營養(yǎng)條件的影響；(4)兩種宿主共用篩選標記，從而精簡了載體分子、擴大了載體容量、提高了基因轉(zhuǎn)化率。通過pGFA賦予新功能的酵母細胞可以在食品發(fā)酵、飼料添加、環(huán)境修復等領(lǐng)域得到推廣應(yīng)用。
【專利說明】無抗藥基因的酵母-細菌穿梭載體的構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域；具體涉及分子生物技術(shù)、基因工程、細胞工程、環(huán)境修復等【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體涉及I種不含抗藥基因的酵母-細菌穿梭載體及其應(yīng)用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]穿梭載體是具有兩種不同的復制起點和篩選標記、能夠在大腸桿菌和另一種宿主細胞中獨立存在并進行復制的質(zhì)粒載體(吳乃虎，2001，《基因工程原理》，p.502)。大腸桿菌是轉(zhuǎn)化率最高、質(zhì)粒最容易分離的宿主細胞。為了有效轉(zhuǎn)化大腸桿菌以外的宿主細胞，人們首先需要在大腸桿菌中進行基因克隆和載體構(gòu)建，并通過大腸桿菌細胞制備較大量的純質(zhì)粒；因此，所采用的質(zhì)粒必須含有一套大腸桿菌的復制元件和篩選標記，同時含有第二套適用于另一種宿主細胞的復制元件和篩選標記。
[0003]篩選標記是質(zhì)粒載體所必備的基本元件?？顾幓蚴俏⑸镛D(zhuǎn)基因的有效篩選標記，目前所使用的在不同微生物和大腸桿菌之間共用的穿梭載體都含有用作篩選標記的抗藥基因。通過這些載體轉(zhuǎn)基因可能導致抗藥基因的擴散，其生物安全性問題長久以來一直是限制微生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。營養(yǎng)缺陷型篩選標記可以避免抗藥基因的傳播，具有生物安全性，但是自然環(huán)境或自然培養(yǎng)基中富含氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)成分，使相關(guān)的營養(yǎng)缺陷型篩選標記不能夠維持篩選壓力。同時，由于細菌易于回復突變，營養(yǎng)缺陷型篩選標記在細菌如大腸桿菌中未能有效運用。
[0004]谷氨酰胺:6_磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶(Gfa)又稱6_磷酸葡萄糖胺合成酶(Glm);它是一種胞內(nèi)酶，催化底物谷氨酰胺和6-磷酸果糖形成6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸，即氨基己糖合成代謝途徑中的第一步反應(yīng)(Bearne SL, J Biol Chem, 1996, 271:ρ.3052-7)。Gfa 幾乎存在于每個物種和組織中，是生命`活動所必需的(Yamazaki K，et al.，Gene, 2000, 261:p.329-36 ；Smith RJ, et al., J Bacteriol，1996，178:ρ.2320-7)。Gfa 編碼基因的失活會使細胞依賴于外源葡萄糖胺的補充。
[0005]本實驗室在以前的研究中，我們首次用實驗證明葡萄糖胺合成酶基因可以是一種既適用于真菌又適用于細菌的生物安全性的篩選標記基因(Wu G，et al., PLoS One,2011.6:p.el7082)。我們敲除了大腸桿菌(Escherichia coli)的Gfa編碼基因glmS和粟裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的Gfa編碼基因gfal,構(gòu)建了兩種gfa缺失菌株，E.coli Δ glmS和S.pombe Δ gfal ;這些菌株在不添加葡萄糖胺的培養(yǎng)基中不能正常生長。當我們用帶有g(shù)lmS基因的大腸桿菌質(zhì)粒pHsh-glmS轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,含有質(zhì)粒的大腸桿菌細胞得到成功篩選。同樣，用帶有g(shù)fal的粟酒裂殖酵母質(zhì)粒pREP-AGCX轉(zhuǎn)化菌株S.pombeAgfal能夠使它重新獲得在不添加葡萄糖胺的培養(yǎng)基上生長的能力；其中，pREP-AGCX和其他所有的穿梭載體一樣:至少帶有I個用作大腸桿菌篩選標記的抗藥，如amf (氨芐青霉素抗藥基因)(Wu G, et al.，PLoS One, 2011,6:p.el7082)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]1.發(fā)明目的:
[0007]以Gfa缺失菌株為基礎(chǔ)，創(chuàng)建I個既能夠被酵母系統(tǒng)又能夠被大腸桿菌系統(tǒng)識別和轉(zhuǎn)錄表達的非抗藥性篩選標記，從而構(gòu)成I個不帶有任何抗藥基因的穿梭載體。本發(fā)明的穿梭載體由生物安全性基因構(gòu)成，從而能夠在基因重組菌株的應(yīng)用范圍方面取得突破:用該質(zhì)粒進行遺傳改造的細胞可以直接應(yīng)用于食品發(fā)酵、飼料添加、環(huán)境修復等復雜環(huán)境。
[0008]2.技術(shù)關(guān)鍵:
[0009]將粟酒裂殖酵母基因gfal (Sp-gfa)用著酵母-大腸桿菌穿梭載體中的篩選標記，對Sp-gfa上游的轉(zhuǎn)錄表達元件進行重新設(shè)計和改造,使穿梭載體中的Sp-gfa在大腸桿菌和粟酒裂殖酵母都具有篩選標記功能，不再使用抗生素篩選，達到構(gòu)建生物安全性穿梭載體的目的。
[0010]3.技術(shù)方案:
[0011](1)利用生物信息學軟件分析粟酒裂殖酵母gfal基因的啟動子和終止信號序列區(qū)，并將含有自身啟動子和終止信號序列的gfal基因插入到一個原核載體PHsh中。
[0012](2)在pHsh-Sp-gfa中，刪除gfa基因中的內(nèi)含子序列，并人工改造gfa基因的終止密碼子下游序列，形成可以在大腸桿菌中使用的終止子序列。
[0013](3)在優(yōu)化過的pHsh-Sp-gfa載體基礎(chǔ)上，人工設(shè)計改造gfa基因的啟動子序列，加入大腸桿菌的σ 70啟動子核心序列和核糖體結(jié)合位點SD序列，并轉(zhuǎn)化Ε.coli Δ glmS。
[0014](4)將經(jīng)過改造的可在大腸桿菌中發(fā)揮篩選功能的gfa基因序列插入到pREP3X中，并刪除載體中的Ieu和amp篩選標記基因序列,構(gòu)建成新型穿梭載體pGFA(圖1)。
[0015](5)驗證改造后的穿梭載體在gfa缺失型菌株S.pombe Δ gfal和E.coli Δ glmS中的轉(zhuǎn)化和選擇功能。
[0016](6)新型穿梭載體pGFA克隆外源基因在裂殖酵母中進行表達試驗。
[0017]4.本發(fā)明可取得的有益效果:
[0018](I)本發(fā)明產(chǎn)生的質(zhì)粒pGFA是一個生物安全性的轉(zhuǎn)基因載體。這是生物工程領(lǐng)域第I個成功剔除抗生素篩選標記基因的新型穿梭載體，質(zhì)粒的基本元件僅包含質(zhì)粒復制元件和gfa篩選標記，前者廣泛存在于自然界而后者是各種生物都具有的必需基因。
[0019](2) pGFA所使用的非抗藥基因篩選標記能夠有效地維持篩選壓力，從而有效防止重組基因的丟失。
[0020](3) pGFA的篩選作用不依賴于抗菌素或其他化學品的添加，也不受自然環(huán)境或發(fā)酵原料中的糖、氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)成分的影響。
[0021](4)在pGFA中，不同宿主共用同一個篩選標記，質(zhì)粒的分子得到充分精簡，外源目標基因的容量進一步擴大，基因轉(zhuǎn)化率得到提聞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1.本發(fā)明的穿梭載體pGFA(B)與通用穿梭載體㈧的結(jié)構(gòu)圖比較。
[0023]圖2.篩選標記gfa基因的起始密碼子上游序列人工設(shè)計改造前后比較。
[0024]圖3.載體 pGFA 轉(zhuǎn)化 E.coli Δ glmS(A,B)和 S.pombe Δ gfal 的互補驗證(C,D):在不補充葡萄糖胺的培養(yǎng)基上，只有帶有PGFA的菌株才能生長(B，D)。
[0025]圖4.運用載體pGFA克隆木聚糖酶基因，使無抗藥基因酵母重組菌分泌木聚糖酶?！揪唧w實施方式】:
[0026]本發(fā)明中所用術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面的方法結(jié)合具體實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細的描述本發(fā)明。應(yīng)理解實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0027]1.所用材料與常規(guī)技術(shù)
[0028](I)菌株及質(zhì)粒:
[0029]敲除粟酒裂殖酵母S.pombe YHL6381 菌株(h+，his3_Dl，leul-32，ura4_D18，ade6_M210)中的gfal基因構(gòu)獲得gfa缺失型菌株S.pombe Δ gfal,敲除E.coli K12菌株中的glmS基因獲得gfa缺失型菌株E.coli Λ glmS，具體方法參見Wu G，et al.(PLoS One,2011,6:p.el7082)。本研究中還用到 E.coli DH10B 菌株以及質(zhì)粒 pREP3X(MaundrelI，K.1993, Gene 123:127-130), pHsh-Amp(Wu H, et al.,2010, Biotechnol Lett,32:795-801)。
[0030](2)感受態(tài)細胞的制備及基因轉(zhuǎn)化方法:
[0031]菌株E.coli AglmS在含有5mM鹽酸葡萄糖胺(購自Sigma公司，貨號G4875)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37°C )，并按照標準大腸桿菌感受態(tài)制備方法制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。采用電穿孔系統(tǒng)(Bio-rad Gene Pulser Xcell?)并按其操作要求進行大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化。粟酒裂殖酵母菌株S.pombe Δ gfal在含有IOmM鹽酸葡萄糖胺的YES培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照標準醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法進行基因轉(zhuǎn)化。本研究中所使用的酵母培養(yǎng)基YES和EMM中均添加了終濃度為225mg/l的組氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和尿嘧啶。
[0032](3)其他常規(guī)DNA操作方法:
[0033]實驗中所使用的T4 DNA連接酶購自NEB公司，PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、PrimeSTAR? max DNA聚合酶、DNA分子量Marker等常規(guī)試劑均購自大連Takara生物公司，DNA片段割膠回收中所用QG、PE試劑購自Qiagen公司。PCR反應(yīng)和DNA片段連接反應(yīng)均按照相應(yīng)說明書要求操作。根據(jù)E.Z.N.A.?Yeast Plasmid Mini Kit試劑盒操作說明，提取酵母質(zhì)粒。基因序列的測定由上海美吉生物公司完成。
[0034]2.在酵母gfa基因及其表達元件中植入大腸桿菌基因表達元件
[0035](I)基因克隆:根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)中的GeneID:2539622基因數(shù)據(jù)，設(shè)計引物(SEQID N0.1和N0.2)從粟酒裂殖酵母基因組中擴增gfal基因及其自身帶有的啟動子和終止信號序列。得到的PCR產(chǎn)物長度為2，718bp，其堿基序列列表于SEQ ID N0.3，定名為Sp-gfa。設(shè)計引物SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5擴增大腸桿菌表達載體pHsh-Amp的線性片段，將它與Sp-gfa連接構(gòu)建成大腸桿菌表達質(zhì)粒pHsh-Sp-gfa。由于Sp-gfa插入pHsh_Amp質(zhì)粒中的amp基因序列與復制元件序列之間,保證Sp-gfa的表達不受pHsh_Amp自身啟動子的影響。
[0036](2)終止子和內(nèi)含子:帶有自身啟動子的酵母基因gfal在大腸桿菌中不能夠表達，需要經(jīng)過添加大腸桿菌的終止子、啟動子，并去除內(nèi)含子。我們在gfal基因編碼框的下游區(qū)設(shè)計加入不依賴P因子的終止子序列，采用反向PCR方法，以構(gòu)建得到的pHsh-SpGfa質(zhì)粒為模板，用引物SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7擴增，得到的PCR片段，磷酸化處理后，進行連接反應(yīng)得到質(zhì)粒pHsh-Sp-gfa-term。在gfal基因中發(fā)現(xiàn)兩個緊鄰的內(nèi)含子,我們通過一步反向PCR的方法將其去除，所用引物序列見SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9，所得到的質(zhì)粒命名為 pHsh-Sp-gfa-Δ intron。
[0037](3)啟動子和核糖體結(jié)合位點:為了保證gfal基因在大腸桿菌中的各個生長時期都能表達，所以我們將其設(shè)計在組成型啟動子的控制下。因此，我們采用反向PCR的方法，在gfal基因的上游序列區(qū)中設(shè)計引物插入σ 7°類型啟動子的核心序列-10區(qū)(5，-ΤΑΤΑΑΤ-3，)和-35 區(qū)(5，-TTGACA-3’ )，所用引物序列為 SEQ ID N0.10 和 SEQ IDN0.11，得到的質(zhì)粒命名為pHsh-Sp-gfa-σ 70。
[0038]在大腸桿菌中，目的基因的表達除了有啟動子核心序列元件外，還要有核糖體結(jié)合位點SD序列，以便在翻譯過程中使核糖體能正確結(jié)合到轉(zhuǎn)錄合成的mRNA上。采用反向PCR方法，將大腸桿菌基因dmsC的核糖體結(jié)合位點序列加入到pHsh-Sp-gfa- σ 70中的gfal基因的前面，所用引物為SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13。測序正確的質(zhì)粒命名為pHsh-Sp-gfa-Ec，啟動子序列改造前后比較見圖2。經(jīng)人工改造后的的gfal基因及表達元件序列見SEQ ID N0.14。
[0039](4)篩選標記功能驗證:我們用pHsh-Sp-gfa-Ec轉(zhuǎn)化E.coli Δ glmS,結(jié)果顯示gfa缺失型大腸桿菌的轉(zhuǎn)化子獲得了在不添加葡萄糖胺的培養(yǎng)基上生長的能力，證明一個酵母-大腸桿菌共用型的非抗藥基因篩選標記Sp-gfa-Ec已經(jīng)構(gòu)建成功。
[0040]3.新型穿梭載體pGFA的構(gòu)建
[0041](I)質(zhì)粒PREP3X中酵母篩選標記的替換
[0042]通用型穿梭載體pREP3X中的篩選標記基因是leu,適用于氨基酸Leucine營養(yǎng)缺陷型酵母菌株，但是在含有 酵母粉或蛋白胨的培養(yǎng)基中無選擇壓力。我們?yōu)榱艘詆fa篩選標記替換leu，我們用引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2從質(zhì)粒pHsh-Sp-gfa-Ec中擴增出Sp-gfa-Ec ;用引物SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16從穿梭載體pREP3X中擴增出刪除了 Ieu的線性載體片段，將其與Sp-gfa-Ec片段連接后,獲得穿梭載體pRep-Sp-gfa-Ec。
[0043](2)抗藥基因amp的刪除
[0044]Sp-gfa-Ec在大腸桿菌E.coli Δ glmS中已經(jīng)具備篩選標記基因的功能，所以，我們除去質(zhì)粒pRep-Sp-gfa-Ec中的篩選標記amp,建立無抗藥基因穿梭載體pGFA。用引物SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18，以質(zhì)粒pR印-Sp-gfa-Ec為模板進行反向PCR擴增。對PCR產(chǎn)物進行磷酸化處理后，用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli Δ glmS感受態(tài)細胞，在無抗生素的LB固體培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得的質(zhì)粒被命名為pGFA-nmt。
[0045](3) nmt啟動子的替換:
[0046]在穿梭載體pGFA-nmt中位于多克隆位點上游控制外源基因表達的啟動子是裂殖酵母nmt基因的啟動子；nmt啟動子的啟動轉(zhuǎn)錄功能受到酵母粉中的營養(yǎng)成分的抑制，因此，本發(fā)明中將它替換為磷酸丙酮酸水合酶eno基因的啟動子。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中eno基因信息(SPBC1815.01)，設(shè)計引物SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.20，以酵母基因組DNA為模板擴增eno基因啟動子片段。同時，以構(gòu)建的質(zhì)粒pGFA-nmt為模板，設(shè)計引物為SEQ IDN0.21和SEQ ID N0.22，擴增載體片段。將得到的eno基因啟動子片段和載體片段進行平端連接后轉(zhuǎn)化E.coli AglmS0獲得的質(zhì)粒為eno基因啟動子替換nmt啟動子后的質(zhì)粒，被命名為pGFA，其分子大小為7007bp (圖1)，序列見SEQ ID N0.23。
[0047]用pGFA轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Δ glmS和酵母S.pombe Δ gfal,驗證其中的Sp-gfa-Ec在兩種宿主中能否發(fā)揮篩選功能，圖3顯示轉(zhuǎn)化pGFA質(zhì)粒的gfa缺失型菌株E.coli AglmS和S.pombe Λ gfal均獲得了正常生長的能力。因此，宿主菌株在不補充葡萄糖胺的自然培養(yǎng)基的生長能力依賴于穿梭載體的存在，換言之，PGFA是一個無抗藥基因而穩(wěn)定有效的生物安全性穿梭載體。
[0048]4.新型穿梭載體pGFA應(yīng)用實例:
[0049]實例1.用pGFA構(gòu)建產(chǎn)生木聚糖酶的裂殖酵母
[0050]為了檢驗構(gòu)建的質(zhì)粒pGFA的實用效果，以本實驗室之前構(gòu)建的質(zhì)粒pREP-AGCX為模板(Wu H, et al.，2010，Biotechnol Lett，32:795-801)，設(shè)計引物 SEQ ID N0.24 和SEQ ID N0.25，得到分泌信號肽cpy和木聚糖酶XynA融合的片段序列，并將個PCR片段割膠回收和磷酸化處理。以PGFA為模板，設(shè)計引物SEQ ID N0.26和SEQ ID N0.27，擴增載體序列。通過平端克隆方式將兩片段連接到一起，并轉(zhuǎn)化E.coli Λ glmS，得到的質(zhì)粒命名為pGFA-CX。將質(zhì)粒pGFA-CX轉(zhuǎn)化S.pombe Δ gfal感受態(tài)細胞，在YES培養(yǎng)基上篩選。挑取裂殖酵母轉(zhuǎn)化子到EMM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后使用蛋白濃縮柱濃縮胞外分泌蛋白，并取相當于胞外培養(yǎng)液Iml的樣品量進行SDS-PAGE電泳分析。木聚糖酶XynA的大小為23kD左右，結(jié)果如圖4所示，在轉(zhuǎn)化pGFA-CX的酵母培養(yǎng)液中在23kD處有明顯的目的蛋白條帶。木聚糖酶活性的測定是以0.5%燕麥木聚糖為底物，利用對羥基苯甲酸酰肼與水解反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖的顯色反應(yīng)進行比色，410nm下測定其吸收值(Lever M, Anal Biochem,1972,47:273-279.)。在EMM培養(yǎng)液中測得分泌表達的木聚糖酶活最高可達30U/ml。
[0051]實例2.用pGFA構(gòu)建具有降低膽固醇能力的裂殖酵母
[0052]根據(jù)Gene Bank數(shù)據(jù)庫中來源于Streptomyces clavuligerus的膽固醇氧化酶信息(NZ_CM000913.1)設(shè)計引物SEQ ID N0.28和SEQ ID N0.29擴增膽固醇氧化酶基因片段，得到的PCR產(chǎn)物割膠并磷酸化處理。以pGFA為模板，設(shè)計引物SEQ ID N0.26和SEQID N0.27，擴增載體序列片段。將載體序列與磷酸化的膽固醇氧化酶基因片段平端連接，并電轉(zhuǎn)化E.coli Δ glmS,在無抗性LB培養(yǎng)基上篩選。挑轉(zhuǎn)化子測序，正向插入的質(zhì)粒命名為pGFA-Clo。將質(zhì)粒pGFA-Clo轉(zhuǎn)化S.pombe Δ gfal感受態(tài)細胞，在YES培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子在EMM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。收集培養(yǎng)的5ml酵母細胞，在5000rpm離心lOmin，用150 μ I的PBS緩沖液重懸細胞，并加入0.1mm的酸洗玻璃珠震蕩破碎酵母細胞。將破碎的細胞混合液在12000rpm下高速離心以去除細胞殘留，取上清液進行酶活分析(季文明，陳毅力，食品與生物技術(shù)，2000,19 (3) =251-254)，檢測到明顯酶活。
【權(quán)利要求】
1.一種新型酵母-大腸桿菌穿梭載體，其基本特征在于不含有任何用作篩選標記的抗藥基因。
2.一種穿梭載體，其特征在于只帶有I個能夠被不同的宿主細胞共同使用的非抗藥性篩選標記基因。
3.一種穿梭載體，其特征在于控制外源基因表達的啟動子是來源于酵母菌eno基因的強啟動子。
4.如權(quán)利要求2所述的穿梭載體中的篩選標記，其特征在于是由人工設(shè)計和合成的、能夠被酵母和細菌共用的谷氨酰胺:6_磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶的基因表達盒，其組合元件依次為:酵母啟動子、大腸桿菌啟動子、核糖體結(jié)合位點、開放閱讀框、大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止子、酵母轉(zhuǎn)錄終止信號序列。
5.一種大腸桿菌載體pHsh-Sp-gfa-Ec其特征在于帶有如權(quán)利要求4所述的谷氨酰胺:6-磷 酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶的基因表達盒。
6.如權(quán)利要求4和權(quán)利要求5所述的谷氨酰胺:6_磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶的基因表達盒，其堿基序列與pHsh-Sp-gfa-Ec中的Sp-gfa-Ec序列(SEQ ID N0.14)的同源性高于80%。
【文檔編號】C12N15/54GK103757048SQ201310191146
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】邵蔚藍, 王洪成 申請人:仙奕生物科技（南京）有限公司